葡萄籽原花青素對(duì)羔羊瘤胃發(fā)酵、血清炎癥及抗氧化指標(biāo)的影響

郝小燕，牟春堂，喬棟，張暄梓，楊文軍，趙俊星，張春香，張建新?

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2朔州市草牧業(yè)發(fā)展中心，山西朔州 036002

0 引言

【研究意義】在生態(tài)保護(hù)日益受到重視的背景下，傳統(tǒng)畜牧業(yè)逐漸向先進(jìn)的集約化飼養(yǎng)模式轉(zhuǎn)變。我國(guó)優(yōu)質(zhì)粗飼料較為短缺，反芻動(dòng)物生產(chǎn)中大量使用高谷物飼料以維持或提升生產(chǎn)性能。高精低粗的飼糧結(jié)構(gòu)雖能提高育肥牛羊的生長(zhǎng)速度，提高奶牛、奶山羊的產(chǎn)奶量，但長(zhǎng)期飼喂高谷物飼糧引發(fā)的健康問(wèn)題不容忽視。因此，研究高精料飼糧條件下調(diào)控瘤胃發(fā)酵、保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷的措施對(duì)反芻動(dòng)物健康、高效養(yǎng)殖具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】侯志高等[1]研究發(fā)現(xiàn)不同精料濃度飼糧對(duì)瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和機(jī)體氧化應(yīng)激有顯著影響，精料比例在55%時(shí)瘤胃內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力最高，丙二醛（MDA）含量最低，清除自由基的能力最強(qiáng)。而隨著精料比例增加，瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞，抗氧化能力顯著下降，抵抗不良刺激的能力下降，故高精料飼糧下機(jī)體容易發(fā)生一系列代謝性、炎性疾病。原花青素（proanthocyanidins，PC）是自然界中廣泛存在的植物多酚類(lèi)化合物，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素聚合而成。有關(guān)研究表明原花青素可以增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，進(jìn)而改善動(dòng)物健康狀況、促進(jìn)生長(zhǎng)[2-3]。也有研究報(bào)道原花青素可以促進(jìn)機(jī)體正常細(xì)胞生長(zhǎng)，如胃黏膜細(xì)胞[4]；可以降低脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA片段化及細(xì)胞膜微黏度，通過(guò)抗組胺作用來(lái)降低氧化應(yīng)激引起的胃腸道黏膜損傷[5]；對(duì)結(jié)直腸炎、結(jié)直腸癌有一定的防護(hù)作用[6]；長(zhǎng)期食用原花青素能夠緩解內(nèi)毒素對(duì)結(jié)腸屏障完整性的損傷和抑制胃腸道對(duì)內(nèi)毒素的吸收[7]；可以減輕機(jī)體炎癥腫脹，抑制細(xì)胞因子IL-6和TNF-α誘導(dǎo)的血管細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)水平[8]。另外，原花青素對(duì)瘤胃發(fā)酵、微生物區(qū)系也有一定的調(diào)控作用[9-10]。杜宇等[11]研究發(fā)現(xiàn)在體外建立的亞急性瘤胃酸中毒模型中添加4.5%石榴多酚可以提高發(fā)酵液pH，降低發(fā)酵液中揮發(fā)性脂肪酸（VFA）、內(nèi)毒素（LPS）和組胺濃度，同時(shí)降低牛鏈球菌數(shù)量和乳酸濃度。郭長(zhǎng)征等[12]研究表明高精料飼糧中添加另一種多羥基黃酮類(lèi)化合物（槲皮素）可以提高山羊瘤胃 pH，提高血清抗氧化能力，但有關(guān)植物多酚對(duì)瘤胃組織抗氧化和抗炎能力的影響及機(jī)制的研究較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于高精料飼糧對(duì)動(dòng)物瘤胃、機(jī)體的危害及原花青素抗氧化、抗炎的生物學(xué)功能，本研究提出適宜劑量的葡萄籽原花青素可以通過(guò)調(diào)控瘤胃發(fā)酵和改善機(jī)體抗氧化能力而減輕機(jī)體氧化損傷的假設(shè)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)研究了高精料飼糧條件下，添加不同水平葡萄籽原花青素（GSPs）對(duì)羔羊生長(zhǎng)性能、瘤胃發(fā)酵、瘤胃及血清炎癥因子及抗氧化能力的影響，為葡萄籽原花青素在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

