不同類型土壤胡敏酸提取物環(huán)境持久性自由基特征及影響因素

魯遙，王朋，尹夢楠，楊名毅，張凰

（1昆明理工大學環(huán)境科學與工程學院，云南昆明650500；2成都理工大學生態(tài)環(huán)境學院，四川成都610059；3昆明理工大學農(nóng)業(yè)與食品學院，云南昆明650500；4云南省土壤固碳與污染控制重點實驗室，云南昆明650500）

自由基是一種至少含有一個未配對電子的原子、分子或共價基團，由分子共價鍵受到外界能量影響而發(fā)生均裂產(chǎn)生[1]。自1900年Gomberg[2]發(fā)現(xiàn)了三苯甲基自由基的存在后，科研工作者便開始對自由基的環(huán)境行為和反應機理進行深入研究。20世紀60年代末，研究者在光化學煙霧形成機理的實驗中，證明了自由基的產(chǎn)生是化學反應的關鍵[3]。在生物體內(nèi)，自由基參與免疫系統(tǒng)工作能殺死病毒、細菌等。但是從生物體外進入的過量自由基，如吸煙、大氣顆粒物等途徑，會導致過氧化氫酶在消除過量自由基方面的功能失調(diào)，從而引起應激反應，導致細胞損傷[4]。但這種自由基在環(huán)境中存在時間短（約為10-9s），且不穩(wěn)定，被稱為瞬時自由基[5]。

1977年，Heimer[6]提出有機化學反應過程中能形成穩(wěn)定的自由基。直到2007年，Delinger等[7]提出環(huán)境持久性自由基（environmentally persistent free radicals,EPFRs）的概念。越來越多的研究結果表明，EPFRs廣泛存在于大氣懸浮顆粒物[8-10]、土壤沉積物[11-13]和天然有機質(zhì)[14-18]等環(huán)境介質(zhì)中。土壤中EPFRs的來源可以分為自然產(chǎn)生和人為影響。自然產(chǎn)生是指天然有機質(zhì)[14-18]以及有機污染物（如多環(huán)芳烴、五氯苯酚等）與土壤礦物相互作用[19-20]而產(chǎn)生的EPFRs。人為影響來源于人類活動，如焚燒[21-22]、低溫熱裂解[23]以及高溫制備的土壤改良劑[24-26]等固體顆粒物，通過大氣循環(huán)或干濕沉降進入土壤。研究發(fā)現(xiàn)EPFRs可以穩(wěn)定在固體顆粒上幾分鐘至幾十天，由于其高的氧化應激效應可誘發(fā)生物細胞和機體損傷，從而引發(fā)肺部和心血管疾病[27]。研究土壤中天然有機化合物攜帶的EPFRs，特別是在不同有機質(zhì)組分中的分布特征與穩(wěn)定機制，是預測土壤中EPFRs環(huán)境風險至關重要的一步。

對于全球環(huán)境來講，土壤有機質(zhì)作為全球碳循環(huán)中關鍵的一部分，與土壤中的EPFRs有著密切的聯(lián)系，探究其活性與穩(wěn)定性對全球碳循環(huán)有著重要的意義[28]。胡敏酸（humic acids,HAs）是一種含有羧基、羥基、醌基等多種官能團的高分子有機聚合物，其中芳香環(huán)是構成HAs分子結構的基礎，由碳鏈連接成疏松的網(wǎng)狀結構[29]，常被用作土壤有機質(zhì)研究的替代物。研究證實HAs中含有的自由基是生物體大骨節(jié)病的一種致病因子[30]。由于不同來源的HAs結構和功能差異性較大，從HAs前體分子的結構角度來預測EPFRs性質(zhì)和環(huán)境行為的研究還存在不足[31]。研究表明，EPFRs形成與在HAs性質(zhì)之間有何關系存在爭議，Gonzalez等[32]研究發(fā)現(xiàn)半醌自由基的濃度與芳香碳的比例呈正相關，芳香性強的腐殖質(zhì)中電子共軛體系更完善，從而自由基信號強度高；相反地，Riffaldi等[17]則發(fā)現(xiàn)甲基化程度高的腐殖質(zhì)含有更大的未配對電子遷移率，這一類腐殖質(zhì)的自由基信號更強。因此，HAs中EPFRs形成和穩(wěn)定的影響因素還需要更加深入系統(tǒng)的研究。

