激素抵抗型支氣管哮喘患者外周血MIB1基因甲基化的相關(guān)性研究

陳穎 冷秋平 王文藝 鄔超 希仁娜依·木哈塔爾 陳麗萍

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)中心,烏魯木齊830001

支氣管哮喘(哮喘)是一種異質(zhì)性疾病,以持續(xù)性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)及氣道重塑為特征,是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病;其具有病程復(fù)雜、易復(fù)發(fā)等特點。有文獻顯示,2010年美國估計有2 570萬人診斷哮喘[1]。而最新文獻顯示,目前全球約3.58億人患有哮喘,我國約有4 000萬哮喘患者[2]。

目前聯(lián)合使用支氣管擴張劑及吸入糖皮質(zhì)激素成為最有效的治療哮喘的方案。雖然國內(nèi)外哮喘指南推出的藥物治療可使部分哮喘患者達到最佳的控制狀態(tài),同時降低了哮喘的病死率,但仍有部分哮喘患者未能達到理想的控制。據(jù)估計有5%～10%的哮喘患者難以通過現(xiàn)有的治療方法得到疾病的良好控制[3]。這樣的患者被標(biāo)記為患有嚴(yán)重哮喘或難治性哮喘。而在難治性哮喘中,對糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)治療的反應(yīng)差或需要非常高的劑量以達到治療目的,以至于產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng),被診斷為糖皮質(zhì)激素抵抗型哮喘。臨床上把糖皮質(zhì)激素抵抗型哮喘定義為肺功能第1秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比＜75%,在給予足夠劑量的糖皮質(zhì)激素治療(40 mg/d,持續(xù)14 d)后,第1秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比的改善率＜15%[4]。

激素抵抗型哮喘患者因癥狀反復(fù)發(fā)作,難以控制,導(dǎo)致反復(fù)就醫(yī),增加患者疾病負(fù)擔(dān)的同時增加患者的醫(yī)療費用。所以對糖皮質(zhì)激素抵抗型哮喘的認(rèn)識有助于確定此類哮喘患者的特征,并有助于進一步明確其病理生理學(xué)過程,尋找可能有效的個體化治療方案,減少疾病帶來的負(fù)擔(dān)。前期我們用Illumina法對4例激素抵抗型哮喘患者、普通哮喘患者、健康體檢者進行了全基因組甲基化初篩分析,發(fā)現(xiàn)MIB1基因存在異常甲基化,故推測MIB1基因異常甲基化參與了激素抵抗型哮喘發(fā)病,本研究中我們擴大樣本以探討哮喘患者激素抵抗發(fā)生的機制,對未來的個體化治療尋找理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2017年1月至2019年1月就診于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)中心并采用《基于網(wǎng)絡(luò)平臺的多中心科研病例采集系統(tǒng)》(軟件著作權(quán)登記號:2012SR117462,著作權(quán)人:鄔超)進行管理的哮喘患者1 500例進行病例對照研究,對患者進行1年以上隨訪。選取符合激素抵抗型哮喘定義的患者20例、普通哮喘患者20例及健康體檢者20名為研究對象,所有哮喘患者符合2016年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組制訂的《支氣管哮喘防治指南(2016年版)》[5]中哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除存在風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病及其他需要使用激素治療的合并癥的人群,本研究獲新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2015072),所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。收集研究對象的一般資料,包括性別、年齡、發(fā)病年齡、病程、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙情況、血嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)、血中性粒細(xì)胞計數(shù)等。

1.2 方法 抽取所有研究對象的空腹外周靜脈血標(biāo)本,加入枸椽酸鈉抗凝劑中,放于-80℃冰箱留存待用;通過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化、PCR擴增、體外轉(zhuǎn)錄和RNase A特異性酶切和基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù),將DNA模板Cp G甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)變成RNA酶切片段的堿基差異,通過質(zhì)譜判斷相對分子質(zhì)量的差異進行區(qū)分。

1.2.1 引物設(shè)計 使用Agena公司官網(wǎng)進行設(shè)計引物,擴增片段大小為200～600 bp。在正向引物5'端加入10 mer tag,反向引物5'端加入T7-Promoter序列。

