新冠病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室核酸污染監(jiān)測(cè)及排除

段 植，王 琴，張 浩，周 強(qiáng)

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 合肥 230601）

截至2021年8月新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）已席卷212個(gè)國(guó)家，全球累計(jì)確診超過(guò)兩億 人，死亡超過(guò)400萬(wàn) 人，其主要傳播途徑經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播[1]。對(duì)于中國(guó)來(lái)說(shuō)最近幾次的區(qū)域性疫情表明無(wú)癥狀感染者成為了疫情傳播和反彈的焦點(diǎn)[2]。而針對(duì)于此最有效的方式是進(jìn)行新冠核酸檢測(cè)。目前來(lái)說(shuō)臨床上使用最廣泛和技術(shù)較成熟的新冠核酸檢測(cè)方法是實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2核酸過(guò)程中將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行跟蹤并進(jìn)行產(chǎn)物分析[3]。盡管PCR技術(shù)有很多的優(yōu)點(diǎn)，但是由于其超高的靈敏度，一旦出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室核酸污染，很容易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性[4]。本文結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展新冠核酸檢測(cè)時(shí)遇到的實(shí)驗(yàn)室污染問(wèn)題，進(jìn)行的一系列環(huán)境消毒監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行總結(jié)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)室概況 新冠實(shí)驗(yàn)室為負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)區(qū)分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、核酸提取區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)3個(gè)區(qū)，各區(qū)之間試劑、樣本等以相應(yīng)的傳遞窗單向傳遞，另外還有樣本接收區(qū)和消毒區(qū)等。

1.2 試驗(yàn)材料 圣湘Natch 96全自動(dòng)核酸提取儀、ABI QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、微米一次性病毒采樣管（WM-1）及采樣拭子、圣湘新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒。

1.3 環(huán)境監(jiān)測(cè)樣本的采集和處理

1.3.1 采樣點(diǎn)設(shè)置：結(jié)合新冠實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境以及工作流程，選取樣本接收、核酸提取、樣本擴(kuò)增以及廢棄物處理等高風(fēng)險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)區(qū)域?yàn)椴蓸訉?duì)象，具體采樣信息見(jiàn)表1。

1.3.2 采樣方法：采用空氣沉降法和表面擦拭法，分別對(duì)上述各采樣點(diǎn)進(jìn)行采樣?？諝獬两捣ㄈ樱涸诟鞑蓸狱c(diǎn)放置1 個(gè)樣本管，每管3 mL生理鹽水暴露放置6～12 h后進(jìn)行核酸檢測(cè)；物體表面擦拭法采樣：參考WHO推薦的方法，拭子充分浸潤(rùn)病毒保存液后表面重復(fù)涂抹、并將拭子放回采樣管進(jìn)行浸潤(rùn)，取出后再次涂抹采樣，重復(fù)3 次以上。對(duì)表面較大的物體進(jìn)行多點(diǎn)分布式采樣[5]。

1.4 檢測(cè)方法 此次實(shí)驗(yàn)室污染是以生理鹽水作為陰性質(zhì)控出現(xiàn)內(nèi)對(duì)照陽(yáng)性后停止臨床樣本檢測(cè)，進(jìn)行環(huán)境以及物體表面采樣后，采用圣湘Natch 96全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行病毒RNA的提取，提取產(chǎn)物用圣湘新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒在ABI QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測(cè)新冠實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及物表樣本。每次監(jiān)測(cè)試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行空氣以及物體表面消毒并每隔6～12 h再次消毒，于第二天再次進(jìn)行采樣監(jiān)測(cè)分析污染情況。

1.5 空氣以及污染部位的消毒方法 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣在負(fù)壓正常且無(wú)人條件下用過(guò)氧乙酸消毒劑，采用超低容量噴霧法進(jìn)行消毒，郭靈安等[6]的研究表明再用可移動(dòng)紫外推車配合實(shí)驗(yàn)室頂部紫外燈進(jìn)行照射過(guò)夜會(huì)有更好的效果。物體表面應(yīng)先清除污染物再進(jìn)行消毒，用有效氯1 000 mg/L的含氯消毒液進(jìn)行噴灑、擦拭或浸泡消毒，作用30 min后清水擦拭干凈[7]。