本文對不同來源土壤的HAs進行表征，原位測定HAs的EPFRs信號強度，同時對EPFRs的濃度和種類特征進行了研究，包括g值和線寬（ΔH），探究不同性質(zhì)HAs（如來源、結構或組分）與HAs中EPFRs信號特征的關系，對研究土壤天然有機質(zhì)中EPFRs的產(chǎn)生、遷移及環(huán)境風險有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用的鹽酸（HCl）和氫氧化鈉（NaOH）來自成都市科龍化工試劑廠，焦磷酸鈉（Na4P2O7·10H2O）來自重慶市川東化工有限公司，氫氟酸（HF）來自四川西隴化工有限公司，純度均高于分析級。

實驗所用土壤采集地分別為來自云貴高原紅土（東經(jīng)102.10°，北緯24.23°）、黑龍江省黑土（東經(jīng)127.85°，北緯42.8°）、山東省黃土（東經(jīng)120.75°，北緯37.8°），將土壤自然風干，過100目篩備用。

1.2 HAs的提取

采用堿溶酸析法進行HAs提取[33]，將過好篩的土壤樣品按固液比1∶10（kg/L）加入氫氧化鈉溶液和焦磷酸鈉溶液（0.1mol/L，1∶1），靜置12h后，用虹吸法將上清液吸出保留，提取過程重復4次。向提取的上清液中加入鹽酸溶液沉淀，保留沉淀物。向沉淀物中加入氫氟酸（10%）洗滌5次，再用清水洗滌。以3500r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，收集固體部分，將固體部分冷凍干燥。以B-HAs、R-HAs、Y-HAs分別對3個不同地區(qū)的土壤胡敏酸命名，分別是黑土、紅土、黃土。黑土分4次提取，依次命名為B-HA-1、B-HA-2、B-HA-3、B-HA-4，紅土和黃土命名方式同黑土，分別用R和Y代替B。

1.3 HAs的表征

（1）灰分測定用灰分判斷HAs的純度，灰分含量越高，HA的純度就越低[34]。灰分測定采用馬弗爐灼燒法，在600°C條件下對從土壤中提取的HAs灼燒4h，進行稱量，按式(1)計算。

式中，w為灰分含量，%；m0為坩堝質(zhì)量，g；m為灼燒后樣品和坩堝質(zhì)量，g；m1為灼燒前樣品和坩堝質(zhì)量，g。

（2）元素分析用元素分析儀（vario MICRO cube,Elementar,Germany）測定固體HAs中C、H、O、N等的元素組成。每種樣品稱取2mg左右進行元素分析，所有測定重復2次。

（3）固體碳譜核磁測定13C NMR（DPX 300，Bruker，美國）用于主要結構碳的測定，測試參數(shù)如下：13C NMR光譜是在75MHz、13C和300MHz的頻率下獲得的，MAS掃描速率13kHz，接觸時間2ms，1s循環(huán)延遲，每次樣品掃描約30000次，譜線展寬50Hz[35]。

（4）傅里葉紅外光譜采用溴化鉀壓片法，用傅里葉紅外光譜儀（PerkinElmer Spectrum One）對所有HAs進行紅外吸收分析。將干燥且研磨好的溴化鉀粉末與HAs混合在一起，以400∶1（KBr∶HAs）的比例在干燥的環(huán)境下研磨并混合均勻，在波長范圍400～4000cm-1中對樣品化學結構及官能團變化進行分析。

（5）紫外分光光度法采用島津UV-3600分光光度計進行紫外-可見光譜測定，以超純水為空白對照，稱取一定量的胡敏酸固體，用少量0.1mol/L NaOH溶液溶解，加入UP水，用0.1mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，配制成被測胡敏酸溶液。在200～800nm范圍內(nèi)掃描，步長為1nm。計算E4/E6值，表示被測溶液在波長465nm和665nm處吸光度的比值，是對HAs組成結構表征的重要指標，按式(2)計算。