葡萄籽原花青素購(gòu)自南京澤朗生物科技有限公司，純度≥96%。

試驗(yàn)選用48只體重相近（22.75±1.20 kg）、月齡相近的杜泊×小尾寒羊雜交公羔，采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將48只羔羊隨機(jī)分為4組，每組12只?；A(chǔ)飼糧精粗比為70:30，GSPs添加量分別為0（對(duì)照組，CON）、10（10GSPs）、20（20GSPs）、40（40GSPs）mg·kg-1BW。預(yù)飼15 d，飼糧精粗比從4∶6逐漸過(guò)渡到7∶3，正試期45d。正試期每日晨飼前，用分析天平稱(chēng)取每日每只羊 GSPs飼喂量，與 100 g粉狀飼糧混合后，逐只一次性飼喂，以保證完全攝入，GSPs的飼喂量每周根據(jù)體重調(diào)整一次。試驗(yàn)羔羊全部單欄（3.0 m×0.8 m）飼養(yǎng)，飼糧采用全混合顆粒飼料，每天飼喂2次（07:00和19:00），自由采食，自由飲水。試驗(yàn)羊舍通風(fēng)良好，平均溫度23.7℃，平均相對(duì)濕度59%，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient level of diets (dry matter basis, %)

1.2 樣品采集

正試期第一天早6:00對(duì)所有試驗(yàn)羊空腹稱(chēng)重，作為初始體重，之后每隔15 d稱(chēng)重一次，記錄體重?cái)?shù)據(jù)。試驗(yàn)期間記錄每只羊的日采食量、剩料量，正試期結(jié)束后計(jì)算平均日增重（ADG）、平均日采食量（AFDI）及料重比（F/G）。正試期第45天晨飼前頸靜脈采血，常規(guī)方法分離血清后-20℃保存待測(cè)。

正試期結(jié)束當(dāng)天18:00，每組隨機(jī)選擇6只禁食、禁水12 h，次日6:00進(jìn)行屠宰。采集瘤胃背囊組織，迅速用磷酸緩沖鹽溶液反復(fù)清洗，剪碎后立即置于液氮中速凍保存，采樣結(jié)束后放于-80℃保存。

正試期結(jié)束后連續(xù)3 d通過(guò)口腔采集每組剩余6只羊的瘤胃液，分別于飼喂后1、3、4、6、8、12 h通過(guò)口腔采集瘤胃液（每天采2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，第一天：8:00、13:00，第二天：10:00、15:00，第三天：11:00、19:00），棄掉初始采集含有較多黏液的部分，立即測(cè)定瘤胃液pH；同時(shí)分裝樣品于-20℃保存待測(cè)瘤胃發(fā)酵指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

瘤胃組織和血清抗氧化能力測(cè)定所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，具體指標(biāo)包括總抗氧化能力（T-AOC）、SOD、過(guò)氧化氫酶（CAT）、GSH-Px、MDA。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定瘤胃組織及血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量，ELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

飼喂后3 h的瘤胃液樣品用于測(cè)定VFA和LPS濃度。VFA濃度測(cè)定采用氣相色譜法，具體操作參照嚴(yán)淑紅等[13]的方法。使用顯色基質(zhì)鱟試劑盒（廈門(mén)鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司）測(cè)定瘤胃液和血清中的LPS濃度[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010版進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)初步整理，采用SAS 9.2軟件中 one-way ANOVE進(jìn)行分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，通過(guò)正交多項(xiàng)式分析處理的線(xiàn)性和二次效應(yīng)。P＜0.05表示為差異顯著，P＜0.10表示有顯著的趨勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)性能

羔羊生長(zhǎng)性能數(shù)據(jù)已發(fā)表[15]，具體見(jiàn)表 2，試驗(yàn)羔羊的初始體重相近，但飼糧中添加不同水平 GSPs后羔羊末重（P=0.039）、ADG（P=0.005）、ADFI（P=0.001）呈二次方效應(yīng)，其中 10GSPs和 20GSPs組的末體重顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），與 40GSPs差異不顯著（P＞0.05）；10GSPs和20GSPs組ADG和ADFI顯著高于對(duì)照組和40GSPs組（P＜0.05），而40GSPs組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。飼糧中添加GSPs對(duì)料重比沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。