1.2.2 DNA提取 使用QIAGEN試劑盒提取DNA,DNA用分光光度計定量;并取100 ng DNA,用0.8%瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢。質(zhì)檢合格的DNA將濃度調(diào)整到75 mg/L,轉(zhuǎn)移至96孔板,-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DNA樣品亞硫酸鹽處理 采用EZ DNA Methylation Kit(ZYMO)試劑盒,嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟,實驗前的準(zhǔn)備、DNA樣品準(zhǔn)備、DNA樣品亞硫酸處理進行操作。

1.2.4 PCR擴增 采用PCR Accessory Set(Agena)試劑盒,PCR擴增的引物序列見表1。設(shè)置PCR擴增的程序如下。起始:94℃,10 min。循環(huán)1:94℃,45 s;62℃,48 s;-0.5℃冷卻;72℃,1 min(共循環(huán)10次)。循環(huán)2:94℃,45 s;57℃,48 s;72℃,1 min(共循環(huán)35次)。最后72℃,3 min;4℃存儲備用;最后PCR產(chǎn)物電泳采用2%的瓊脂糖凝膠進行,取5μl,2×Loading Buffer于電泳板里,加入1μl PCR產(chǎn)物進行電泳。

1.2.5 堿性磷酸酶處理 采用MassCLEAVE Kit:(美國Agena公司),嚴(yán)格依照說明書配制堿性磷酸酶處理體系并操作。

1.2.6 體外轉(zhuǎn)錄和RNaseA特異性酶切 采用MassCLEAVE Kit試劑盒(美國Agena公司),嚴(yán)格按照說明書操作進行。

1.2.7 芯片點樣及質(zhì)譜檢測 使用Mass ARRAY Nanodispenser RS1000點樣儀(美國Agena公司)將純化后產(chǎn)物點至384格式的SpectroCHIP(美國Agena公司)芯片上,將點制好的芯片放入Mass ARRAY Compact System(美國Agena公司)進行檢測。SpectroCHIP芯片使用MALDITOF基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù),檢測數(shù)據(jù)通過EpiTYPER軟件(美國Agena公司)分析并輸出結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,計量資料以±s表示,兩組比較采用成組設(shè)計t檢驗,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗。哮喘患者發(fā)生激素抵抗危險因素分析采用二分類Logistic回歸分析,繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)并計算曲線下面積(area under curve,AUC),AUC及其95%置信區(qū)間通過MedCalc進行評估,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 激素抵抗型哮喘組男8例,女12例,年齡(62.00±13.1)歲,年齡范圍為24～76歲;普通哮喘組男10例,女10例,年齡(60.30±13.28)歲,年齡范圍為23～77歲;正常對照組男10例,女10例,年齡(57.90±10.87)歲,年齡范圍為26～78歲。3組性別、年齡比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＞0.05),具有可比性。

2.2 MIB1基因檢測結(jié)果 檢測MIB1基因片段長度為490 bp;測得MIB1基因檢測片段的CpG位點總數(shù)3個Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3,實際檢測到的Cp G位點數(shù)3個Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3。

2.3 3組MIB1基因Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3三個位點甲基化率比較 3組MIB1基因Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3三個位點的甲基化率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.591、0.546、0.282,P值均＞0.05),見表2。

2.4 兩哮喘組臨床指標(biāo)和MIB1基因甲基化率比較 激素抵抗型哮喘組與普通哮喘組臨床指標(biāo)(發(fā)病年齡、體質(zhì)量指數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù))和MIB1基因CpG_1、CpG_2、CpG_3三個位點的甲基化率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＞0.05),見表3。

2.5 哮喘患者發(fā)生激素抵抗危險因素分析 以是否發(fā)生激素抵抗為因變量,以性別(賦值:男性=1,女性=2)、發(fā)病年齡、體質(zhì)量指數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)及Cp G位點甲基化率為自變量,進行l(wèi)ogistic回歸分析,單因素結(jié)果顯示嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)、Cp G_1甲基化率、Cp G_2甲基化率、Cp G_3甲基化率是哮喘患者發(fā)生激素抵抗的可能影響因素;將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的4個變量帶入Logistic回歸模型進行危險因素分析,結(jié)果顯示CpG_1甲基化率和CpG_3甲基化率是哮喘患者發(fā)生激素抵抗的危險因素,見表4、5。