（6）三維熒光光譜測定使用Lumina熒光分光光度計測定HAs溶液，設定參數(shù)如下，掃描速度為2400nm/min，間隔時間為20ms；掃描范圍如下，激發(fā)波長（λEx）為240～450nm，發(fā)射波長（λEm）為300～600nm，帶寬均為5nm。

（7）分子量的測定采用高效液相色譜（HPLC Agilent 1200，美國）紫外檢測法在254nm處測量了HAs的分子量（MW）。實驗流動相采用磷酸二氫鉀溶液和磷酸氫二鉀溶液（0.1mol/L，1∶1）配制鹽溶液，采用分子量為分別210、4300、6800、17000、32000和77000的聚苯磺酸溶液（鈉鹽）建立標準曲線。

1.4 電子順磁共振波譜（EPR）測定

將凍干后的HAs提取物固體樣品置于高純度石英EPR管中，室溫下在電子順磁共振波譜儀（EPR）（Bruker,A300-6/1，X band）中進行單腔體分析，調(diào)制為100kHz，微波頻率為9.2～9.9GHz。EPR微波功率設定為0.1mW，掃描時間為81.92ms。EPR測量的其他典型參數(shù)如下：掃描寬度為100G，調(diào)制幅度為1.00G，X軸的分辨率為1024個點。

2 結果與討論

2.1 不同源HAs的自由基特征

分別從黑土、紅土和黃土中各提取4次HAs，HAs的EPFRs信號如圖1所示。對同一土壤來源，隨著提取次數(shù)的增加，EPFRs的信號強度在減弱，自由基信號強度變化最明顯的是B-HAs，其次是Y-HAs，R-HAs自由基信號強度變化最弱，說明R-HAs中EPFRs最穩(wěn)定。不同土壤來源HAs中EPFRs信號強度具有顯著的差異（表1），信號強度大小依次為B-HAs＞R-HAs＞-HAs。紅土中含有大量的過渡金屬Fe，Li等[36]研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物在Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的循環(huán)過程中能形成EPFRs。Lovley等[37]發(fā)現(xiàn)微生物在土壤中可以利用腐殖質(zhì)這個電子穿梭體將電子傳遞給Fe3+，微生物活動旺盛，更有利于微生物與不易接觸到的Fe3+氧化物之間傳遞電子，因此R-HAs中的EPFRs信號更穩(wěn)定。黑土所處的氣候溫和干燥，土壤中有機質(zhì)的腐殖化過程較礦質(zhì)化過程更快，氣溫低抑制土壤微生物的活動，因此有利于腐殖質(zhì)在土壤中的積累[38]。由于黑土中有機質(zhì)含量豐富，而因此在B-HA-1中EPFRs含量最多，但是隨提取次數(shù)的增加，B-HA-4與B-HA-1相比減少了2.8倍，提取批次對B-HAs的EPFRs信號強度變化的影響最明顯。這一結果表明，黑土中EPFRs的分布與其HAs異質(zhì)性有關。山東黃土的腐殖質(zhì)形成過程較弱，地表的凋落物大多以干燥的形式覆于土壤表面，從而導致積累的腐殖質(zhì)較少[38]，因此Y-HAs中自由基含量少于B-HAs。此外，黃土分布區(qū)域沒有紅土所在地日照時間長，而黃土中過渡金屬含量低于紅土，因此在自由基信號強度穩(wěn)定性方面介于黑土和紅土之間。

