髓源性生長因子促進血管生成能力的實驗研究

楊 振,文 志,江 石,龔文輝,葛圣林

血管生成不僅存在于生物體的正常生長發(fā)育全過程中，更參與了許多病理性疾病的進程以及修復(fù)過程。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、低氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病。對于部分病人保守治療效果不佳，又不適宜行血運重建的病人，以及術(shù)后部分再狹窄的病人尚無滿意的解決辦法。因此不少學(xué)者設(shè)想通過促進血管生成及增加冠脈的側(cè)枝循環(huán)來改善心肌的缺血性損傷，常見的促血管內(nèi)皮細胞生長的因子包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)等。

骨髓源性生長因子(myeloid-derived growth factor，MYDGF)為19號染色體上開放閱讀框10編碼的一種蛋白，最近研究證實MYDGF不僅能促進內(nèi)皮細胞生成，也能抑制心肌細胞的凋亡并改善心肌梗死后心肌細胞存活，保護、修復(fù)心肌梗死后的心臟。關(guān)于MYDGF對促進血管生成能力的研究報導(dǎo)較少，因此，探究MYDGF在血管形成中的作用，對于尋找冠心病有效的臨床治療靶點有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

種蛋 皖南三黃雞種蛋購于銅陵天健養(yǎng)殖場；人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.1.2

主要儀器和試劑

全自動種蛋孵化器(山東威振孵化設(shè)備公司)；MYDGF(上海近岸科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；迷你手鉆打孔器(山東美科工具有限公司);定性濾紙(南通邦杰曼濾紙公司)；移液槍(美國賽默飛世爾科技公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1

MYDGF對雞胚絨毛尿囊膜

(

chick

chorioallantoic

membrane，CAM

)

血管新生影響 選擇1周之內(nèi)產(chǎn)出、質(zhì)量范圍在(50±10)g的新鮮皖南三黃雞種蛋 。用溫度為30 ℃左右的1‰新潔爾滅液擦洗消毒，將擦洗后的種蛋晾干后放入溫度37.5 ℃,相對濕度60%～70%的孵箱內(nèi)孵育。將種蛋鈍頭朝上，使種蛋與蛋托約呈45°～60°夾角,為防止蛋胚黏連，每日早晚各翻轉(zhuǎn)種蛋1次。孵育至滿7 d時(滿 24 h 為1 d) ,照蛋等檢查種蛋孵育存活情況，并用記號表標記出雞胚氣室區(qū)域。成活雞胚可見CAM主要血管，未成活雞胚見不到CAM主要血管，棄取未成活雞胚。從中選擇成活雞胚用隨機數(shù)字表分組法將其分為5組，每組10枚雞胚，將5組分別命名為對照、PBS、低劑量MYDGF(10 ng/ml)、中劑量MYDGF(100 ng/ml)與高劑量MYDGF(500 ng/ml)組。用酒精棉球?qū)Ω鹘M雞胚進行消毒, 用迷你手工鉆在所標記出的雞胚氣室區(qū)域中央處鉆1小孔，用眼科鑷以此小孔為中心、向四周范圍逐漸輕柔剝?nèi)〉皻ぃ归_窗大小形狀約為(1.5×1.5)cm的類圓形。于開窗處滴加3滴無菌0.9%氯化鈉溶液，等待約1 min，使雞胚絨毛尿囊膜充分下陷以減少后續(xù)分離所形成的損傷，去除卵殼膜, 適當(dāng)暴露出雞胚絨毛尿囊膜。提前選擇直徑為0.6 cm的手工打孔器，將定性濾紙打孔后進行高壓蒸汽滅菌，將滅菌后的直徑為0.6 cm的濾紙作為載體置于雞胚絨毛尿囊膜上，選擇尿囊膜血管區(qū)域相對較少區(qū)域處放置。用移液槍向載體上滴入30 μl藥物,用無菌PVDF膜封口,將操作后的雞胚封口處朝上放入孵育箱繼續(xù)孵育，每經(jīng)過12 h揭去雞胚上的PVDF膜，向載體濾紙滴入相應(yīng)的30 μl藥物，用新的無菌PVDF膜封口后繼續(xù)孵育。如此孵育2 d后，揭去PVDF膜 ,于載體上滴加2滴無菌生理鹽水便于后續(xù)分離，最大限度暴露CAM以便觀察拍照。向經(jīng)拍照后的雞胚內(nèi)注入甲醇與丙酮1 ∶1的混合固定液5 ml，室溫下固定20 min，待CAM上血管完全凝固后用眼科剪完整剪下CAM，將其放置于盛有蒸餾水的平皿中鋪展開來，用低倍顯微鏡觀察CAM上的血管生長情況，以載體為中心選擇大小形狀約(1×1) cm的圓形區(qū)域為計數(shù)圈，計數(shù)CAM上的血管與計數(shù)圈邊緣的交叉點記為血管數(shù)目(vascular number，VN)。將數(shù)碼相機所拍取的圖片(圖1A)用Image ProPlus 6.0軟件，根據(jù)光度與顏色等差異，對圖片進行處理(圖1B、C)。得出血管區(qū)域所占像素點個數(shù)記為VAi，得出圖片總像素點個數(shù)記為CAMi，將兩者比值記為VAi/CAMi，以此作為每張圖片上CAM的血管區(qū)域所占面積與CAM面積之比。由于Image ProPlus 6.0軟件是基于圖片顏色及明亮程度差異等選取血管區(qū)域，所以每次用選取圖片中血管所代表區(qū)域時會產(chǎn)生細微差別，所以，對每一張圖片進行3次測量，取其平均值作為VAi/CAMi的比值。

