腸桿菌發(fā)酵對(duì)煙草浸膏化學(xué)成分及卷煙品質(zhì)的影響

葉建斌 齊曉娜 楊宗燦 張婷婷 馮穎杰

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450000)

煙草浸膏是卷煙重要的香料，可以改善煙草吸食品質(zhì)[1-2]。目前用于煙草浸膏提取的方法有溶劑萃取[3]、分子蒸餾[4]、亞臨界萃取[5]及超臨界萃取[6]等物理化學(xué)方法，利用生物酶或微生物發(fā)酵等生物技術(shù)制備煙草浸膏的研究報(bào)道也越來(lái)越多[7-10]。由于物理或化學(xué)法獲得的煙草浸膏存在煙葉原料制約、操作過(guò)程復(fù)雜或有機(jī)溶劑使用過(guò)度等缺點(diǎn)，因此在推廣應(yīng)用上還受到一定的限制。生物酶法，由于酶制備的成本較高，限制了其在煙草浸膏制備中的推廣應(yīng)用。而微生物發(fā)酵法，反應(yīng)條件溫和，可以有效利用浸提液中一些大分子物質(zhì)作為碳源或氮源，在生成香味物質(zhì)的同時(shí)可以減少雜氣，合成的香料味道更接近煙草本香。一些基于生物發(fā)酵的合成香料在卷煙加香中表現(xiàn)出了良好的效果。王娜等[11]曾采用產(chǎn)香酵母菌處理煙葉碎片，通過(guò)對(duì)發(fā)酵工藝優(yōu)化，制備獲得了一種煙草浸膏，但發(fā)酵時(shí)間達(dá)到14 d。

受限于細(xì)菌對(duì)高糖濃度不耐受以及對(duì)煙堿等煙草特征物質(zhì)的敏感性，利用細(xì)菌發(fā)酵制備特征性煙草浸膏的報(bào)道目前還較少。因此，如何獲得可耐受高濃度糖和煙堿的細(xì)菌是制備具有特征香味煙草浸膏的關(guān)鍵之一。實(shí)驗(yàn)室[12]前期從煙草表面分離獲得了一株腸桿菌，經(jīng)過(guò)高濃度糖和煙堿的煙草濃縮液馴化后，該菌能在煙草浸提液中降解煙草大分子物質(zhì)并產(chǎn)生特征性的香味物質(zhì)。研究擬利用該微生物對(duì)煙草浸提液進(jìn)行發(fā)酵，考察該微生物發(fā)酵對(duì)煙草浸提液中大分子物質(zhì)、氨基酸等化學(xué)成分的影響，并分析發(fā)酵后制得煙草浸膏中的香味成分及其應(yīng)用于卷煙后對(duì)煙氣香味成分的影響，以期制備一種特色的甜香型煙草浸膏。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

腸桿菌：實(shí)驗(yàn)室保存；

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，去離子水定容至1 L，pH 7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.2 煙末、煙絲、卷煙

煙末、煙絲：黃金葉生產(chǎn)制造中心；

參比卷煙：紅旗渠品牌，黃金葉生產(chǎn)制造中心。

1.1.3 試劑

二氯甲烷：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

乙酸苯乙酯：標(biāo)準(zhǔn)品，北京百靈威科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

磷酸氫二鈉：分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；

無(wú)水硫酸鈉：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙酸、聚乙氧基月桂醚、酒石酸鉀鈉、硫酸鉀、水楊酸鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 儀器

連續(xù)流動(dòng)分析儀：AutoAnalyzer3型，德國(guó)布朗盧比公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：6890-5973型，美國(guó)Agilent公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：EYELA(N-1100)型，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；

高效液相色譜儀：1260 Infinity ELSD型，安捷倫科技有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SHP-150型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

紫外—可見(jiàn)分光光計(jì)：UV-2300型，北京普析通用有限責(zé)任公司；

超聲波清洗機(jī)：SB25-12D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：YM50-Z型，濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司；