表1 不同來源HAs中EPR信號特征參數(shù)

g值又稱朗德因數(shù)，可以表示磁場共振位置，能夠提供化學鍵和分子或原子結構的信息，是電子順磁共振測試中的重要特征參數(shù)[39]。根據(jù)不同g值可判斷樣品中所包含的EPFRs特征信息，g值小于2.0030，主要是以碳原子為中心的自由基，如芳烴類自由基；若g值大于2.0040，主要是以氧原子為中心的自由基，如醌類或半醌類自由基。實驗中所有HAs的自由基g值均在2.0034～2.0041（表1），可以判斷自由基信號來源于碳中心自由基與氧中心自由基的混合體系或者孤電子附近有含氧官能團的碳中心自由基[40-42]。從線寬（ΔH）來看，不同土壤來源提取HAs的線寬雖然差異不大，但是在同一土源中隨提取次數(shù)的增加線寬值略有增加，整體ΔH在4.30～4.70G，說明EPFRs的種類差異并不明顯，Arangio等[40]指出ΔH在3～8G說明醌類或半醌類自由基是主要EPFRs。從g值和線寬的數(shù)據(jù)均表明本文中HAs攜帶的EPFRs主要是醌類或半醌類自由基[43]。

土壤中腐殖質(zhì)主要充當電子穿梭體，利用其自身的氧化還原反應，在土壤微生物與不易接觸到的Fe3+氧化物之間傳遞電子[44]。紫外輻射、氧氣含量、pH都能對腐殖酸中EPFRs的產(chǎn)生造成影響，使醌從苯醌態(tài)還原到半醌態(tài)[45]或特定條件下苯醌基團與對苯二酚反應，從而產(chǎn)生了半醌自由基[46]。而HAs作為復雜的天然有機質(zhì)并非只含有這兩種自由基信號，還可能存在HAs與金屬離子形成絡合物產(chǎn)生的自由基信號[32]，或含有超精細結構信號[45]，但半醌自由基信號在其中占主導地位。

圖1 不同來源土壤分批次提取HAs的EPR信號（TX表示提取次數(shù)，X=1～4）

2.2 HAs極性和結構對自由基特征的影響

2.2.1 HAs極性與EPFRs之間的關聯(lián)

不同類型土壤HAs提取物的元素分析和灰分含量列于表2，灰分質(zhì)量分數(shù)小于5%時可以忽略其對分析結果的影響[35]。由表2可知，所有HAs樣品的元素組成中C和H含量隨著提取批次的增加略有增加，O含量則與之相反。B-HAs中C元素占54.39%～54.80%，R-HAs中C元 素 占53.75%～55.34%，Y-HAs中C元素占51.28%～51.71%。結果表明，不同源土壤灰分差異較小，說明獲得的HAs純度相近，不同源土壤HAs中C、O、H和N元素含量不同，其中C、O和N相近，但H存在一定差異，C/H比略有不同。

表2 3種土壤分批次提取的HAs的元素分析和紫外吸收光譜

進一步通過計算C/H比和(N+O)/C比可以判斷HAs組成的性質(zhì)。C/H比可用于推測HAs的芳香性和脂肪性，C/H比大表明其芳香性強，C/H比小則表明其脂肪化程度高[47]。如表2所示，B-HAs中C/H比（0.87～1.05）顯 著 高于R-HAs（0.79～0.88）和Y-HAs（0.73～0.82）。這主要歸因于黑土中的腐殖酸來源主要受陸源植物影響，而黃土和紅土的C/H比小于1，表示這兩種土壤中更多是微生物來源的HAs[48]。對于同一來源土壤，提取的HAs中C/H比隨著提取次數(shù)的增多呈下降趨勢，表明芳香性組分優(yōu)先被提取。通過計算(N+O)/C比可以用于描述HAs的極性，其中(N+O)/C比越低，說明HAs極性越弱。結果表明，相同來源土壤中的HAs隨提取次數(shù)的增加極性呈下降趨勢，即極性高的組分優(yōu)先被提取。這些現(xiàn)象與前人的研究結果一致[49]。

隨提取次數(shù)的增加，C/H比越大（表2），說明更多芳香性強的HAs被逐漸提取出來。由圖2(a)可知，C/H比與EPFRs信號強度呈顯著正相關（r=0.861，p＜0.05），這一結果表明芳香性組分對HAs中EPFRs信號強度起重要貢獻。這主要歸因于芳香族化合物自由電子能夠部分離域，向過渡金屬提供電子，形成穩(wěn)定的EPFRs[49]。進一步分析EPFRs的特征發(fā)現(xiàn)，本文中所有HAs樣品的g值在2.0034～2.0041，屬于以碳中心基團和氧原子為中心的自由基混合存在，或者未成對電子附近有含氧官能團的碳中心自由基。EPFRs的g值與C/H比呈顯著負相關（r=-0.755，p＜0.05）[圖2(b)]，表明隨著HAs芳香性的降低，氧中心自由基基團所占比例逐漸減少。