1.6 污染清除的驗(yàn)證方法 根據(jù)表1進(jìn)行環(huán)境以及物體表面采樣、4 個(gè)陰性樣本和1 個(gè)弱陽(yáng)性質(zhì)控一起進(jìn)行提取、擴(kuò)增。環(huán)境和物體表面監(jiān)測(cè)結(jié)果靶基因以及內(nèi)參基因陰性，陰性樣本靶基因陰性、內(nèi)參基因陽(yáng)性，弱陽(yáng)性質(zhì)控靶基因和內(nèi)參基因均陽(yáng)性則表示在控。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境靶基因RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 此次檢測(cè)的基因?yàn)閮蓚€(gè)靶基因ORF1ab基因和N基因。環(huán)境監(jiān)測(cè)每天進(jìn)行檢測(cè)，分析發(fā)現(xiàn)靶基因在部分監(jiān)測(cè)點(diǎn)檢出陽(yáng)性，其中以門把手、擴(kuò)增儀等高頻次接觸的物體表面出現(xiàn)污染較常見(jiàn)，這和Lv等[8]對(duì)核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室物體表面殘留物的研究結(jié)果基本相符，Ct值均較大，熒光強(qiáng)度值較低，隨著每天消毒的規(guī)律進(jìn)行，較快轉(zhuǎn)為陰性（見(jiàn)表1）。

表1 新冠實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及物體表面檢測(cè)結(jié)果

2.2 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境內(nèi)參檢測(cè)結(jié)果 環(huán)境監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因污染較嚴(yán)重，初次環(huán)境監(jiān)測(cè)采樣幾乎各實(shí)驗(yàn)區(qū)域均能檢測(cè)出內(nèi)參（見(jiàn)表1）。對(duì)其中內(nèi)參污染嚴(yán)重的監(jiān)測(cè)點(diǎn)（擴(kuò)增區(qū)門把手，PCR儀內(nèi)，消毒間門把手等）進(jìn)行規(guī)律消毒，連續(xù)監(jiān)測(cè)內(nèi)參Ct值的動(dòng)態(tài)變化（見(jiàn)圖1，圖2）。隨著每天進(jìn)行規(guī)律多次消毒，內(nèi)參污染漸漸好轉(zhuǎn)，但持續(xù)周期較長(zhǎng)。其中，擴(kuò)增區(qū)門把手等污染較嚴(yán)重區(qū)域經(jīng)過(guò)多次消毒，內(nèi)參Ct值呈持續(xù)升高趨勢(shì)，說(shuō)明核酸濃度逐漸稀釋，持續(xù)5 d左右，內(nèi)參檢測(cè)結(jié)果均顯示no Ct，即轉(zhuǎn)為陰性。因新冠核酸擴(kuò)增試劑擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為45，將內(nèi)參檢測(cè)結(jié)果陰性的默認(rèn)Ct值設(shè)為45。

圖1 內(nèi)參污染較嚴(yán)重區(qū)域（接收區(qū)地面，消毒間門把手，PCR儀內(nèi)，擴(kuò)增區(qū)門把手）的內(nèi)參監(jiān)測(cè)Ct值

圖2 內(nèi)參污染較嚴(yán)重區(qū)域（接收區(qū)地面，消毒間門把手，PCR儀內(nèi)，擴(kuò)增區(qū)門把手）的內(nèi)參監(jiān)測(cè)Ct值的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)

2.3 污染清除的驗(yàn)證結(jié)果 環(huán)境和物體表面監(jiān)測(cè)結(jié)果靶基因（ORF1ab和N基因）以及內(nèi)參基因陰性，陰性樣本靶基因陰性、內(nèi)參基因陽(yáng)性，弱陽(yáng)性質(zhì)控靶基因和內(nèi)參基因均陽(yáng)性表明實(shí)驗(yàn)室核酸污染清除，具體曲線見(jiàn)圖3、圖4、圖5，實(shí)驗(yàn)室可正常進(jìn)行臨床樣本檢測(cè)[9]。

圖3 經(jīng)5 d消毒后的環(huán)境以及物體表面監(jiān)測(cè)、陰性樣本ORF1ab基因陰性，弱陽(yáng)性質(zhì)控ORF1ab基因在控

圖4 經(jīng)5 d消毒后環(huán)境以及物體表面監(jiān)測(cè)、陰性樣本N基因陰性，弱陽(yáng)性質(zhì)控N基因在控

圖5 經(jīng)5 d消毒后環(huán)境以及物體表面監(jiān)測(cè)內(nèi)參基因均為陰性，4 個(gè)陰性樣本、1 個(gè)弱陽(yáng)性質(zhì)控內(nèi)參基因在控