高速離心機(jī)：Hicen FR型，德國(guó)英雄實(shí)驗(yàn)儀器公司；

恒溫恒濕箱：KBF240型，德國(guó)Binder公司；

20孔道吸煙機(jī)：RM20HRM20H型，德國(guó)BORGWALDT-KC公司。

1.2 方法

1.2.1 腸桿菌種子制備 將腸桿菌菌株的單菌落接種到5 mL種子液培養(yǎng)基中，置于30 ℃，150 r/min的搖床進(jìn)行培養(yǎng)，反應(yīng)至菌液OD600 nm值為2.0～2.5時(shí)，得到種子液，用于后續(xù)發(fā)酵。

1.2.2 煙草浸膏制備 煙絲按固液比(m煙絲∶V水)1∶10 (g/mL) 于55 ℃下浸提2 h，過(guò)濾，取煙草浸提液，115 ℃ 滅菌20 min，按體積分?jǐn)?shù)2%將腸桿菌種子液接種到煙草浸提液中，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)3 d，獲得發(fā)酵浸提液，6 000 r/min 離心10 min，上清液于70 ℃真空濃縮至密度為(1.200±0.005) g/cm，加入90%乙醇后于-20 ℃沉降24 h，6 000 r/min離心10 min，取上清液，45 ℃下真空濃縮至密度為(1.200±0.005) g/cm，得煙草浸膏。

1.2.3 化學(xué)成分分析

(1) 蛋白質(zhì)含量：按YC/T 249—2008《煙草及煙草制品 蛋白質(zhì)的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》執(zhí)行。

(2) 淀粉含量：按YC/T 216—2007《煙草及煙草制品 淀粉的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》執(zhí)行。

(3) 果膠含量：按YC/T 346—2010《煙草及煙草制品 果膠的測(cè)定 離子色譜法》執(zhí)行。

(4) 總糖含量：按YC/T 159—2002《煙草及煙草制品 水溶性糖的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》執(zhí)行。

(5) 還原糖含量：按YC/T 159—2002《煙草及煙草制品 水溶性糖的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》執(zhí)行。

(6) 總植物堿含量：按YC/T 160—2002《煙草及煙草制品 總植物堿的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》執(zhí)行。

(7) 氨基酸含量：按YC/T 282—2009《煙葉 游離氨基酸的測(cè)定 氨基酸分析儀法》執(zhí)行。

1.2.4 香味成分分析

(1) 前處理：取1 g發(fā)酵后的煙草浸膏加入10 mL二氯甲烷中，并加入一定濃度的乙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)，常溫震蕩混合1 h，靜置后倒入分液漏斗，取有機(jī)相。重復(fù)萃取5次，合并有機(jī)相，在水浴溫度為55 ℃、體系壓力為18.0 kPa下旋蒸濃縮至體積為1 mL。

(2) GC-MS分析條件：采用DB-5MS(50 m×0.25 mm×0.25 μm)柱；進(jìn)樣溫度250 ℃；分流比5∶1；延遲5 min；載氣(He)流速1 mL/min；升溫程序：50 ℃保持1 min，以5 ℃/min 升至250 ℃保持5 min；傳輸線(xiàn)溫度270 ℃；EI離子源；電子能量70 eV；掃描范圍35～600 amu。NIST11譜庫(kù)進(jìn)行檢索，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜峰面積確定香味成分，以乙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析，根據(jù)濃縮后體積計(jì)算各香味成分在煙草浸膏中的含量。

1.2.5 煙氣香味物質(zhì)分析 卷煙煙氣粒相組分的種類(lèi)和結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，其中主要香味物質(zhì)包括萜類(lèi)化合物、羰基化合物(醛、酮類(lèi)化合物)、氮雜環(huán)化合物、酚類(lèi)化合物、有機(jī)酸等[13-14]。參比卷煙為黃金葉(硬紅旗渠)未加香加料卷煙(T0)，加入未經(jīng)發(fā)酵煙草浸膏(其余步驟和條件與腸桿菌發(fā)酵后的煙草浸膏的制備方法完全相同)的卷煙作為對(duì)照(T1)，加入發(fā)酵煙草浸膏的卷煙為試驗(yàn)組(T2)。煙草浸膏添加量為300 mg/kg(按照卷煙煙絲重量0.6 g)，煙草浸膏添加完成后于溫度22 ℃、濕度65%環(huán)境中平衡48 h。