1.2.2

HUVEC的培養(yǎng) 顯微鏡下觀察HUVEC細胞形態(tài)呈鋪路石樣，24～36 h進行細胞換液，待其長至培養(yǎng)瓶單層的80%～90%時傳代。棄去舊培養(yǎng)基，無菌PBS溶液洗3遍，1 ml 0.25%胰酶消化液作用約2～3 min。顯微鏡下觀察，細胞變圓時，棄去消化液，用含10%胎牛血清的Ham′s F12培養(yǎng)液終止反應(yīng)。用移液槍吹勻細胞1 ∶3進行傳代，于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3

CCK-8法檢測HUVEC增殖作用 取對數(shù)生長期HUVEC細胞，調(diào)整細胞密度，以2 000個/孔種植于96孔板中，分別設(shè)計對照組、MYDGF組(10 ng/ml、100 ng/ml)作用24 h，終止培養(yǎng)前每孔加入10 μl CCK-8試劑，輕微振蕩30 s混勻后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。于酶標儀中讀取450 nm處吸光度值。結(jié)果以5個復(fù)孔的均值表示。

1.2.4

檢測HUVEC的成管能力 4 ℃過夜融化matrigel膠，-20 ℃預(yù)冷24孔板和槍頭，在冰上以80 μl量的基質(zhì)膠對24孔板鋪板，保證平鋪且沒有氣泡。將鋪好的24孔板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,待基質(zhì)膠凝固。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的HUVEC細胞，用濃度為0.25%胰酶消化后離心收集細胞，分別用無血清Ham′s F12培養(yǎng)基和用無血清Ham′s F12培養(yǎng)基所配濃度為100 ng/ml 的MYDGF混合液重懸細胞，重懸后將細胞濃度調(diào)至至2×10/ml。將細胞懸液沿孔壁加入鋪有基質(zhì)膠的24孔板中，每孔500 μl。每組設(shè)置3個復(fù)孔。37 ℃、5%CO飽和濕度條件培養(yǎng)6 h；每隔2 h顯微鏡下觀察，100倍顯微鏡下拍照統(tǒng)計成管數(shù)目，每孔選擇3個視野拍照，用Image J軟件對分析處理，將3個視野計算所得平均值代表這個孔的相應(yīng)數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 MYDGF對CAM血管生長影響