2.2.2 HAs提取物對EPFRs的影響

圖2 HAs的C/H比與EPFRs自旋密度和g值的相關性

不同類型土壤HAs提取物的三維熒光譜圖如圖3所示。在Ex/Em=270～440nm/430～540nm間出現(xiàn)的峰為類胡敏酸，在Ex/Em=240～360nm/370～450nm間出現(xiàn)的峰為類富里酸，在Ex/Em=260～290nm/300～350nm間出現(xiàn)的峰表示類蛋白[50]。從譜圖中可以發(fā)現(xiàn)，每個譜圖都存在一些肩峰，這是因為腐殖酸分子結構組分復雜，不僅含有單一熒光基團[39]。除B-HAs有兩個特征峰a、b外，R-HAs和Y-HAs中均出現(xiàn)第3個特征峰c，主要歸因于生物降解產(chǎn)生芳香環(huán)氨基酸結構形成的類蛋白類物質(zhì)。多糖、纖維素等類蛋白類物質(zhì)可能出現(xiàn)在R-HAs和Y-HAs中，且數(shù)值越大，類蛋白類物質(zhì)在三維熒光譜圖中熒光響應就越高。a峰熒光強度比b、c峰熒光強度強，類胡敏酸物質(zhì)的相對熒光強度大，因此可知，B-HAs、R-HAs和Y-HAs中均是類胡敏酸物質(zhì)占最主要地位。Y-HAs和R-HAs中出現(xiàn)類蛋白類物質(zhì)，說明土壤腐殖質(zhì)在形成過程中受到微生物的作用，這與R-HAs和Y-HAs元素結果（C/H比）主要是微生物源結論相一致。b峰與HAs中羰基和羧基結構有關[50-51]，在12種HAs中均有羰基和羧基結構，但是熒光強弱不一，主要歸因于來源地域差異和提取次數(shù)的影響。

圖3 3種土壤分批次提取HAs的3D熒光譜圖

Senesi等[52]認為，在相同波長范圍內(nèi)，熒光強度的增強表明物質(zhì)結構復雜化，而強度降低則表明芳構化程度的降低。按熒光峰位置及強度分析，B-HAs中類胡敏酸物質(zhì)熒光強度要高于Y-HAs，R-HAs中類胡敏酸物質(zhì)熒光強度最弱。因此推測B-HAs中含有芳構化程度最大的類胡敏酸物質(zhì)[53]，且相同來源HAs隨著提取次數(shù)的增加，a峰熒光響應強度下降，因此HAs的芳構化程度減弱。對于出現(xiàn)c峰的R-HAs和Y-HAs可能由于土壤微生物活動產(chǎn)生類蛋白類物質(zhì)，類蛋白類物質(zhì)的疏水性[54]使其隨提取次數(shù)的增加而逐漸析出，因此類蛋白類熒光響應增強。而黑土中微生物活動弱，產(chǎn)生的類蛋白物質(zhì)少，B-HAs的類蛋白峰響應強度弱。

進一步分析了HAs的紫外光譜特征。由表2可知，12種HAs的紫外吸收強度隨波長的增加HAs吸光度逐漸減少，這說明HAs中含有芳香族C==C鍵及其他生顯色官能團[55]。HAs作為一個結構和成分復雜的混合體天然有機質(zhì)，同一土源中隨著提取次數(shù)的增多，紫外吸收強度在同一波長范圍內(nèi)呈下降趨勢，說明隨提取次數(shù)增加，其芳香族組分及其他生色團（芳烴羧基、羰基或酚基）含量減少[56-58]。