平衡水分之后取出，用吸煙機(jī)進(jìn)行抽吸。卷煙抽吸完畢后，迅速取出劍橋?yàn)V片，放入錐形瓶中，加入50 mL萃取溶劑(以乙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)，濃度為1.032 mg/mL)，搖勻，常溫超聲萃取30 min(超聲功率70 W，超聲頻率40 kHz)，靜置5 min，取出上清液。再次加入50 mL萃取溶劑，重復(fù)上述萃取步驟。然后合并上清液，旋蒸濃縮至1 mL，用GC-MS進(jìn)行香味成分檢測(cè)。GC-MS分析條件同1.2.4。

1.2.6 感官評(píng)價(jià) 以未加任何香料的卷煙為空白(K0)，加入未經(jīng)發(fā)酵煙草浸膏的卷煙作為對(duì)照(K1)，加入發(fā)酵煙草浸膏的卷煙為試驗(yàn)組(K2)。煙草浸膏添加量為50 mg/kg，與煙絲混勻后于溫度22 ℃、濕度65%環(huán)境中平衡48 h，卷制成卷煙，經(jīng)由7人組成的專(zhuān)業(yè)評(píng)吸小組對(duì)添加效果進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提液大分子物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中的變化

發(fā)酵前后煙草浸提液大分子物質(zhì)含量變化見(jiàn)表1。發(fā)酵后，浸提液中大分子物質(zhì)均有所降低。其中總糖、還原糖含量與發(fā)酵前相比下降顯著，分別降低了49.51%，55.81%。蛋白質(zhì)、淀粉、半乳糖醛酸、總植物堿含量與發(fā)酵前相比均有所降低，分別降低了28.95%，19.44%，18.91%，3.71%。研究結(jié)果表明，經(jīng)腸桿菌發(fā)酵后所得到的特色煙草浸膏與未經(jīng)處理的普通煙草浸膏相比，大分子物質(zhì)含量均有所下降。雖然淀粉會(huì)部分水解為單糖，但在發(fā)酵過(guò)程中，煙草浸提液中的微生物會(huì)消耗還原糖[15]，從而導(dǎo)致總糖和還原糖濃度有大幅度的降低。半乳糖醛酸作為果膠質(zhì)的重要組成成分，在發(fā)酵過(guò)程中也有部分被水解[16]。發(fā)酵過(guò)程中，蛋白質(zhì)也會(huì)隨著微生物的生長(zhǎng)而被消耗，因此發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)一定程度的降低。

表1 發(fā)酵前后浸提液大分子物質(zhì)質(zhì)量濃度變化Table 1 Changes of mass concentration of macromolecules in the extract before and after fermentation

2.2 浸提液氨基酸含量在發(fā)酵過(guò)程中的變化

對(duì)煙草浸提液發(fā)酵前后主要氨基酸含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。浸提液發(fā)酵后，氨基酸總含量減少了37.45%，但有部分氨基酸含量增加。

脯氨酸、天冬酰胺、4-氨基丁酸、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、甘氨酸含量均降低。其中天冬酰胺含量降低最為顯著，降低了94.47%。纈氨酸、胱氨酸、精氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、賴(lài)氨酸含量均增加。其中異亮氨酸含量增加最為顯著，增加了161.26%。氨基酸總含量減少的原因可能包括：① 氨基酸與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)。比如脯氨酸與葡萄糖反應(yīng)生成1-脫氧-1-(L-脯氨?；?-D-果糖，丙氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸等與葡萄糖和果糖反應(yīng)生成其他Amadori化合物；② 煙草浸提物自身富含大量微生物，氨基酸作為微生物生長(zhǎng)代謝的主要氮源物質(zhì)，發(fā)酵過(guò)程中被微生物作為氮源消耗掉；③ 氨基酸進(jìn)一步分解變化。氨基酸脫氨基產(chǎn)生有機(jī)酸和氨，而氨可以與有機(jī)酸結(jié)合生成新的氨基酸，這也解釋了發(fā)酵后各氨基酸含量有的增加、有的減少的現(xiàn)象。

