柚皮素通過抑制NF-κB信號通路減輕哮喘大鼠氣道炎癥反應(yīng)

周旋，譚志團(tuán)，任翼，陳秋麗，吳虹，虞道銳

哮喘是一種以氣道阻塞和高反應(yīng)性為特征的肺部慢性炎癥性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約有3.4億不同年齡段的哮喘患者，其中約有1.54億為兒童患者［1］，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前在我國約有2 000萬哮喘患者，發(fā)病率高達(dá)3.0%［2］。兒童哮喘患者具有遷延難愈、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，嚴(yán)重者可影響患兒的生長發(fā)育和生活質(zhì)量，甚至死亡［3］。目前藥物性防治是提高兒童哮喘患者生存質(zhì)量和生存率的重要途徑。柚皮素（Naringenin）是一種二氫黃酮類的單體化合物，主要存在于蕓香科植物中，如葡萄柚、西紅柿、葡萄以及柑橘類等，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂肪、抗衰老等多種生物學(xué)作用［4］。雖然既往有文獻(xiàn)表明柚皮素有一定的抗哮喘作用［5］，但是其抑制哮喘炎癥反應(yīng)的藥效作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

核因子κB（NF-κB）是一種多效性轉(zhuǎn)錄因子，已發(fā)現(xiàn)其在哮喘模型和哮喘患者發(fā)病過程中具有誘導(dǎo)作用［6］。有研究表明NF-κB調(diào)控輔助性T2（Th2）細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-4、IL-5等與哮喘的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，并且由NF-κB調(diào)控的細(xì)胞因子也能促進(jìn)NF-κB在哮喘患者肺部中的表達(dá)，加重哮喘的氣道炎癥反應(yīng)［7］。另外，NF-κB的激活也與氣道組織重塑，即氣道周圍組織纖維化、平滑肌細(xì)胞增生及肥大、黏液生成等有著密切聯(lián)系［8］。本研究擬用卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）誘導(dǎo)建立哮喘大鼠模型，探討柚皮素對哮喘大鼠氣道炎癥反應(yīng)的影響，并驗(yàn)證其作用機(jī)制是否與抑制NF-κB信號通路有關(guān)，為兒童哮喘的藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 柚皮素購自上海麥克林生化科技有限公司，純度≥98%；Sprague-Dawley（SD）大鼠購自上海斯萊克有限公司；OVA、吉姆薩（Giemsa）染色液、蘇木精、伊紅購于美國Sigma公司，氫氧化鋁凝膠溶液購于Thermo公司；抗NF-κB p65、抗NF-κB p50、抗NF-κB抑制蛋白α（IκBα）及β-Actin單克隆兔抗人抗體（細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）和單克隆兔抗鼠抗體（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）購于英國Abcam公司；山羊抗兔或者山羊抗鼠二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自美國Minneapolis公司；RNA提取試劑盒購自Generay公司；PCR試劑盒購自Vazyme公司；A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、雙抗購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、ECL發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。RT-PCR儀為CFX connect Real-Time PCR System；顯微鏡BX43型（OLYMPUS公司）；電泳系統(tǒng)為Mini-Proten Tetra System（Bio-Rad公司）；凝膠成像儀為ChemiDocXRS+System（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 OVA哮喘大鼠模型及實(shí)驗(yàn)分組 取SD大鼠22只，體質(zhì)量160~180 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法取5只為正常對照組，將余下17只哮喘大鼠造模，第1天和第8天大鼠腹腔注射10 mg OVA和100 mg氫氧化鋁凝膠，第14天開始用2%的OVA溶液霧化激發(fā)，每日1次，每次30 min，連續(xù)10 d。分別在霧化第7天和第10天各取1只進(jìn)行模型驗(yàn)證，剩下15只采用隨機(jī)數(shù)字表法分為哮喘模型組、柚皮素100 mg/kg組和柚皮素200 mg/kg組，每組5只。柚皮素組連續(xù)灌胃柚皮素7 d，哮喘模型組給予同體積的生理鹽水。所有大鼠飼喂標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物飼料和滅菌二級超純水，攝食環(huán)境為明暗12 h循環(huán)，溫度22~25℃，濕度40%~70%，實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)7 d。