表2 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對(duì)羔羊生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on growth performance of lambs

2.2 瘤胃pH和揮發(fā)性脂肪酸

由表3可知，與對(duì)照組相比，添加GSPs對(duì)瘤胃pH有一定的調(diào)控作用。飼喂后3、8、12 h瘤胃pH隨GSPs的添加線(xiàn)性升高，20GSPs和40GSPs組瘤胃pH顯著高于對(duì)照組和10GSPs組（P＜0.05）。飼喂后4 h瘤胃液 pH較對(duì)照組有線(xiàn)性升高趨勢(shì)，但差異不顯著（P=0.057）。

表3 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對(duì)羔羊瘤胃pH的影響Table 3 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on rumen fluid pH of lambs

從表4可見(jiàn)，飼糧中添加GSPs后羔羊采食后3 h瘤胃液中乙酸（P=0.058）和丁酸（P=0.064）濃度有降低的趨勢(shì)，對(duì)丙酸、異戊酸和戊酸濃度沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。40GSPs組異丁酸濃度顯著高于對(duì)照組和10GSPs組（P＜0.05），與20GSPs組差異不顯著（P＞0.05）。隨著GSPs添加量的增加，總揮發(fā)性脂肪酸濃度有線(xiàn)性下降的趨勢(shì)（P=0.062）。飼糧中添加GSPs對(duì)乙酸/丙酸值沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。

表4 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對(duì)羔羊飼喂后3 h瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響Table 4 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on rumen VFA after feeding 3 hours of lambs

2.3 瘤胃液和血清內(nèi)毒素含量

由表5可見(jiàn)，高精料飼糧中添加GSPs瘤胃液LPS含量的呈線(xiàn)性和二次方下降趨勢(shì)，其中 20GSPs數(shù)值最低，但差異不顯著（P=0.076）；20GSPs和40GSPs組血清LPS濃度較對(duì)照組和10GSPs組顯著降低（P＜0.0001）。

表5 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對(duì)羔羊飼喂后3 h瘤胃液脂多糖含量的影響Table 5 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on rumen LPS content after feeding 3 hours of lambs

2.4 瘤胃和血清抗氧化能力

由表6可見(jiàn)，高精料飼糧中添加GSPs線(xiàn)性提高了瘤胃GSH-Px活性，線(xiàn)性降低瘤胃組織MDA水平（P＜0.05）。20GSPs和40GSPs組GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組和10GSPs組，MDA含量顯著低于對(duì)照組和 10GSPs組（P＜0.05）。對(duì)于血清抗氧化指標(biāo)，20GSPs和 40GSPs組 SOD活性顯著高于對(duì)照組，GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組和10GSPs組（P＜0.05）。添加GSPs有線(xiàn)性降低血清MDA（P=0.059）和提高T-AOC（P=0.060）的趨勢(shì)。

表6 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對(duì)羔羊瘤胃和血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on rumen and serum antioxidant indicators of lambs

2.5 瘤胃和血清炎性因子水平

由表7可見(jiàn)，飼糧中添加GSPs對(duì)瘤胃組織炎癥因子水平?jīng)]有顯著影響，但有降低IL-6和IL-10的趨勢(shì)（P≤0.061）。20GSPs和40GSPs組血清TNF-α水平顯著低于對(duì)照組和10GSPs組（P＜0.05），IL-6水平有降低的趨勢(shì)，但差異不顯著（P=0.074）；40GSPs組血清 IL-10含量顯著低于對(duì)照組，與 10GSPs和20GSPs組差異不顯著（P＞0.05）。

表7 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對(duì)羔羊瘤胃和血清炎癥因子的影響Table 7 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on rumen and serum inflammatory factors of lambs