表1 PCR擴增的引物序列

表2 3組MIB1基因Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3三個位點的甲基化率比較(%,±s)

表2 3組MIB1基因Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3三個位點的甲基化率比較(%,±s)

組別 例數(shù) Cp G_1甲基化率 CpG_2甲基化率 CpG_3甲基化率正常對照組 20 0.64±0.21 0.76±0.24 0.94±0.17激素抵抗型哮喘組 20 0.71±0.21 0.81±0.18 0.95±0.15普通哮喘組 20 0.59±0.22 0.75±0.17 0.90±0.23 F值 1.591 0.546 0.282 P值 0.213 0.582 0.756

表3 兩哮喘組臨床指標(biāo)及甲基化率比較(±s)

表3 兩哮喘組臨床指標(biāo)及甲基化率比較(±s)

組別 例數(shù) 發(fā)病年齡(歲)體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)中性粒細(xì)胞(×109/L)嗜酸粒細(xì)胞(×109/L)Cp G_1甲基化率(%)Cp G_2甲基化率(%)CpG_3甲基化率(%)激素抵抗型哮喘組 20 50.74±14.48 24.91±3.76 4.90±1.41 0.60±0.94 0.71±0.21 0.81±0.18 0.95±0.15普通哮喘組 20 47.05±16.03 25.34±4.03 4.35±2.10 0.24±0.30 0.59±0.22 0.75±0.17 0.90±0.23 t值 0.745 -0.337 0.948 1.569 1.748 1.115 0.684 P值 0.461 0.738 0.349 0.131 0.089 0.273 0.498

2.6 Cp G_1、Cp G_3位點甲基化率對哮喘患者激素抵抗影響因素的預(yù)測分析 用激素抵抗型哮喘組及普通哮喘組的Cp G_1、Cp G_3位點甲基化率數(shù)據(jù)構(gòu)建ROC曲線,計算AUC,結(jié)果顯示Cp G_1甲基化率AUC(AUC=0.734)優(yōu)于Cp G_3甲基化率AUC(AUC=0.564),兩者約登指數(shù)比較,CpG_1甲基化率(約登指數(shù)1.478)優(yōu)于Cp G_3甲基化率(約登指數(shù)1.182)考慮Cp G_1甲基化率及CpG_3甲基化率可以作為哮喘患者發(fā)生激素抵抗的預(yù)測指標(biāo),但Cp G_1甲基化率預(yù)測效能更優(yōu),見表6、圖1。

圖1 激素抵抗型哮喘組及普通哮喘組臨床特征及CpG位點甲基化率的受試者工作特征曲線

表4 影響哮喘患者激素抵抗相關(guān)因素的單因素分析

表5 影響哮喘患者發(fā)生激素抵抗的多因素分析

表6 CpG_1、CpG_3位點甲基化率預(yù)測哮喘患者激素抵抗的AUC

3 討論

隨著對哮喘認(rèn)識的深入,哮喘逐漸被認(rèn)為是一個涵蓋了多種不同表型的總稱,這些表型可能由不同的途徑介導(dǎo)[4]。而由不同機制引起的哮喘表型的臨床特征也得到了確認(rèn),特別是在那些患有嚴(yán)重哮喘的患者中,能解釋不同患者在激素治療的療效有明顯的不同。

哮喘的病理生理機制是由不同類型的分子和細(xì)胞成分通過各種動態(tài)模式的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)相互作用而形成的。涉及炎癥、細(xì)胞免疫、體液免疫、固有免疫、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和代謝的生物學(xué)過程,需要與哮喘的臨床和表型表達聯(lián)系起來。對來自基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的臨床、生理和高通量數(shù)據(jù)的分析將為單個患者提供更復(fù)雜和更準(zhǔn)確的內(nèi)型表征。此外,表觀遺傳機制如DNA甲基化、組蛋白修飾和microRNAs可以調(diào)節(jié)環(huán)境影響,如空氣污染、吸煙等,雖然不改變核苷酸序列,但也影響哮喘的發(fā)展和病程[6]。研究表觀遺傳機制也可能會找到特定患者的內(nèi)型表征,為開展個體化治療提供理論依據(jù)。