1.2.2 Giemsa染色對支氣管肺泡灌洗液（BALF）炎性細(xì)胞分類及計(jì)數(shù) 給藥結(jié)束后第2天，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉脫頸處死哮喘大鼠。留置導(dǎo)管至哮喘大鼠右肺，并固定，用預(yù)冷的PBS灌洗右肺3次，1 mL/次，取新鮮肺灌洗液樣本共2.4 mL，于4℃1 500 r/min離心10 min，棄上清液，100μL pH=7.4的PBS重懸細(xì)胞沉淀，取0.1μL重懸液滴于載玻片上，常溫晾干，制成涂片，甲醇固定10 min，將涂片浸入Giemsa染液中常溫染色20 s，純凈水洗1 min，將切片浸入1%醋酸溶液分化數(shù)秒，純凈水清洗，顯微鏡下鏡檢并計(jì)數(shù)。

1.2.3 肺組織病理學(xué)觀察和免疫組化染色 取左肺下葉于4%甲醛溶液中固定5 d，修整組織為適當(dāng)?shù)男螤罴昂穸龋荻纫掖歼M(jìn)行脫水處理，二甲苯透明、浸蠟、包埋，切片厚度為4μm，切片放入65℃恒溫箱中6~12 h，常溫保存。（1）HE染色：二甲苯和乙醇脫蠟復(fù)水；將切片浸入蘇木精染液中常溫染色5 min，自來水洗1 min；將切片浸入1%鹽酸乙醇溶液10 s，純凈水清洗至組織返藍(lán)；將切片浸入伊紅染液中染色5 min，純凈水洗去玻片上的浮色；無水乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。（2）免疫組化：二甲苯和乙醇脫蠟復(fù)水；3%H2O237℃孵育15 min阻斷、滅活內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗3次；置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）中水煮10 min修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次；滴加NF-κB p65和NF-κB p50一抗置4℃冰箱孵育過夜，轉(zhuǎn)至室溫平衡30 min，PBS沖洗；滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；DAB反應(yīng)染色，顯微鏡下觀察反應(yīng)進(jìn)度，純凈水清洗，蘇木素復(fù)染，干燥，封片，拍照。

1.2.4 ELISA檢測Th2和NF-κB細(xì)胞因子的含量 取大鼠新鮮BALF，按ELISA試劑盒說明書檢測BALF中IL-4、IL-5和IL-15的含量。取下腔靜脈血，室溫靜置2 h后，在4℃下以3 000 r/min離心10 min以收集血清，按照ELISA試劑盒說明 書 檢測 血 清 中NF-κB p65、NF-κB p50、IκBα的含量。

1.2.5 qPCR檢測NF-κB相關(guān)基因mRNA表達(dá) Trizol-離心柱法提取左肺上葉總RNA并進(jìn)行純度測定和定量；按5×HiScript?ⅡqRTSuperMix 4μL、總RNA（≤1 000 ng）6μL、RNase Free dH2O補(bǔ)齊至20μL配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系；50℃干浴15 min；85℃2 min終止反應(yīng)；-20℃保存cDNA。引物序列：內(nèi)參U6上游5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'；NF-κB p65上游5'-AGGATTTCGATTCCGCTACG-3'，下游5'-CTCACAGTGCTT?GCCCACC-3'；NF-κB p50上 游5'-GGCAGCACTCCTTAT?CAACC-3'，下游5'-GAGGTATCGTCCCATCGTAG-3'；IκBα上游5'-TGACCATGGAAGTGATTGGTCAG-3'，下游5'-GAT?CACAGCCAAGTGGAGTGGA-3'。qPCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10μL，上、下游引物各0.6μL，cDNA（稀釋至一致水平）8.8μL。qPCR反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃10 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，熔解曲線70~95℃。PCR反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值，利用軟件Opticon Monitor進(jìn)行分析，采用2–ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞炎癥模型建立 A549細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)60%左右時(shí)，用0.25%Trypsin-EDTA消化傳代。脂多糖（LPS）誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型：選對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，接種在6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，用LPS（100μg/L）刺激細(xì)胞6 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、LPS組、LPS+柚皮素20μmol/L組、LPS+柚皮素40μmol/L組。

1.2.7 免疫熒光檢測NF-κB相關(guān)蛋白的表達(dá) 按1.2.6條件處理細(xì)胞后用PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗，0.1%Triton100室溫破裂細(xì)胞膜20 min，PBS清洗3次，1%FBS室溫封閉30 min，PBS清洗，加入NF-κB p65、NF-κB p50、IκBα單克隆抗體（1∶1 000），4℃過夜，PBS清洗3次，按1∶1 000加入二抗，4℃避光孵育2 h，PBS清洗3次，加入濃度為10μg/L的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核，4℃避光孵育20 min，PBS清洗3次；熒光倒置顯微鏡拍照。