3 討論

原花青素是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，是一類(lèi)植物多酚類(lèi)化合物。葡萄籽原花青素主要存在于葡萄籽、葡萄皮和梗部，是一類(lèi)重要的天然抗氧化劑。研究表明，原花青素類(lèi)植物多酚在提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、免疫功能、抗氧化能力等方面發(fā)揮著重要作用，但高濃度的植物多酚可能會(huì)抑制動(dòng)物采食量，擾亂消化生理，抑制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和機(jī)體生長(zhǎng)[16-19]。趙家奇等[18]研究發(fā)現(xiàn)在斷奶仔豬飼糧中葡萄籽原花青素可以顯著提高仔豬血清免疫球蛋白和補(bǔ)體含量，提高血清抗氧化酶活性，說(shuō)明原花青素可以提高斷奶仔豬免疫力和抗氧化能力。在高溫?zé)釕?yīng)激條件下，飼糧中添加板栗多酚可以顯著提高肉雞日增重和采食量，提高肉雞抗氧化能力、緩解高溫?zé)釕?yīng)激[20]。金亞倩等[21]在綿羊飼料中添加葡萄渣，試驗(yàn)結(jié)果表明10%葡萄渣添加組較對(duì)照組日增重提高38%，可能是葡萄皮渣中的主要活性物質(zhì)原花青素發(fā)揮了生物學(xué)功能，這與本試驗(yàn)得到的結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，GSPs改善羔羊生長(zhǎng)性能，一方面原因可能是 GSPs改善了機(jī)體抗氧化能力和免疫力，進(jìn)而提高生長(zhǎng)性能；另一方面原因可能與多酚類(lèi)物質(zhì)降低飼糧蛋白質(zhì)降解率、提高蛋白利用率有關(guān)[17]。有關(guān)飼糧中 GSPs水平對(duì)羔羊飼糧蛋白瘤胃降解率的影響還有待進(jìn)一步研究。40GSPs組采食量和日增重較另外兩個(gè) GSPs添加組低，可能與高劑量多酚類(lèi)物質(zhì)抑制瘤胃微生物（尤其是纖維分解菌），降低飼料消化率有關(guān)[22-23]。楊德蓮等[9]研究也表明葡萄籽原花青素能夠顯著降低奶牛瘤胃體外發(fā)酵液中溶纖維丁酸弧菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量，降低體外發(fā)酵產(chǎn)氣量。本試驗(yàn)中 GSPs對(duì)羔羊瘤胃微生物區(qū)系的影響還需進(jìn)一步深入研究。

反芻動(dòng)物長(zhǎng)期采食高精料飼糧會(huì)導(dǎo)致瘤胃和后腸道pH下降和VFA積累，導(dǎo)致微生物代謝紊亂，從而產(chǎn)生大量的細(xì)菌內(nèi)毒素。當(dāng)瘤胃pH低于5.8，且持續(xù)時(shí)間大于3 h，則被認(rèn)為發(fā)生了亞急性瘤胃酸中毒。本試驗(yàn)中各處理組瘤胃液 pH在采食后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定結(jié)果均高于5.8（除3 h對(duì)照組為5.80，10GSPs為5.79），提示試驗(yàn)羔羊尚未處于亞急性瘤胃酸中毒狀態(tài)。但由于本試驗(yàn)中瘤胃液pH是通過(guò)口腔插管采集，可能對(duì)試驗(yàn)羊食道產(chǎn)生一定的刺激，影響了采食量，從而影響瘤胃pH。對(duì)照組和10GSPs組各時(shí)間點(diǎn)瘤胃pH低于6.2，添加20和40 mg·kg-1BW的GSPs可以在一定程度上提高瘤胃液pH，這與楊德蓮等[9,11]的研究結(jié)果相一致。瘤胃 pH升高有利于提高羔羊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率和日增重。研究表明在體外亞急性瘤胃酸中毒模型中添加石榴皮多酚提取物可以顯著抑制瘤胃液中牛鏈球菌的生長(zhǎng)和繁殖[11]；在高精料飼糧中添加槲皮素可以提高山羊瘤胃pH和血清抗氧化酶活性，緩解亞急性瘤胃酸中毒[12]；在高精料飼糧中添加植物多酚和精油混合物，瘤胃pH低于5.6的時(shí)間較不添加組顯著降低（18 min和199 min）[24]。本試驗(yàn)中，添加GSPs有降低乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的趨勢(shì)，可能是 GSPs對(duì)纖維分解菌有一定的抑制作用所致。杜宇等[10]的研究中石榴多酚對(duì)乙酸和丙酸均有顯著的抑制作用，而本試驗(yàn)中丙酸濃度的降低沒(méi)有達(dá)到顯著水平，可能是添加劑量不同所致。前人研究也表明，單寧對(duì)瘤胃中溶纖維丁酸弧菌有顯著的抑制作用[25]，而乙酸和丁酸是溶纖維丁酸弧菌的主要代謝物，因此添加 GSPs后瘤胃液中丁酸濃度有所下降。GETACHEW等[26]報(bào)道，多酚可能通過(guò)抑制微生物的氧化磷酸化而影響微生物代謝，或與微生物外源酶或底物結(jié)合而抑制底物降解，進(jìn)而抑制微生物發(fā)酵產(chǎn)酸。

