狂犬病病毒M 蛋白胞內(nèi)合成和分布初步研究

趙維榮，趙銘昕，徐 婧，張丹瑋，郭藝迪，關(guān)振宏，段 銘，張茂林

（1.吉林大學(xué)人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062）

【研究意義】狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一種古老的、以神經(jīng)系統(tǒng)感染為特征的人獸共患病毒性傳染病［1］。該病一直是公共衛(wèi)生關(guān)注的重點(diǎn)，感染者一旦發(fā)病，死亡率可近乎達(dá)到100%［2］，迄今為止尚無(wú)有效的治療方法。目前該病主要流行于亞洲和非洲，其中印度和中國(guó)較為嚴(yán)重［3］。RABV 典型的病毒粒子呈子彈狀，基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，大小約12 kb，沿3′端向5′端依次編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和依賴RNA 的RNA 聚合酶蛋白（L）。基因組RNA 與N、P、L 蛋白共同形成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP），也稱核衣殼，是病毒轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制的功能性模板［4-6］。M 蛋白位于RABV囊膜下，連接RNP 和保護(hù)性抗原G，在RNP 和含糖蛋白囊膜之間起橋梁作用［7］。了解M 蛋白的合成分布場(chǎng)所有利于解析RABV 病毒粒子的裝配過(guò)程。

【前人研究進(jìn)展】M 蛋白由202 個(gè)氨基酸組成，是RABV 結(jié)構(gòu)蛋白中長(zhǎng)度最小的一種蛋白。已有研究表明，M 蛋白在細(xì)胞膜上的聚集可以增加其對(duì)脂質(zhì)雙分子層的結(jié)合親和力，在膜曲率、RNPs 包膜和病毒出芽中發(fā)揮重要作用，并且在調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白合成及裝配的動(dòng)態(tài)平衡中也起重要作用，同時(shí)對(duì)于RABV 致病性及子代病毒粒子的形態(tài)發(fā)生也至關(guān)重要［8-9］。在RABV 5 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白中，N 蛋白、P 蛋白和L 蛋白主要在胞質(zhì)內(nèi)基氏小體中合成，G 蛋白主要通過(guò)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）翻譯和高爾基體（Golgi）加工，最后到達(dá)出芽部位［10-11］。對(duì)于M 蛋白的研究更多集中在其作用上，而對(duì)于其合成和分布場(chǎng)所的研究則相對(duì)較少。