在285nm處的吸光度可用來表征HAs的芳香性，在285nm處的吸光度越高，表明HAs的芳香性越大，芳香族基團含量越高[59]，同一土源中的HAs在285nm處的紫外吸收值隨提取次數(shù)的增加而減小，說明芳香性隨提取次數(shù)的增加呈下降趨勢。HAs在285nm處的紫外吸光度列于表2，隨著提取次數(shù)的增加，3種來源土壤HAs的芳香性均減弱，這與元素分析的結論一致。

由圖4可知，HAs在285nm處的吸光度與EPFRs信號強度具有顯著的正相關關系（r=0.842，p＜0.05）。研究表明HAs中芳香碳含量和半醌自由基濃度呈很好的正相關，與脂肪碳呈負相關[32]。HAs中芳香碳含量高低能影響自由基的信號強度，芳香碳含量越高，HAs擁有更完善的電子共軛體系[48-49]。因此，EPFRs含量隨芳香性的增強而呈上升趨勢。

圖4 HAs的EPFRs與其紫外光譜特征之間的相關性分析

腐殖化程度可以用腐殖酸分子中芳香族結構物質(zhì)所占的百分率來表示[46]。研究表明，有機質(zhì)腐殖化程度越高，擁有更多的芳香性結構物質(zhì)[60]。本實驗采用紫外-可見光分光光度法表征HAs樣品的芳香性[61]，用來說明實驗所用HAs的化學性質(zhì)和腐殖化程度。E4/E6判斷腐熟度的指標，如圖4(b)所示，HAs中EPFRs的g值與E4/E6之間有一定的負相關關系。這一結果表明，隨著土壤中HAs的腐殖化程度加深，形成氧中心自由基的量減少，主要形成以碳中心自由基或者碳中心自由基與氧中心自由基的混合體系，這可能與腐殖化導致O元素的量減少有關（表2）。

2.3 HAs分子量和性質(zhì)對EPFRs特征的影響

2.3.1 分子量影響EPFRs的形成

HAs的分子量分布如圖5所示。所有HAs的色譜圖中均有3個峰，峰a是70～300的分子量，強度不明顯，峰b是300～2.5×104的分子量，代表芳香族結構，峰c是2.5×104～1×105的分子量，代表脂肪族結構[62]。不同來源HAs之間存在明顯差異，說明各HAs間分子量差異較大。根據(jù)圖5中分子量譜圖可以清楚地看出，雖然a峰區(qū)域的小分子量變化不明顯，但是b峰區(qū)域（300～2.5×104）隨提取次數(shù)增加紫外響應值在下降，而c峰區(qū)域（2.5×104～1×105）卻呈明顯增加趨勢，由此可知，隨著提取次數(shù)的增加，HAs中小分子物質(zhì)在減少，大分子物質(zhì)增多，這可能是因為親水性的小分子組分先提取出來，后提取出來的是大分子組分。

圖5 3種土壤分批次提取HAs的分子量分布（TX表示提取次數(shù)，X=1～4）

當提取次數(shù)增加時，整個體系的大分子逐漸變多且親水性降低，使得大分子量組分擴散變得困難。結合EPR分析結果，隨著提取批次的增加，HAs分子量的增加，EPFRs信號強度減弱。研究表明體系中穩(wěn)定自由基的含量與自由基的鏈長有關，自由基單體會與長鏈自由基結合而降低自由基穩(wěn)定性[63-64]。大分子結構中聚集形式的腐殖質(zhì)可以保護自由基前體相關的結構，使產(chǎn)生自由基的前體分子不容易發(fā)生化學鍵的斷裂[65]，從而抑制了EPFRs的形成。

2.3.2 HAs分子特征對自由基的貢獻

3種土壤分批次提取得到的HAs固體經(jīng)13C NMR測試后各個峰的積分面積所占百分比見表3，HAs的13C NMR波譜可主要分為5種結構帶：脂肪碳（δ0～45），與O相連的脂肪碳（δ45～110），芳香碳（δ110～165），羧基碳（δ165～190），羰基碳（δ190～220），其中芳香碳中含有兩個共振峰，分別為與C、H原子相連的芳香碳（δ110～145）和與O、N原子相連的芳香碳（δ1145～165）[48]。HAs化學結構相似，主要碳結構有芳香碳、脂肪碳、羧基碳和羰基碳。雖然結構差異不大，但是根據(jù)每種碳所占比例（表3）可以看出，由于土壤來源和提取批次不同，每種HAs都具有各自的結構，且每種結構碳含量不相同。

