UGRP1與甲狀腺結節(jié)性質、功能及BRAF基因的相關性

吳 月，杜丹丹，官偉寧，左春林

近年來，甲狀腺結節(jié)的發(fā)病率逐年上升，不同人群的患病率高達19%～67%。超聲引導下細針穿刺細胞學檢查(ultrasound-guided fine needle aspiration cytology，US-FNAC)是一種創(chuàng)傷小、可靠性高的甲狀腺結節(jié)評估手段，但該方法所取細胞較少，且難以反應病灶全貌，仍有約15%～30%病變無法明確診斷。子宮球蛋白相關蛋白1(uteroglobin-related protein 1，UGRP1)功能尚未明確，在正常人甲狀腺中有少量表達，與自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis,AITD)的易感位點相關。通過前期研究表明，UGRP1表達陽性的格雷夫斯病(graves′ disease，GD)患者行碘131(I)治療后易于發(fā)生甲狀腺功能減退，其表達受多種細胞因子調控。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)為

BRAF

600基因突變較高的腫瘤之一。該研究以FNAC結果為標準分組，對疑診甲狀腺癌的甲狀腺結節(jié)行

BRAF

600基因突變檢測，通過分析不同性質甲狀腺結節(jié)患者甲狀腺細胞中UGRP1表達情況，探討其與甲狀腺功能、性質、超聲特征以及與

BRAF

600基因突變的相關性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2019年7月—2020年6月在安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤細胞學室以甲狀腺結節(jié)為主訴行超聲引導下甲狀腺結節(jié)穿刺活檢的131例患者吸取153例甲狀腺組織，每例甲狀腺組織涂片2張，分別進行HE染色和UGRP1免疫組化染色。其中選取超聲診斷且細胞學證實的良性結節(jié)22例，取結節(jié)旁正常甲狀腺組織作為正常對照組。部分可疑惡性結節(jié)36例另取一針，將標本置于裂解液中，以熒光PCR法行

BRAF

600基因突變檢測。本研究通過安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

一抗：兔抗人UGRP1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司(1 ∶500)；二抗：PV6000酶標山羊抗兔IgG聚合物購自北京中杉金橋生物技術有限公司(1 ∶1)；PV6000內源性過氧化物酶阻斷劑、DAB試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司；人類

KRAS

/

NRAS

/

BRAF

基因突變聯(lián)合檢測試劑盒(熒光PCR法)購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司。

1.3 免疫組化實驗步驟

-20 ℃凍存切片，內源性過氧化物酶阻斷劑37 ℃烤箱孵育30 min，0.3%TRIton-X100溶液37 ℃烤箱30 min，加入一抗(1 ∶500)， 4 ℃冰箱過夜； 滴加即用型二抗37 ℃烤箱孵育30 min，滴加適量新鮮配置的DAB顯色液，顯微鏡下觀察控制染色時間，純水洗凈，蘇木精復染30 s，自來水沖洗10 min，自然風干后中性樹脂封片。

1.4 實驗結果判定標準

在光鏡下分析，排除非特異染色的前提下，細胞質內有黃色、棕黃色或棕褐色顆粒的細胞為UGRP1陽性細胞。甲狀腺功能、甲狀腺抗體均由安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內分泌科實驗室以化學發(fā)光法檢測。B超為彩色多普勒超聲檢查。US-FNAC所得細胞在光鏡下觀察，細胞核有異形、可見包涵體診斷為甲狀腺癌，鏡下可見淋巴細胞且甲狀腺相關抗體升高診斷為橋本甲狀腺炎，其余診斷為甲狀腺結節(jié)。

2 結果

2.1 UGRP1在4組患者甲狀腺細胞中的表達

橋本甲狀腺炎組(38例)、甲狀腺結節(jié)組(47例)和甲狀腺癌組(46例)UGRP1陽性表達分別為27例、2例、1例，陽性率分別為71.1%、4.3%、2.1%(見圖1B、C、D)，正常甲狀腺組(22例)中UGRP1陰性表達(見圖1A)。橋本甲狀腺炎組UGRP1陽性表達率高于正常甲狀腺、甲狀腺結節(jié)和甲狀腺癌組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。正常甲狀腺組、甲狀腺結節(jié)組、甲狀腺癌組UGRP1陽性表達率組間差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 UGRP1陽性組與陰性組的甲狀腺功能比較

根據(jù)UGRP1的表達情況，將131例患者分為UGRP1陽性組和UGRP1陰性組，結果顯示，2組血清中三碘甲狀腺氨酸(triiodothyronine，TT3)、甲狀腺素(thyroxine，TT4)、促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)組間差異無統(tǒng)計學意義。UGRP1陽性組甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、抗甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibody，ATG)高于UGRP1陰性組，組間差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見表2。