【本研究切入點(diǎn)】研究M 蛋白合成和分布場(chǎng)所是揭示RABV 病毒粒子轉(zhuǎn)配過(guò)程中M 蛋白、G 蛋白和RNP 三者間結(jié)合順序的關(guān)鍵?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究首先利用TCID50法對(duì)3 種RABV 毒株（CVS-11、SRV-9、PB4）在N2A、BHK 細(xì)胞上的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，隨后分別接種N2A、BHK 細(xì)胞，利用免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡觀察RABV M 蛋白與ER 和Golgi 在胞內(nèi)共定位以及M 蛋白與G 蛋白、M 蛋白與N 蛋白在這兩種細(xì)胞器內(nèi)的共定位，研究結(jié)果可望推斷M蛋白的合成加工途徑以及G 蛋白、M 蛋白和RNP三者的組裝順序，為RABV 粒子的復(fù)制與裝配過(guò)程的解析提供有力證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞與毒株 小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2A、乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK 由吉林大學(xué)人獸共患病研究所病毒病研究室保存并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。RABV 的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-11、口服疫苗毒株SRV-9由吉林大學(xué)人獸共患病研究所病毒病研究室保存，街毒株P(guān)B4 由長(zhǎng)春軍事獸醫(yī)研究所OIE 狂犬病參考實(shí)驗(yàn)室涂長(zhǎng)春研究員惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白抗體〔Anti-Calnexin antibody produced in rabbit，Anti-Protein Disulfide Isomerase（MD-12）antibody produced in rabbit〕和高爾基體標(biāo)志蛋白抗體（Anti-ERGIC-53/p58 antibody produced in rabbit）購(gòu)自Sigma 公司；胎牛血清FBS 購(gòu)自Biological Industries 公司，青鏈霉素混合液、Hoechs 33258 染色液購(gòu)自Solarbio 公司；丙酮購(gòu)自北京化工廠；PBS 粉末試劑購(gòu)自Monad公司；伊文思蘭、Alexa FluorTM546 goat antirabbit antibody、Alexa FluorTM647 goat anti-mouse antibody 購(gòu)自Thermo 公司；多聚甲醛溶液購(gòu)自源葉生物公司；Triton X-100 購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin 購(gòu)自FUJIREBIO 公司；FITC Anti-RABV G 蛋白抗體、FITC Anti-RABV P 蛋白抗體由長(zhǎng)春軍事獸醫(yī)研究所扈榮良研究員惠贈(zèng)；鼠源抗RABV M 蛋白抗體由吉林大學(xué)人獸共患病研究所病毒病研究室制作并保存。96 孔板、24 孔板購(gòu)自Corning 公司；細(xì)胞爬片購(gòu)自NEST 公司；顯微鏡蓋玻片購(gòu)自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒培養(yǎng) 用T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)BHK 細(xì)胞至70%～80%時(shí)，按MOI=1 的量將CVS-11、SRV-9 接種于細(xì)胞瓶中，37℃下感作1 h 后棄去上清，加入含1% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，96 h 后置于-80℃并反復(fù)凍融3 次，4℃、1 000 r/min 離心10 min 取上清，分裝保存于-80℃。PB4 由4 周齡小鼠顱內(nèi)接種培養(yǎng)，待小鼠瀕死時(shí)無(wú)菌取鼠腦，加入含20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，組織細(xì)胞破碎儀充分破碎研磨后，4℃、1 000 r/min 離心10 min 取上清，分裝保存于-80℃。

1.2.2 TCID50法測(cè)定不同RABV 毒株效價(jià) 取96 孔板，將細(xì)胞以1×104個(gè)/孔鋪于孔板中，37℃培養(yǎng)12 h 待其貼壁后棄去上清，將病毒液用含1%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基按10-1～10-8倍比稀釋，4 個(gè)復(fù)孔，100 μL/孔。37℃培養(yǎng)48 h 后棄去上清，PBS 潤(rùn)洗1 次，在80%冷丙酮中室溫下固定30 min，PBS 潤(rùn)洗3 次，將FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin、伊文思藍(lán)均以1∶200 稀釋，每孔加入50 μL，37℃避光孵育1 h，PBS 清洗3 次，每次10 min，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光標(biāo)記的陽(yáng)性孔數(shù)并記錄，應(yīng)用Spearman-Karber 公式計(jì)算每種RABV 毒株的TCID50。

1.2.3 免疫熒光 將細(xì)胞爬片放進(jìn)24 孔板，將細(xì)胞以10×104/孔鋪于爬片上，37℃培養(yǎng)12 h 待其貼壁后棄去上清，PBS 潤(rùn)洗3 次，加入少量不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基，將CVS-11、SRV-9、PB4按MOI=1 進(jìn)行接毒并設(shè)置對(duì)照，置37℃感作1 h后棄去上清，PBS 潤(rùn)洗3 次，加入含1% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，CVS-11、SRV-9 于培養(yǎng)24 h 時(shí)收樣，PB4 于培養(yǎng)72 h 時(shí)收樣；4% PFA室溫固定25～30 min，0.1% Triton-X 100 室溫打孔10 min，10% FBS 室溫封閉2 h，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體標(biāo)志蛋白抗體作為一抗4℃過(guò)夜，其熒光二抗、抗RABV M 蛋白抗體及其熒光二抗、FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin、FITC Anti-RABV G 蛋白抗體、FITC Anti-RABV P 蛋白抗體均于37℃孵育1 h 即可，Hoechs 33258 染色液染核5 min，90%甘油封片并用錫紙包裹于4℃下保存，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同RABV 毒株在不同細(xì)胞上的效價(jià)