高精料引起瘤胃和腸道后段pH下降，革蘭氏陰性菌崩解死亡釋放出大量的 LPS，LPS的積累導(dǎo)致瘤胃上皮和腸道黏膜屏障損傷，LPS通過(guò)損傷的屏障易位進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，從而啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，激活巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6[27]。本研究中添加GSPs后瘤胃液LPS濃度在數(shù)值上低于對(duì)照組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著差異。原因可能是GSPs對(duì)瘤胃pH的輕微調(diào)控作用尚且沒(méi)有緩解不耐酸革蘭氏陰性菌的死亡。但添加GSPs后血清LPS濃度顯著降低，說(shuō)明GSPs提高了肝臟清除LPS的能力。眾多研究表明原花青素可以緩解多種因素導(dǎo)致的肝損傷，提高肝功能[28-29]。本團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步深入研究高精料飼糧中添加GSPs對(duì)羔羊肝功能的影響。

高精料可能導(dǎo)致反芻動(dòng)物體內(nèi)氧化和抗氧化作用失衡，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[1,30]。機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥的發(fā)生往往是伴隨發(fā)生，且促炎細(xì)胞因子的過(guò)表達(dá)正反饋促進(jìn)氧化應(yīng)激[31]。植物多酚能夠有效清除機(jī)體內(nèi)多余的自由基，在抗氧化和抗炎方面有重要作用。DESCALZO等[32]報(bào)道，新鮮牧草中植物多酚含量較高，因此放牧牛體內(nèi)抗氧化物質(zhì)含量較舍飼牛更高，機(jī)體抗氧化能力、免疫力更強(qiáng)。GSPs具有很強(qiáng)的抗氧化和抗炎能力，是一種良好的外源性抗氧化劑。宿孝奇[33]研究表明 GSPs可以顯著提高泌乳早期奶牛機(jī)體抗氧化能力，降低血液中氧化代謝產(chǎn)物和酮體的含量。LI等[34]研究表明 GSPs可以有效緩解由三硝基苯磺酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠急性結(jié)腸炎，主要是通過(guò)下調(diào)某些炎癥介質(zhì)而起抗炎作用，能夠有效抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制機(jī)體的氧化損傷，減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，同時(shí)通過(guò)提高氧化損傷組織的修復(fù)能力，增加抗炎細(xì)胞因子分泌而發(fā)揮作用。GSPs能夠調(diào)節(jié)仔豬腸道黏膜NF-κB和Nrf2的活性，抑制仔豬腸道炎癥[35]，提高母豬腸道有益菌比例[36]，抑制促炎因子TNF-α、IL-1β等的釋放，有效抑制機(jī)體炎癥持續(xù)發(fā)生[37]。DE NARDI等[24]研究發(fā)現(xiàn)植物多酚和精油混合物通過(guò)顯著降低高谷物飼糧條件下母牛血清淀粉樣蛋白A和LPS結(jié)合蛋白水平，緩解機(jī)體炎癥反應(yīng)，但對(duì)血清IL-6含量無(wú)顯著影響。本試驗(yàn)中，添加20和40 mg·kg-1BW的GSPs顯著提高了瘤胃組織和血清抗氧化酶活性，降低了MDA含量，同時(shí)降低了血清炎癥因子TNF-α和IL-10的水平，對(duì)瘤胃組織也有類(lèi)似的作用趨勢(shì)，說(shuō)明添加適量 GSPs后羔羊機(jī)體抗氧化能力有所提高，對(duì)高精料所致的瘤胃及全身炎癥也有緩解的潛力。

4 結(jié)論

高精料飼糧條件下，飼喂適量葡萄籽原花青素可以提高羔羊瘤胃 pH，提高血清和瘤胃組織抗氧化能力，降低血清促炎因子水平，提高羔羊采食量和日增重，對(duì)羔羊健康具有潛在的保護(hù)效應(yīng)。在本試驗(yàn)條件下，葡萄籽原花青素的最佳飼喂量為20 mg·kg-1BW。