經(jīng)數(shù)碼相機攝像后的圖片與經(jīng)IPP 6.0軟件處理后的圖像中CAM血管對比，看出經(jīng)IPP 6.0軟件處理后的圖片中血管顯示良好(圖1)。對照組、PBS組、低劑量MYDGF組CAM血管未見明顯差別，CAM血管發(fā)育良好，各級血管呈樹葉狀分布，但微血管數(shù)量不密集；中劑量MYDGF組與高劑量MYDGF組2組CAM血管發(fā)育良好，各級血管呈樹葉狀分布，血管清晰可見，較前面3組相比，可見二級分支血管及微血管數(shù)量增密(圖2)。

圖1 CAM原始圖像與處理后圖像血管顯示對比 ×4A：原始圖像；B：經(jīng)Image Pro Plus中RGB處理后圖像；C：經(jīng)灰度處理后的圖像

圖2 MYDGF對CAM血管生成的影響 ×4 A：對照組；B：PBS組；C：低劑量MYDFG組；D：中劑量MYDGF組；E：高劑量MYDGF組

2.2 CAM新生血管的定量觀察指標

與對照組CAM新生血管單位面積的VN、VA/CAM相比，用濃度100 ng/ml的MYDGF作用于CAM新生血管2 d后，CAM新生血管的VN、VA/CAM明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=25.815,

P

<0.01)。對照組、PBS組、低劑量MYDGF組3組中CAM新生血管條數(shù)VN及VA/CAM面積比值結(jié)果無明顯變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。用不同濃度MYDGF(濃度分別為10 ng/ml，100 ng/ml，500 ng/ml)作用于CAM新生血管2 d后，VN及VA/CAM面積比值變化顯示MYDGF對CAM新生血管呈現(xiàn)濃度依賴性(

F

=16.856,

P

<0.01)。見表1。

表1 各組VN與VA/CAM結(jié)果比較

2.3 MYDGF對HUVEC增殖功能的影響

與對照組比較，中劑量MYDGF組OD值增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=25.51，

P

<0.05)，與對照組比較，低劑量MYDGF組OD值無明顯變化。見圖3。

圖3 MYDGF對HUVEC增殖的影響

2.4 MYDGF對HUVEC成管功能的影響

中劑量MYDGF組與對照組HUVEC成管圖像見圖4。與對照組成管的主干長度總計比較，低劑量MYDGF組組作用的HUVEC，其成管的主干長度總計明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=231.65，

P

<0.01)。與對照組成管的網(wǎng)格數(shù)比較，中劑量MYDGF組作用的HUVEC，其成管網(wǎng)格數(shù)目明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=268.13,