1.2.8 Western blot檢測NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá) 按1.2.6條件處理并收集細(xì)胞，用RAPI裂解液裂解細(xì)胞，在4℃下14 000 r/min低溫離心30 min，收集上清液作為總蛋白。使用BCA蛋白測定試劑盒測定樣本中蛋白濃度。10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗3次。分別與NF-κB p65、NF-κB p50、IκBα（1∶1 000）、β-actin單克隆抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，與IgG（1∶2 000）二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，凝膠圖像采集及分析，Image J軟件分析條帶相應(yīng)的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柚皮素減少哮喘大鼠肺部炎性細(xì)胞浸潤 結(jié)果顯示，與正常對照組比，哮喘模型組、柚皮素100 mg/kg組和200 mg/kg組的炎性細(xì)胞總數(shù)、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及哮喘模型組、柚皮素100 mg/kg組淋巴細(xì)胞數(shù)均升高（P＜0.05）；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組炎性細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞降低，柚皮素200 mg/kg組炎性細(xì)胞總數(shù)、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞數(shù)均降低（均P＜0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of the number of inflammatory cells in BALF between the four groups表1 各組BALF中炎性細(xì)胞數(shù)比較（n=5，×104個(gè)/mL，±s）

Tab.1 Comparison of the number of inflammatory cells in BALF between the four groups表1 各組BALF中炎性細(xì)胞數(shù)比較（n=5，×104個(gè)/mL，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與哮喘模型組比較，P＜0.05；表2~4同

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2.2 柚皮素減輕哮喘大鼠肺組織和支氣管炎癥反應(yīng) HE染色顯示正常對照組大鼠的肺組織和氣管結(jié)構(gòu)未見明顯異常；哮喘模型組大鼠的肺組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁明顯增厚，肺泡腔縮小甚至塌陷，部分肺泡過度擴(kuò)張；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組和柚皮素200 mg/kg組大鼠肺部炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，可見少量嗜酸性粒細(xì)胞，局部肺泡壁輕度增厚，多數(shù)肺泡結(jié)構(gòu)正常，可見少數(shù)肺泡擴(kuò)張，見圖1。哮喘模型組大鼠的支氣管可見黏膜水腫，黏膜上皮脫落，假復(fù)層結(jié)構(gòu)消失，黏膜下層組織水腫、血管充血，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組和柚皮素200 mg/kg組大鼠的支氣管炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，黏膜上皮及纖毛結(jié)構(gòu)相對正常，氣道黏膜及黏膜下層可見少許脫落，見圖1。

Fig.1 HE staining of the pathological changes of lung tissue and bronchus(×400)圖1 HE染色觀察肺組織和支氣管病理學(xué)變化（×400）

肺組織病理評分結(jié)果顯示，與正常對照組比較，哮喘模型組肺組織病理評分升高（P＜0.05）；與哮喘模型組比較，柚皮素100 mg/kg組和柚皮素200 mg/kg組的肺組織病理評分明顯降低（P＜0.05），見圖2A。氣管組織病理評分結(jié)果顯示，與正常對照組比較，哮喘模型組支氣管組織病理評分升高（P＜0.05）；與哮喘模型組相比，柚皮素100 mg/kg組支氣管組織病理評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而柚皮素200 mg/kg組出現(xiàn)降低（P＜0.05），見圖2B。

Fig.2 Comparison of pathological scores of lung tissue and bronchus of rats in each group圖2 各組大鼠肺組織和支氣管組織病理評分比較

2.3 柚皮素抑制哮喘大鼠肺部Th2細(xì)胞因子的表達(dá) 與正常對照組比較，哮喘模型組大鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13的含量升高（均P＜0.05）；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組和柚皮素200 mg/kg組大鼠肺部組織IL-4、IL-5、IL-13的含量明顯降低（均P＜0.05）。見表2。