在進(jìn)行免疫熒光前，為準(zhǔn)確計(jì)算細(xì)胞接毒量，利用TCID50法測(cè)定CVS-11、SRV-9、PB4 毒株在N2A、BHK 細(xì)胞上的效價(jià)。結(jié)果顯示，CVS-11、SRV-9、PB4 毒株的效價(jià)有明顯差別，感染48 h 后CVS-11 的效價(jià)相對(duì)較高，SRV-9 的效價(jià)相對(duì)較低，PB4 是一種直接從感染小鼠腦中分離得到的街毒株，只感染N2A 細(xì)胞，感染72 h 后其效價(jià)依然很低（表1）。

表1 不同RABV 毒株在不同細(xì)胞上的效價(jià)Table 1 Titers of different RABV strains on different cells

2.2 不同RABV 毒株M 蛋白在不同細(xì)胞上與ER、Golgi 的共定位

2.2.1 不同RABV 毒株M 蛋白在N2A 細(xì)胞上與ER、Golgi 的共定位 為探究N2A 細(xì)胞中ER、Golgi 在RABV M 蛋白合成加工過(guò)程中的作用，結(jié)合不同RABV 株的感染特性，CVS-11、SRV-9于24 h 后進(jìn)行免疫熒光，PB4 于72 h 后進(jìn)行免疫熒光。通過(guò)激光共聚焦觀察顯示，在N2A 細(xì)胞中CVS-11、SRV-9、PB4 的M 蛋白與CNX、PDI 存在共定位，且共定位主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)（圖1、圖2）；與ERGIC-53 也存在共定位，且共定位也主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)（圖3），說(shuō)明在N2A 細(xì)胞中CVS-11、SRV-9、PB4 的M 蛋白是通過(guò)ERGolgi 途徑合成加工；不同的是CVS-11、SRV-9的M 蛋白在胞膜附近有大量表達(dá)，而PB4 的M蛋白在胞膜附近幾乎無(wú)表達(dá)，說(shuō)明CVS-11、SRV-9 的M 蛋白在24 h 后已到達(dá)細(xì)胞膜，而PB4的M蛋白即使在72 h后也很少出現(xiàn)在細(xì)胞膜附近。

圖1 N2A 細(xì)胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）、PB4（C）M 蛋白與ER 標(biāo)志蛋白CNX 的共定位Fig.1 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）, SRV-9（B）,PB4（C）with ER marker protein CNX in N2A cells

圖2 N2A 細(xì)胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）、PB4（C）M 蛋白與ER 標(biāo)志蛋白PDI 的共定位Fig.2 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）, SRV-9（B）,PB4（C）with ER marker protein PDI in N2A cells

2.2.2 不同RABV 毒株M 蛋白在BHK 細(xì)胞上與ER、Golgi 的共定位 在N2A 細(xì)胞內(nèi)共定位的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究不同RABV 毒株M 蛋白在BHK 細(xì)胞中的共定位情況。通過(guò)激光共聚焦觀察顯示，在BHK 細(xì)胞中CVS-11、SRV-9 的M 蛋白與CNX、PDI 存在共定位，且共定位主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)（圖4、圖5）；與ERGIC-53 也存在共定位，且共定位也主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)（圖6）；而且M蛋白在胞膜附近都有表達(dá)。這說(shuō)明在BHK 細(xì)胞中CVS-11、SRV-9 的M 蛋白是通過(guò)ER-Golgi 途徑合成加工，且CVS-11、SRV-9 的M 蛋白在24 h后都已到達(dá)細(xì)胞膜附近。

2.3 RABV 的M 蛋白與G 蛋白以及ER、Golgi的共定位（以CVS-11 感染N2A 細(xì)胞為例）

由前述結(jié)果可知，3 種RABV 毒株的M 蛋白通過(guò)ER-Golgi 途徑合成加工，G 蛋白與M 蛋白在細(xì)胞內(nèi)共定位，有利于解析RABV 部分結(jié)構(gòu)蛋白的加工及組裝。在N2A 細(xì)胞中以MOI=1的病毒量接種CVS-11，24 h 后進(jìn)行免疫熒光。通過(guò)激光共聚焦觀察顯示，CVS-11 的M 蛋白、G 蛋白與ER、Golgi 三者存在共定位（圖7），且三者共定位主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，在膜附近M蛋白與G 蛋白出現(xiàn)共定位，說(shuō)明CVS-11 的G蛋白也可能通過(guò)ER-Golgi 途徑合成加工，可能在Golgi 內(nèi)M 蛋白與G 蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜附近。