根據(jù)表3可知，B-HAs的芳香碳含量為45.00%～39.96%，R-HAs中芳香碳含量為37.62%～36.36%，Y-HAs中芳香碳含量為36.63%～30.00%，不同土源HAs中芳香碳含量最多的是黑土，其次是紅土和黃土。對于3種土壤不同提取批次的HAs，芳香碳含量表現(xiàn)出相同的變化趨勢，即隨提取批次的增加，芳香碳（δ110～165）含量減小，脂肪碳（δ0～110）含量增加。從芳香性和脂肪性的角度看，B-HAs含有更多的芳香結構，R-HAs次之，Y-HAs芳香結構最少，脂肪性則呈現(xiàn)相反趨勢；而對于同土源不同提取批次的HAs來講，隨提取批次增加芳香性減弱，脂肪性增加，這一結果與前面的結論一致。

表3 固態(tài)13C NMR譜分析結果

如圖6所示，EPFRs信號強度與HAs芳香性呈正相關（r=0.813，p＜0.01），說明HAs中持久性自由基主要來自芳香類組分貢獻。如圖6(b)所示，g值與HAs芳香性呈負相關（r=-0.752，p＜0.01），說明隨著芳香性的增加，以氧為中心基團的自由基含量減少。這一結果與前面元素分析、紫外光譜分析結論相一致。

圖6 EPFRs信號強度和g值與HAs芳香性組分之間的相關性分析

隨提取次數(shù)增加，3種土源HAs的自由基強度都在減小，但R-HAs的自由基強度變化要比其他兩種土壤HAs的自由基強度變化更小。R-HAs的EPFRs信號更加穩(wěn)定，可能的原因是在自然界中腐殖質(zhì)是微生物與鐵氧化物之間電子傳遞過程的重要介導，紅土中過渡金屬鐵含量較溫帶地區(qū)豐富[66]，F(xiàn)e3+可以與氫氧根離子或水分子結合，形成[Fe(OH)1～4]-1～2+這樣的小聚物，易與芳香族自由基陽離子發(fā)生絡合，部分轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的氧源性自由基[37]。此外，相對于其他兩種土壤的來說，紅土中R-HAs來自紫外輻射強烈的云貴高原，紫外輻射可以加快HAs中苯酚類物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，在此過程中前體化學鍵斷裂可產(chǎn)生壽命長達數(shù)天的EPFRs。因此，R-HAs中含有更加穩(wěn)定的EPFRs，使自由基強度變化受提取次數(shù)影響小。

3 結論

胡敏酸自身結構較為復雜，其產(chǎn)生的自由基信號是混合信號峰。本文通過對HAs進行系統(tǒng)表征分析，建立其分子結構特征與EPFRs特征之間的關聯(lián)，主要結論如下。

（1）EPFRs的g值和線寬的數(shù)據(jù)均表明本文中HAs攜帶的EPFRs主要是醌類或半醌類自由基。隨著土壤中HAs的腐殖化程度加深，形成氧中心自由基的量減少，主要形成以碳中心自由基或者碳中心自由基與氧中心自由基的混合體系，這可能與腐殖化導致O元素含量的減少有關。

（2）HAs的芳香性與其EPFRs信號強度有相同變化趨勢，芳香性結構中自由電子能夠部分離域?qū)е伦杂苫盘枏姸仍鰪姡虼薍As隨提取次數(shù)的增加芳香性減弱，脂肪性增強，EPFRs信號強度與芳香性成正相關。

（3）從不同類型土壤HAs提取物來看，RHAs相對于其他兩種土源HAs的Fe3+含量豐富、受紫外輻射強，通過過渡金屬氧化物與芳香族自由基陽離子的絡合反應或自由基前體化學鍵斷裂，產(chǎn)生穩(wěn)定EPFRs，R-HAs的EPFRs信號穩(wěn)定性強于其他兩種來源HAs。