圖1 UGRP1在甲狀腺細胞中的表達 IHC×200

表1 4組甲狀腺細胞中UGRP1表達比較

2.3 UGRP1陽性組與UGRP1陰性組的超聲特征比較

UGRP1陽性組與UGRP1陰性組結節(jié)的回聲、形態(tài)、邊界、有無鈣化、縱橫比、有無腫大淋巴結、TI-RADS分級2組間差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，而結節(jié)的數(shù)目、大小、質地、血流情況在2組間差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.4 甲狀腺細胞中UGRP1表達與

基因突變的相關性分析

甲狀腺細胞中UGRP1表達與

BRAF

600基因突變存在相關性(

P

=0.023，

C

=0.414)，

BRAF

600基因突變型甲狀腺細胞其UGRP1表達傾向于陰性表達。見表4。

表2 UGRP1陽性組與陰性組的甲狀腺功能、抗體比較

表3 UGRP1陽性組和陰性表達組的超聲特征比較[n(%)]

表4 UGRP表達與BRAFV600E基因突變關系

2.5 二分類logistic回歸分析甲狀腺結節(jié)性質的相關因素

將TT3、TT4、TSH、TPOAb、ATG、UGRP1作為協(xié)變量(考慮

BRAF

600缺項影響，故未納入)，以甲狀腺結節(jié)良惡性作為應變量，進行二分類logistic回歸分析顯示，惡性甲狀腺結節(jié)與UGRP1陽性呈負相關(

P

<0.05)。見表5。

表5 二分類logistic回歸分析甲狀腺結節(jié)性質的相關因素

3 討論

甲狀腺結節(jié)的發(fā)病率在近十余年迅速增長，隨著超聲檢查在體檢中的日益普及，甲狀腺結節(jié)的檢出率日漸增多，其性質判斷成為其評估要點。US-FNAC是迄今評估甲狀腺結節(jié)最可靠的手段。根據(jù)Bethesda甲狀腺細胞病理學報告系統(tǒng)，將FNAC檢查中不能明確診斷其良惡性的結節(jié)稱為不能確定或可疑的惡性結節(jié)，這部分甲狀腺結節(jié)僅20%～25%術后病理發(fā)現(xiàn)為甲狀腺癌，而另外的患者則實施了非必要的手術。因此尋找甲狀腺結節(jié)診斷的生物學標記物作為輔助診斷的指標成為目前研究的關注點之一。

UGRP1基因定位于人染色體5q31-34，有研究表明該區(qū)域含有哮喘及AITD易感位點，具有潛在的抗炎作用。前期研究顯示，UGRP1在橋本甲狀腺炎患者甲狀腺組織高表達，并且UGRP1與自殺相關因子和人類白細胞DR抗原在甲狀腺細胞中共表達。橋本甲狀腺炎超聲影像特點為甲狀腺彌漫性病變，其合并甲狀腺結節(jié)在臨床上也很常見，橋本甲狀腺炎合并PTC發(fā)生風險是非橋本甲狀腺炎的2.8倍，UGRP1高表達與甲狀腺結節(jié)的良惡性是否存在關聯(lián)值得深入探討。

BRAF

600基因突變是PTC中最常見的遺傳變異，總的突變率約為29%～90%，多數(shù)學者認為

BRAF

基因突變與PTC的發(fā)生和發(fā)展密切相關。

BRAF

基因突變最主要是

BRAF

600點突變，可致使

BRAF

蛋白結構中

V

600

E

的氨基酸突變，從而使

BRAF

激酶發(fā)生持續(xù)性活化。激活絲裂原活化蛋白激酶通路，進一步導致癌變。本研究結果顯示：在以甲狀腺結節(jié)為主訴的患者中，橋本甲狀腺炎、甲狀腺結節(jié)和甲狀腺癌患者UGRP1陽性表達率分別為71.1%、4.3%和2.2%，其表達與甲狀腺功能無關，回歸分析顯示甲狀腺癌與UGRP1陽性呈負相關。UGRP1陽性表達的甲狀腺結節(jié)超聲影像學表現(xiàn)非低回聲、形態(tài)規(guī)則、邊界清晰、無鈣化、縱橫比<1、無腫大淋巴結、甲狀腺超聲影像數(shù)據(jù)和報告系統(tǒng)分級低級別等傾向于良性結節(jié)特征，惡性征象的特征包括微小鈣化、邊緣不規(guī)則和縱橫比>1的甲狀腺結節(jié)UGRP1表達為陰性。本研究提示UGRP1可能作為識別橋本甲狀腺炎的較好指標，但不能作為識別甲狀腺癌的有效標記物。

BRAF

600基因突變是目前已知確定的與PTC致病密切相關的分子標記物，探究甲狀腺結節(jié)UGRP1陽性或陰性表達與

BRAF

600基因突變型或野生型之間的相關性顯然具有一定意義，結果表明甲狀腺結節(jié)

BRAF

600基因突變型UGRP1呈陰性表達，從另一方面推測UGRP1陽性甲狀腺結節(jié)發(fā)生癌變的可能性不大。