2.4 RABV 的M 蛋白與N 蛋白以及ER、Golgi的共定位（以SRV-9 感染BHK 細(xì)胞為例）

已有研究表明，N 蛋白以RNP 形式與G 蛋白和M 蛋白組裝成完整的RABV 粒子。在前述結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)研究M 蛋白和N 蛋白的共定位，探究M 蛋白與RNP 的結(jié)合先后順序。通過(guò)激光共聚焦顯示，在BHK 細(xì)胞中，SRV-9 的M 蛋白與ER、Golgi 有明顯共定位，這與前述結(jié)果相符，而N 蛋白與ER、Golgi 無(wú)明顯共定位；M 蛋白與N 蛋白的共定位主要在胞漿內(nèi)，且多出現(xiàn)在細(xì)胞膜附近（圖8 箭頭所示），提示病毒粒子可能處于出芽階段，同時(shí)也說(shuō)明M 蛋白與RNP 結(jié)合發(fā)生于細(xì)胞膜附近。

圖3 N2A 細(xì)胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）、PB4（C）M 蛋白與Golgi 標(biāo)志蛋白ERGIC-53 的共定位Fig.3 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）, SRV-9（B）,PB4（C）with Golgi marker protein ERGIC-53 in N2A cells

圖4 BHK 細(xì)胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）M 蛋白與ER 標(biāo)志蛋白CNX 的共定位Fig.4 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）,SRV-9（B）with ER marker protein CNX in BHK cells

圖5 BHK 細(xì)胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）M 蛋白與ER 標(biāo)志蛋白PDI 的共定位Fig.5 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）,SRV-9（B）with ER marker protein PDI in BHK cells

圖6 BHK 細(xì)胞中CVS-11（A）、SRV-9（B）M 蛋白與Golgi 標(biāo)志蛋白ERGIC-53 的共定位Fig.6 Co-localization of M proteins from CVS-11（A）,SRV-9（B）with Golgi marker protein ERGIC-53 in BHK cells

圖7 N2A 細(xì)胞中CVS-11 的M 蛋白、G 蛋白與ER、Golgi 的共定位Fig.7 Co-localization of M proteins and G proteins from CVS-11 with ER or Golgi in N2A cells