2.3 煙草浸膏香味成分分析

未發(fā)酵煙草浸膏有31種香味成分，經(jīng)腸桿菌發(fā)酵的煙草浸膏有42種香味成分。經(jīng)腸桿菌發(fā)酵后，煙草浸膏香味物質(zhì)含量由334.19 μg/g增加到486.98 μg/g(表3)。

表3 煙草浸膏發(fā)酵前后主要香味成分變化?Table 3 Changes of aroma components of tobacco extract before and after fermentation

與未發(fā)酵煙草浸膏相比，大部分醇類(lèi)和酮類(lèi)香味物質(zhì)含量都有所增加?？反肌?-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、麥芽酚、5-甲基糠醛在發(fā)酵后含量分別提高了175.00%，207.36%，194.41%，48.07%。這4種物質(zhì)是烤甜香味主要標(biāo)志性成分[17]，具有甜的焦糖樣香韻，其甜香味能與煙草香味諧和。苯甲醇、α-苯乙醇、金合歡醇含量在發(fā)酵后分別達(dá)到3.86，7.70，2.57 μg/g。苯甲醇會(huì)產(chǎn)生令人愉快的甜味芳香和果味芳香；α-苯乙醇具有蜂蜜的香氣和水果的味道；金合歡醇具有溫和新鮮青香，味道很甜。茄酮、β-大馬酮、巨豆三烯酮等煙草特征香味物質(zhì)含量都有所增加，發(fā)酵后含量分別為31.54，15.82，34.95 μg/g。茄酮具有新鮮胡蘿卜樣的香味；β-大馬酮具有濃而甜潤(rùn)的花香；巨豆三烯酮有甜潤(rùn)而又持久的煙草樣香氣和干果香氣，是煙草中重要的香味成分[18]101-110,199-200。上述香味成分含量的增加賦予了發(fā)酵浸膏一種清甜香風(fēng)味，可明顯提高其嗅香。

前期研究[19]證實(shí)腸桿菌可降解煙草葉黃素，降解產(chǎn)物是8-甲基-α-紫羅蘭酮和3-羥基-α-紫羅蘭酮，其次還有少量的3-氧化-α-紫羅蘭酮。發(fā)酵后樣品中檢測(cè)到新增8-甲基-α-紫羅蘭酮，并賦予發(fā)酵浸膏一種花香和清香感，在卷煙中應(yīng)用有望改善協(xié)調(diào)性，豐富卷煙的香氣。另外，發(fā)酵后還新增了一些酯類(lèi)和酚類(lèi)香味物質(zhì)，如：γ-丁內(nèi)酯、乙酸對(duì)甲酚酯、鄰苯二酚、4-甲氧甲基苯酚、2，5-二叔丁基苯酚。

2.4 卷煙煙氣香味成分檢測(cè)

將上述制備的不同浸膏應(yīng)用于卷煙，并對(duì)卷煙煙氣經(jīng)GC-MS分析后，比較應(yīng)用效果。煙氣中釋放量較大的香味物質(zhì)主要包括醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)以及一些其他煙草香味物質(zhì)，詳見(jiàn)表4。

由表4可知，T0(空白卷煙)、T1(添加未發(fā)酵浸膏)、T2(添加發(fā)酵浸膏)的香味物質(zhì)總含量分別為140.55，183.83，222.97 μg/g。與T0相比，T1、T2的香味物質(zhì)種類(lèi)和含量都有所增加。其中植物醇、金合歡醇、β-紫羅蘭醇、糠醇、糠醛、檸檬醛、茄酮、β-紫羅蘭酮、2,3-丁二酮、4,7,9-巨豆三烯-3-酮等醇、酮類(lèi)香味物質(zhì)在添加煙草浸膏后含量均得到了明顯提高。T2的植物醇、金合歡醇、β-紫羅蘭醇、糠醇含量分別達(dá)32.87，3.74，1.21，0.58 μg/g，含量均高于T0、T1。植物醇常作為定香劑用于煙用香精；金合歡醇和糠醇具有甜香氣息；β-紫羅蘭醇具有強(qiáng)烈的紫羅蘭香氣和甜的香味。這些香味物質(zhì)都可以增加卷煙甜香香韻，使煙氣吸味更加柔和醇厚。與T1相比，T2的糠醛、檸檬醛、β-紫羅蘭酮、2,3-丁二酮的含量分別增加了10.95%，53.07%，48.72%，55.07%。糠醛具有甜的、焦糖的香韻；檸檬醛具有強(qiáng)烈的檸檬樣香氣，有一種特有的苦甜味道；β-紫羅蘭酮具有顯著的水果香和木香香氣；2,3-丁二酮?jiǎng)t具有奶香氣息，是奶油香精的主要香料[18]162,183-202。這些特征性香味成分在煙氣中的增加與發(fā)酵浸膏中該類(lèi)香味物質(zhì)含量的增加具有一致性，證實(shí)浸膏可作為香料應(yīng)用于卷煙，能夠提高卷煙香氣的質(zhì)和量。