2.4 柚皮素抑制哮喘大鼠NF-κB通路活性 ELISA結(jié)果顯示，與正常對照組相比，哮喘模型組大鼠血清NF-κB p65、NF-κB p50的含量升高，IκBα含量下降（P＜0.05）；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組NF-κB p65和NF-κB p50的含量均明顯降低（P＜0.05），柚皮素200 mg/kg組大鼠血清NF-κB p65、NF-κB p50降低，IκBα的含量升高（P＜0.05），見表3。肺部免疫組化結(jié)果顯示，大鼠哮喘模型組中NFκB p65、NF-κB p50的表達(dá)較正常對照組明顯增多，而柚皮素100 mg/kg和200 mg/kg組哮喘大鼠肺部組織NF-κB p65、NF-κB p50的表達(dá)顯著低于哮喘模型組，見圖3、4。

Tab.2 Comparison of the contents of Th2 cytokines IL-4,IL-5,and IL-13 in BALF between the four groups表2 各組BALF中Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13的含量比較 （n=5，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of the contents of Th2 cytokines IL-4,IL-5,and IL-13 in BALF between the four groups表2 各組BALF中Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13的含量比較 （n=5，ng/L，±s）

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Tab.3 Comparison of the content of NF-κB related proteins in intravenous serum of rats betweenthe four groups表3 各組大鼠靜脈血清中NF-κB相關(guān)蛋白的含量比較（n=5，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of the content of NF-κB related proteins in intravenous serum of rats betweenthe four groups表3 各組大鼠靜脈血清中NF-κB相關(guān)蛋白的含量比較（n=5，ng/L，±s）

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qPCR結(jié)果表明，與正常對照組比較，哮喘模型組大鼠肺部NF-κB p65、NF-κB p50的mRNA表達(dá)水平升高，IκBα的mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05）；與哮喘模型組比，柚皮素100 mg/kg組和200 mg/kg組哮喘大鼠肺部NF-κB p65和NF-κB p50的mRNA表達(dá)水平均下降（P＜0.05），IκBαmRNA表達(dá)水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

Fig.3 Immunohistochemical detection of lung NF-κB protein expression in asthmatic rats(×400)圖3 免疫組化檢測哮喘大鼠肺部NF-κB蛋白的表達(dá)（×400）

Fig.4 Histochemical score of relative expression of NF-κB protein in lungs of asthmatic rats圖4 哮喘大鼠肺部NF-κB蛋白相對表達(dá)的組織化學(xué)評分

Tab.4 Comparison of the expression levels of NF-κB related gene mRNA in lung tissues of rats between the four groups表4各組大鼠肺組織中NF-κB相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平比較 （n=5，±s）

Tab.4 Comparison of the expression levels of NF-κB related gene mRNA in lung tissues of rats between the four groups表4各組大鼠肺組織中NF-κB相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平比較 （n=5，±s）

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2.5 柚皮素抑制LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞NF-κB的表達(dá) Western blot結(jié)果表明，與正常對照組比，LPS組NF-κB p65、NF-κB p50蛋白表達(dá)水平升高，IκBα蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與LPS組比，LPS＋柚皮素20μmol/L組和LPS＋柚皮素40μmol/L組NF-κB p65、NF-κB p50蛋白表達(dá)水平降低，IκBα蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖5、6。免疫熒光結(jié)果表明，與正常對照組相比，A549細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后NFκB p65、NF-κB p50蛋白的表達(dá)水平升高，IκBα的表達(dá)降低；與LPS組相比，當(dāng)用20μmol/L和40μmol/L的柚皮素處理A549細(xì)胞后NF-κB p65和NF-κB p50的表達(dá)降低，而IκBα的表達(dá)升高，見圖7。

Fig.5 Expressions of NF-κB related proteins in A549 cells detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測A549細(xì)胞中NF-κB相關(guān)蛋白的表達(dá)

Fig.6 Comparison of relative expressions of NF-κB pathway related proteins between four groups圖6 各組NF-κB通路相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量比較

Fig.7 Immunofluorescence detection of NF-κB related protein expressions in A549 cells(×400)圖7 免疫熒光檢測A549細(xì)胞中NF-κB相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（×400）