3 討論

狂犬病是由RABV 感染引起的一種以神經(jīng)系統(tǒng)障礙為特征的高度致死性人畜共患傳染?。?2］。M 蛋白是RABV 5 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白中氨基酸數(shù)量最小但變異卻最大的蛋白，在結(jié)構(gòu)蛋白的合成和裝配過(guò)程中起調(diào)控作用。ER 是真核細(xì)胞中最大的細(xì)胞器之一，呈扁平囊狀或小管狀。研究發(fā)現(xiàn)，許多分泌蛋白和膜蛋白都是由ER 合成；此外，ER還參與多種蛋白質(zhì)折疊、脂類和膽固醇合成等許多過(guò)程［13］。病毒在感染細(xì)胞的過(guò)程中也會(huì)利用ER 使其成為病毒與宿主細(xì)胞相互作用的核心［14］。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）表面附著大量核糖體，是胞內(nèi)多種蛋白的合成主要場(chǎng)所。Golgi 是細(xì)胞內(nèi)的中央膜結(jié)合細(xì)胞器，常位于細(xì)胞核附近，作為分泌通路的中心樞紐，接收來(lái)自ER 的蛋白質(zhì)并進(jìn)行加工修飾后，將它們輸出到其他內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，如內(nèi)體、溶酶體、質(zhì)膜和細(xì)胞外，以發(fā)揮各自功能［15］。Golgi 還可以作為許多病毒的膜支架，或者被病毒用作病毒工廠進(jìn)行病毒復(fù)制［16］。ER-Golgi 途徑是細(xì)胞中許多蛋白質(zhì)的合成加工場(chǎng)所，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)各自工作位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白都由ER-Golgi 途徑合成加工，例如，冠狀病毒（CoV）結(jié)構(gòu)蛋白M、S 和E 在ER 被合成，被折疊并包裝進(jìn)入COP Ⅱ形成的囊泡中，然后從特定的ER 出口位點(diǎn)出芽，隨后到達(dá)Golgi 被糖基化修飾［17,18］。丙型肝炎病毒（HCV）包膜糖蛋白在ER 中與載脂蛋白相互作用，形成HCV LVPs后以COP Ⅱ囊泡的形式運(yùn)輸?shù)紾olgi，通過(guò)Golgi分泌途徑最終出口［19］。水泡性口炎病毒（VSV）的糖蛋白G 也是通過(guò)ER-Golgi 途徑合成［20］。M蛋白作為RABV 結(jié)構(gòu)蛋白之一，在RABV 組裝過(guò)程中將RNP 與囊膜糖蛋白G 的C 端連接起來(lái)，是形成完整病毒粒子的關(guān)鍵，并決定了病毒粒子的毒力及下一級(jí)神經(jīng)元的感染。關(guān)于RABV 的M蛋白合成加工途徑的研究較少，我們猜測(cè)該蛋白也是通過(guò)ER-Golgi 途徑合成加工。RABV 在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、復(fù)制，合成所有結(jié)構(gòu)蛋白后便開始組裝新的病毒粒子，其基因組與N 蛋白、P 蛋白及L 蛋白共同形成RNP，但對(duì)于G 蛋白、M 蛋白及RNP 三者結(jié)合的先后順序還尚不清楚，它們?nèi)绾谓M裝成完整的RABV 粒子還需進(jìn)一步探究。為此，本研究應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡，發(fā)現(xiàn)在N2A、BHK 細(xì)胞中，3 種RABV 毒株（CVS-11、SRV-9、PB4）的M 蛋白均與ER、Golgi 存在共定位，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)RABV 的M 蛋白與G 蛋白在ER、Golgi 上共定位，而M 蛋白與N蛋白則在胞漿中共定位，說(shuō)明在體外傳代細(xì)胞中，RABV 的M 蛋白是通過(guò)ER-Golgi 途徑合成加工，且不同毒株在不同細(xì)胞系中的結(jié)果具有一致性。此外，在病毒粒子組裝過(guò)程中M 蛋白有可能先與G 蛋白結(jié)合，隨后與N 蛋白、P 蛋白和L 蛋白及RNA 形成的RNP 結(jié)合并出芽。本研究結(jié)果主要在體外傳代細(xì)胞中完成，關(guān)于RABV 的M 蛋白在體內(nèi)是否也存在同樣的合成加工途徑以及病毒粒子是否有同樣的裝配過(guò)程還有待進(jìn)一步探索，而RABV 的M 蛋白在ER-Golgi 途徑中的合成修飾過(guò)程仍未知，同時(shí)核衣殼RNP 的位置、數(shù)量及顆粒大小也是RABV 復(fù)制能力的體現(xiàn)，不同毒株間是否存在差異也將是后期研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

M 蛋白作為RABV 結(jié)構(gòu)蛋白之一，無(wú)論是在病毒的前期轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程還是后期裝配出芽過(guò)程都具有重要作用，因此對(duì)M 蛋白合成和分布場(chǎng)所的研究非常重要。本研究初步探究了不同RABV毒株M 蛋白在胞內(nèi)的合成和分布，發(fā)現(xiàn)RABV M蛋白在細(xì)胞內(nèi)主要通過(guò)ER-Golgi 途徑合成，并與G 蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜附近，隨后與RNP 結(jié)合，且不同RABV 毒株在不同細(xì)胞系中沒(méi)有明顯差異。