表4 各卷煙煙氣主要香味成分檢測(cè)結(jié)果?Table 4 Detection results of aroma substances in cigarette smoke

另外，一些酚類(lèi)物質(zhì)如苯酚、對(duì)甲酚、愈創(chuàng)木酚、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、4-乙基苯酚含量均是T2>T1>T0，這些酚類(lèi)物質(zhì)都可用于煙用香料。酯類(lèi)物質(zhì)中乙酸丁酯具有強(qiáng)烈的水果香氣，呈先辣后甜的味道，在煙草中用于增強(qiáng)水果風(fēng)味，但由于其易揮發(fā)，向煙氣的轉(zhuǎn)移率小，故含量較低。辛酸甲酯具有強(qiáng)烈的酒香、果香和甜橙香氣，且持久性好，在煙草制品中能加強(qiáng)煙香煙味的濃度，香氣與烤煙諧和[18]262,355。

總的來(lái)說(shuō)，煙草浸膏是卷煙重要的香原料，添加一定量的煙草浸膏后，卷煙煙氣的香味成分增多，主體香氣得以提高，賦予卷煙更為自然、飽滿(mǎn)的香氣量。與未發(fā)酵的煙草浸膏相比，腸桿菌發(fā)酵后得到的煙草浸膏香味物質(zhì)含量更高、甜香風(fēng)味更加明顯，在卷煙中應(yīng)用，這種甜香風(fēng)格可以轉(zhuǎn)移到煙氣中，從而顯著提高煙氣的香氣質(zhì)。

2.5 卷煙感官評(píng)價(jià)

由表5可知，加入發(fā)酵煙草浸膏的卷煙(K2)較未加煙草浸膏的卷煙(K0)和加入未發(fā)酵煙草浸膏的卷煙(K1)，雜氣減輕，潤(rùn)感提升，刺激減小，回甜、余味均有提高。同時(shí)，由于腸桿菌發(fā)酵后產(chǎn)生了一些新的香氣物質(zhì)，使得卷煙香氣的質(zhì)和量也增加明顯，能顯著改善吸味和余味，提高卷煙內(nèi)在品質(zhì)。

表5 不同處理后卷煙感官評(píng)吸結(jié)果Table 5 Average value of cigarette smoking evaluation results

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用腸桿菌發(fā)酵煙草浸提液制備了一種具有甜香風(fēng)格的優(yōu)質(zhì)煙草浸膏。通過(guò)微生物發(fā)酵煙草浸提液可以有效減少底物中的蛋白、植物堿等大分子物質(zhì)。腸桿菌本身發(fā)酵可產(chǎn)生紫羅蘭香味成分，同時(shí)發(fā)酵后浸提液中參與美拉德反應(yīng)的氨基酸種類(lèi)和含量增加會(huì)提高后續(xù)制備浸膏的香味物質(zhì)，這賦予了浸膏一種甜香風(fēng)格的特征。另外，研究證明發(fā)酵浸膏中含有甜香風(fēng)格的香味成分可以在卷煙中應(yīng)用，并通過(guò)熱轉(zhuǎn)移直接進(jìn)入卷煙煙氣中，從而提高煙氣的香氣質(zhì)和香氣量。研究雖得出了發(fā)酵前后大分子物質(zhì)和氨基酸含量的變化，但未追蹤發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，后續(xù)重點(diǎn)通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程化學(xué)成分變化進(jìn)行監(jiān)控，進(jìn)一步確定煙草浸膏物質(zhì)組成對(duì)其風(fēng)格特征的影響。