3 討論

3.1 天然藥物治療哮喘的新思路 研究顯示，在我國大陸地區(qū)僅有2.5%左右哮喘兒童的癥狀得到控制，而該數(shù)據(jù)并未達(dá)到全球哮喘防治創(chuàng)議指南要求［9］。減少哮喘患兒慢性持續(xù)期和臨床緩解期的氣道慢性炎癥可降低哮喘的發(fā)作頻率［10］，慢性持續(xù)期的防治又是降低小兒哮喘發(fā)病率的重要舉措。天然單體藥具有來源廣、低毒、安全、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，是開發(fā)小兒哮喘慢性持續(xù)期治療藥物的重要方向。據(jù)報(bào)道多種天然藥物具有改善氣道炎癥的潛在作用，如黃芩苷可減輕哮喘炎癥和氣道高反應(yīng)性［11］，白花前胡甲素能改善哮喘氣道重塑［12］，表兒茶素沒食子酸酯可抑制氣道炎癥和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［13］等。本研究顯示，柚皮素可減少哮喘大鼠肺部單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，改善肺泡的生理結(jié)構(gòu)，減少黏膜上皮脫落，促進(jìn)支氣管假復(fù)層及纖毛結(jié)構(gòu)修復(fù)，與以往報(bào)道的柚皮素可減輕哮喘炎癥、改善氣道高反應(yīng)性和氣道重塑的結(jié)果一致［5］，提示柚皮素具有成為小兒哮喘防治藥物的潛力。

3.2 柚皮素抑制Th2細(xì)胞因子的作用 Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13與哮喘的發(fā)病有著密切聯(lián)系，IL-4可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，使嗜酸性粒細(xì)胞在炎癥部位聚集、浸潤，形成氣道炎癥［14］；IL-5對于嗜酸性粒細(xì)胞的分化、成熟以及在變應(yīng)原誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞氣道炎癥中起重要作用［15］；而IL-13可以促進(jìn)B細(xì)胞分化，直接導(dǎo)致氣道炎癥和氣道高反應(yīng)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-5、IL-13在哮喘模型組肺組織中高表達(dá)，而柚皮素能有效降低3種炎性因子的表達(dá)，表明其可能通過抑制Th2細(xì)胞因子的促炎作用改善哮喘炎癥反應(yīng)。

3.3 柚皮素經(jīng)NF-κB信號通路發(fā)揮抗哮喘的作用 NF-κB通路活化是哮喘發(fā)病的重要作用機(jī)制之一，當(dāng)肺或支氣管受各類因素刺激后，細(xì)胞質(zhì)的IκBα解除對NF-κB p65/NF-κB p50二聚體的抑制作用，IκBα磷酸化降解，NF-κB p65/NF-κB p50二聚體從細(xì)胞質(zhì)解離進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子的合成和釋放［17］。因此NF-κB通路有望成為哮喘治療的潛在靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)多種單體天然藥物可在哮喘大鼠靶向作用于NF-κB通路，如甘草次酸可以通過抑制NF-κB的表達(dá)，降低炎癥介質(zhì)IL-5、IL-6等的表達(dá)，改善大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)［18］；雷公藤內(nèi)酯醇可抑制IκB激酶α（IκB kinase-α，IKK-α）及p-IκB的表達(dá)，減少細(xì)胞因子和趨化因子的釋放與產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗哮喘的作用［19］。本研究顯示，在哮喘大鼠模型中NF-κB p65、NF-κB p50高表達(dá)、IκBα低表達(dá)，而柚皮素能下調(diào)NF-κB p65、NF-κB p50，上調(diào)IκBα。另外，為進(jìn)一步闡明柚皮素抑制NF-κB通路的作用，本研究利用LPS誘導(dǎo)建立A549細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)柚皮素可抑制LPS-A549細(xì)胞質(zhì)中NF-κB相關(guān)蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)IκBα的表達(dá)；同樣Yang等［20］也發(fā)現(xiàn)在中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶誘導(dǎo)的呼吸道上皮細(xì)胞炎癥模型中，柚皮素可抑制NF-κB信號通路的活性。這就提示NF-κB參與哮喘的進(jìn)程，而柚皮素可降低NF-κB信號通路的活性是其發(fā)揮防治哮喘作用的潛在機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明柚皮素具有顯著抑制哮喘大鼠肺部和支氣管炎癥反應(yīng)的作用，并在體內(nèi)外模型中證實(shí)柚皮素發(fā)揮抗炎的潛在作用機(jī)制與抑制NF-κB信號通路有關(guān)，其有望成為治療哮喘慢性持續(xù)期的藥物。雖然柚皮素對哮喘大鼠具有良好藥效作用，但其藥效的安全性及其更深、更全面的作用機(jī)制并不十分清楚，在今后的研究工作中還需更深入的探討，為哮喘的藥物治療提供理論依據(jù)。