糖皮質(zhì)激素一直是控制哮喘氣道炎癥的一線藥物,但有部分患者對激素治療的反應(yīng)較差,表現(xiàn)為高劑量激素治療癥狀也不易被控制,并且病情反復(fù)出現(xiàn)急性加重。這類患者雖然只是哮喘患者中的一小部分,但對于臨床醫(yī)生來說,診斷這部分患者是較大的挑戰(zhàn),往往需要先鑒別是否有合并疾病或有無其他誘因未能去除而導(dǎo)致治療效果不佳,例如有無合并存在胃食管反流性疾病或有無過敏源的持續(xù)暴露未能去除等,或者是否有藥物使用方法及劑量的問題導(dǎo)致治療效果未達到預(yù)期,往往在排除了相關(guān)因素,并反復(fù)調(diào)整治療方案后,才能最終臨床診斷為激素抵抗型哮喘,使得這部分患者反復(fù)就醫(yī),給個人及社會造成了不成比例的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。這類患者也是哮喘治療領(lǐng)域迫切需要解決的問題。目前激素抵抗型哮喘發(fā)病機制尚未完全明確,但一些可能的機制已經(jīng)被提出,這些因素可以大致分為外部因素和內(nèi)部因素,包括了特定分子、受體、炎癥細(xì)胞或免疫過程。同一患者可能同時并存多種機制[7]。外部因素包括吸煙、氣道炎癥、氣道重塑等。內(nèi)部因素的研究分為以下5個方面。(1)糖皮質(zhì)激素受體異常:具體機制包括糖皮質(zhì)激素受體亞單位表達增加、糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)位缺陷、糖皮質(zhì)激素受體翻譯后修飾異常。(2)組蛋白去乙?；惓?組蛋白去乙?；甘茄装Y基因誘導(dǎo)的重要環(huán)節(jié),炎癥細(xì)胞中組蛋白去乙?；?活性與細(xì)胞對激素的敏感性呈正相關(guān)已被證實[8]。(3)Raf/Mek/Erk三大類蛋白激酶異常:主要由Raf/Mek/Erk3蛋白激酶組成的絲裂原活化蛋白激酶是肺部支氣管細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要傳遞者,現(xiàn)有報道Raf-1、Mek1/2、Erk1/2基因在激素抵抗型哮喘患者的氣管黏膜異常高表達[9]。(4)促炎轉(zhuǎn)錄因子表達增加:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5能夠參與糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)位及與DNA結(jié)合缺陷的發(fā)生;活化蛋白1與其他轉(zhuǎn)錄因子競爭性結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體單體,抑制糖皮質(zhì)激素受體功能;哮喘患者外周血中單個核細(xì)胞核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)表達越低,其對激素治療的敏感度越好。(5)輔助性T細(xì)胞及其細(xì)胞因子的參與:哮喘發(fā)病機制中的Th1/Th2失衡理論不能解釋激素抵抗型哮喘的病理生理過程,已有研究報道,激素抵抗型哮喘患者體內(nèi)Th17細(xì)胞分泌的IL-17水平明顯高于正常人,并且是加重其氣道炎癥的重要因素。最近的證據(jù)也表明,IL-17A過表達可能是嚴(yán)重和激素抵抗型哮喘的標(biāo)志物和危險因素[10]。