3 討論

靶基因ORF1ab基因和N基因污染原因分析：新冠實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)靶基因陽(yáng)性污染并非一定是臨床陽(yáng)性標(biāo)本污染導(dǎo)致，更多的可能是新冠病毒核酸片段導(dǎo)致，可能來(lái)源于陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增產(chǎn)物片段。以本實(shí)驗(yàn)室為例，近期并未檢測(cè)出新冠核酸陽(yáng)性的臨床標(biāo)本，分析原因可能為：(1)陽(yáng)性質(zhì)控品對(duì)樣本的污染：陽(yáng)性質(zhì)控品和臨床樣本一同使用磁珠法進(jìn)行提取，而在磁珠法提取過(guò)程中很容易造成陽(yáng)性質(zhì)控品氣溶膠溢出污染其他臨床樣本甚至于污染核酸提取儀。故實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步選用濃度較低的弱陽(yáng)性質(zhì)控[7]。(2)提取以及擴(kuò)增產(chǎn)物的不合理處理：新冠核酸樣本以及質(zhì)控品的提取產(chǎn)物尤其是擴(kuò)增產(chǎn)物一旦進(jìn)行高壓處理很容易造成整個(gè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的污染。(3)加樣槍以及耗材造成的靶基因污染：陽(yáng)性質(zhì)控品加樣槍不能混用，一旦陽(yáng)性質(zhì)控品加樣槍受到污染會(huì)造成標(biāo)本大范圍污染，所以質(zhì)控品加樣槍應(yīng)和普通臨床樣本加樣槍做好標(biāo)記，分開(kāi)使用。而耗材盡量選用一次性耗材且以小包裝為宜。

內(nèi)參基因污染原因分析：圣湘新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒采用的是內(nèi)源性內(nèi)參RNase P，日常檢測(cè)的臨床樣本大多為內(nèi)參陽(yáng)性，因此內(nèi)參污染的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2019-nCov靶核酸。如果內(nèi)參污染，將失去對(duì)標(biāo)本采集、核酸提取和擴(kuò)增過(guò)程的監(jiān)測(cè)作用[10]。因此我實(shí)驗(yàn)室在日常檢測(cè)中是通過(guò)檢測(cè)不含內(nèi)對(duì)照的陰性質(zhì)控品如生理鹽水以監(jiān)測(cè)內(nèi)對(duì)照污染的發(fā)生情況。(1)新冠實(shí)驗(yàn)室醫(yī)療廢物的不合理處理：提取產(chǎn)物尤其是擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高壓處理會(huì)造成內(nèi)參基因外溢，造成整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的污染，此種內(nèi)參污染最為常見(jiàn)。(2)加樣槍以及耗材造成的內(nèi)參污染：新冠實(shí)驗(yàn)室需盡量使用一次性耗材，比如使用商品化盒裝的槍頭，小包裝的八連管耗材。而加樣槍因?yàn)槊刻煲幚泶罅康男鹿谂R床樣本，一旦加樣槍在使用過(guò)程中出現(xiàn)污染將會(huì)導(dǎo)致樣本的大范圍污染。

本實(shí)驗(yàn)室定期進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)且之前極少出現(xiàn)靶基因和內(nèi)參基因污染的情況，此次發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室污染尤其是內(nèi)參污染嚴(yán)重，而消毒間的環(huán)境和物體表面監(jiān)測(cè)結(jié)果熒光強(qiáng)度值最高。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)是由于處理醫(yī)療廢物時(shí)誤將擴(kuò)增產(chǎn)物高壓導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)大面積的內(nèi)參基因污染。

在低風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，因新冠核酸檢測(cè)靶基因陽(yáng)性率很低，因此對(duì)于實(shí)驗(yàn)室污染的監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)內(nèi)參污染就顯得尤為重要。新冠實(shí)驗(yàn)室的污染重在預(yù)防，而且內(nèi)參污染更為常見(jiàn)且容易被臨床實(shí)驗(yàn)室忽略。實(shí)驗(yàn)室不僅要制定科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)室相關(guān)制度、程序、操作規(guī)程，而且要做到定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行監(jiān)控，尤其是對(duì)潛在污染區(qū)的管理，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和清除污染，保證實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)質(zhì)量。而一旦出現(xiàn)新冠實(shí)驗(yàn)室污染的情況，應(yīng)立即暫停臨床樣本檢測(cè)，待污染清除驗(yàn)證通過(guò)后方能進(jìn)行正常實(shí)驗(yàn)。