P

<0.01)。見圖5、6。

3 討論

冠心病主要由于動脈粥樣硬化，造成動脈血管堵塞、狹窄或者痙攣從而導(dǎo)致心肌低血低氧發(fā)生一系列病變的疾病。冠心病是致殘率及病死率極高的疾病，嚴重威脅著人類的健康與生命。數(shù)據(jù)顯示，中國心血管病患病率及病死率仍處于上升階段，中國心血管病患者已達2.9億例，其中冠心病患者約有1 100萬；心血管病病死率高居首位，占居民疾病死亡構(gòu)成組成比40%以上，腫瘤及其他疾病，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，其中45歲以下人群發(fā)病率呈逐年上升趨勢。因此，研究這一重大疾病的防治策略具有重大意義。應(yīng)用藥物擴張冠狀動脈，使狹窄的心肌血管再生及建立有效的側(cè)枝循環(huán)，改善心肌缺血低氧目前已成為是藥物治療冠心病研究中的熱點之一。既往有研究表明，MYDGF能通過Akt及PI3K信號通路抑制小鼠心肌細胞凋亡，不止減少了小鼠心肌梗死區(qū)域的面積，還改善了小鼠的心室重構(gòu)及心臟收縮功能。有多種組織和器官可以合成MYDGF，在急性心肌梗死患者的血漿及心肌梗死區(qū)域，MYDGF表達上調(diào)被認為是心肌損傷的適應(yīng)保護機制。MYDGF還可通過STAT3、MAPK1/3信號通路和細胞周期蛋白D1的信號通路，以此增強內(nèi)皮細胞的增殖。還有研究表明MYDGF能促進肝癌細胞增殖、對糖尿病腎病小鼠損失的足細胞有保護作用。該研究以CAM血管為模型，研究表明MYDGF可促進CAM新生血管的生成數(shù)目、CAM新生血管面積與CAM面積比值的增加，提示MYDGF能促進CAM新生血管生成能力，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，而PBS對CAM新生血管的作用無明顯影響作用。MYDGF能促進HUVEC細胞OD增加，并增加其成管的主干長度及成管網(wǎng)格數(shù)目，提示MYDGF能提高HUVEC的增殖及成管能力。以上實驗提示MYDGF可促進血管生成，為MYDGF促進心肌血管狹窄后其側(cè)支循環(huán)血管的新生及狹窄部位血管再通的維持治療提供了新的實驗依據(jù)。

圖4 MYDGF對HUVEC成管能力的影響 ×100A：中劑量MYDGF組；B：對照組；1、2、3:隨機選取不同位置

圖5 MYDGF對HUVEC成管主干長度總計影響

圖6 MYDGF對HUVEC成管網(wǎng)格數(shù)影響

血管生成常用的研究模型方法有CAM法、人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞成管實驗法、血管內(nèi)皮細胞模型法、鋸齒動物皮下氣囊、鋸齒動物虹膜和無血管的角膜等多種研究方法。CAM是雞胚的一層外膜，雞胚通過CAM進行氣體交換，同時CAM功能的發(fā)揮有賴于CAM中血管網(wǎng)的支撐，由于雞胚發(fā)育中大量尿囊膜血管生成，為研究血管生成提供的很好的實驗?zāi)Ｐ?。而且雞胚發(fā)育早期，免疫系統(tǒng)尚發(fā)育不全，對測試藥物不會產(chǎn)生排斥反應(yīng)，實驗結(jié)果易得且肉眼直觀可見。同時，該模型具有實驗材料易得、操作簡易、結(jié)果直觀、周期短等優(yōu)點。

評價CAM血管常用的方法有人工計數(shù)血管數(shù)量、計數(shù)單位范圍內(nèi)血管條數(shù)VN、計算血管平均直徑、計算CAM上的血管面積以及計算VA/CAM等。

本研究選擇人工計數(shù)單位范圍內(nèi)血管條數(shù)VN及計算機軟件計算VA/CAM比值2種方法，使血管生成定量指標較為客觀且更符合肉眼觀察的實際情況。但由于CAM血管脆弱，即便小心操作，仍有一小部分CAM血管處破裂。而計算機軟件選擇CAM血管時，由于攝取圖片清晰度軟件自身功能影響，也會使處理后圖片中CAM血管于原始圖片存在少許誤差。因此，CAM血管生成定量研究方法有待于進一步完善。

促進血管生成是冠心病治療方法中的一個新領(lǐng)域，但因各類血管生成因子類制品在促進血管生成的同時，還潛在有著促使腫瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜疾病等加速進展的可能。因此，MYDGF促進血管生成的具體作用機制尚有待進一步研究，MYDGF在臨床方面的應(yīng)用及其潛在不良影響尚待進一步發(fā)現(xiàn)。對于缺血性疾病，MYDGF可能作用一種新的生長因子或新的潛在治療點。今后仍需要對MYDGF作用的受體或信號通路分子、MYDGF在心血管疾病中的作用及臨床應(yīng)用等方面進行探索。