MIB1是一種貫穿表達于增殖細(xì)胞中的核抗原,參與泛素循環(huán)及Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。(1)Notch家族在胚胎發(fā)育形成、細(xì)胞分裂增殖、增生、凋亡、免疫細(xì)胞分化及其基本功能調(diào)控等方面均起到極為重要的作用,研究表明Notch信號通路對Th17細(xì)胞的發(fā)育、分化均起到極其重要的調(diào)節(jié)作用。Th17細(xì)胞是一類獨立于Th1和Th2的細(xì)胞亞群,具備獨立的分化和發(fā)育調(diào)節(jié)機制,有研究報道,Th17細(xì)胞分泌的IL-17正向調(diào)節(jié)氣道上皮糖皮質(zhì)激素受體β的表達,而糖皮質(zhì)激素受體β對哮喘患者產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素低反應(yīng)有重要作用,故我們推測MIB1基因通過Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞,從而參與激素抵抗型哮喘的病理生理[11]。(2)NF-κB是普遍存在于各組織中的炎癥轉(zhuǎn)錄因子,在免疫及炎癥反應(yīng)中起到極其重要的作用。有研究報道,干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)是發(fā)生糖皮質(zhì)激素抵抗的可能誘因,與普通哮喘患者相比,激素抵抗型哮喘患者的IFN-γ水平顯著增高,IFN-γ誘導(dǎo)基因?qū)μ瞧べ|(zhì)激素的差異敏感度源于對NF-κB信號通路的變量依賴性,糖皮質(zhì)激素敏感的IFN-γ誘導(dǎo)基因?qū)F-κB依賴性更高,同時在細(xì)胞核NF-κB的過度活化可降低糖皮質(zhì)激素應(yīng)答原件的親合力,故猜測NF-κB與IFN-γ共同參與了哮喘患者的激素抵抗[12]。Liu等[13]報道,在體外細(xì)胞實驗中,MIB1基因正向調(diào)控NF-κB的活性,并呈劑量依賴性,故我們猜測MIB1基因通過調(diào)控NF-κB的活性,從而參與激素抵抗型哮喘的病理生理。(3)近年研究顯示,在血液系統(tǒng)疾病治療反應(yīng)中,糖皮質(zhì)激素治療的耐藥機制與MIB1基因有關(guān)。王珊等[14]研究顯示MIB1基因的表達與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的生存時間呈線性相關(guān),其中位生存期與糖皮質(zhì)激素初治反應(yīng)相關(guān),故猜測MIB1基因同時也參與了彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤對糖皮質(zhì)激素的治療反應(yīng),高海麗等[15]研究顯示預(yù)后不良的T淋巴細(xì)胞白血病患者其NF-κB表達高于預(yù)后良好的T淋巴細(xì)胞白血病患者,故猜測NF-κB參與了淋巴細(xì)胞白血病對糖皮質(zhì)激素的治療反應(yīng)?；谝陨涎芯康睦碚?推測MIB1基因甲基化與哮喘患者治療的激素抵抗性相關(guān)。本實驗前期我們用Illumina法甲基化芯片技術(shù)進行了全基因組的甲基化初篩分析,篩選出數(shù)個存在異常甲基化的基因,最終我們選擇MIB1基因進行進一步驗證。

綜上,本研究中結(jié)果顯示激素抵抗哮喘組、普通哮喘組、正常對照組Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3甲基化率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在普通哮喘及激素抵抗型哮喘患者組中行Logistic回歸分析提示Cp G_1甲基化率及Cp G_3甲基化率可能為哮喘患者發(fā)生激素抵抗的預(yù)測指標(biāo),且Cp G_1甲基化率預(yù)測效能更優(yōu)。分析擴大樣本再統(tǒng)計并進一步做與Cp G_1甲基化率相關(guān)的上游或下游指標(biāo),或聯(lián)合相關(guān)指標(biāo)可能進一步證實Cp G_1甲基化率與激素抵抗的相關(guān)性,并可能可以作為預(yù)測激素抵抗發(fā)生的指標(biāo)。本研究顯示其他臨床指標(biāo)如發(fā)病年齡、體質(zhì)指數(shù)、血白細(xì)胞計數(shù)、血嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)等進行統(tǒng)計分析,均未證明與支氣管哮喘患者發(fā)生激素抵抗有明確相關(guān)性。原因考慮本實驗室檢測的標(biāo)本為血,結(jié)合其他文獻結(jié)果推測如檢測支氣管肺泡灌洗液嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)可能會有陽性發(fā)現(xiàn),但鑒于臨床此類患者住院時往往疾病狀態(tài)較重,進行氣管鏡檢查有一定風(fēng)險,患者的依從性較差,故本次研究尚未設(shè)計支氣管肺泡灌洗液進行相關(guān)指標(biāo)檢測,以后待進一步行更大臨床樣本,更多樣本類型相關(guān)指標(biāo)的檢測,并聯(lián)合相關(guān)指標(biāo)進行統(tǒng)計分析,以探討哮喘患者激素抵抗發(fā)生的危險因素以及尋找更好的臨床預(yù)測方法,對未來的個體化治療尋找理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突