高效液相色譜法同時測定復(fù)方硫酸新霉素滴眼液中3種成分含量

趙 猛，李 玲

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222000）

復(fù)方硫酸新霉素滴眼液的主要適應(yīng)證為急、慢性結(jié)膜炎、角膜炎、鞏膜炎、葡萄膜炎、急性鞏膜炎、白內(nèi)障、青光眼、角膜移植術(shù)后，以及眼部機械性損傷或化學(xué)燒傷處理等，主成分包括硫酸新霉素、地塞米松磷酸鈉、肌苷等，處方中還加入了抑菌劑，以延長藥品保質(zhì)期。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定僅以硫酸新霉素和地塞米松磷酸鈉為指標(biāo)成分，且后者的測定方法為異煙肼比色法［1］，操作較煩瑣，雜質(zhì)干擾大；而對于抑菌劑類成分含量的控制，標(biāo)準(zhǔn)中也未涉及。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定復(fù)方硫酸新霉素滴眼液中肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉3種成分的含量［2-5］?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，包括Waters 2998 PDA檢測器和Empower色譜工作站（美國Waters公司）；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司，精度為十萬分之一）；KH-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為700W，頻率為40kHz）。

1.2 試藥

復(fù)方硫酸新霉素滴眼液（武漢五景藥業(yè)有限公司，批號分別為18080106，18120104，19040113）；肌苷對照品（批號為140669-201606，含量為98.6%），羥苯乙酯對照品（批號為100847-201604，含量為99.9%），地塞米松磷酸酯對照品（批號為101116-201803，含量為99.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，磷酸、三乙胺為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex GeminiC18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：1%三乙胺溶液［用磷酸調(diào)pH至（3.0±0.05），A］-甲醇（B），梯度洗脫（0～6 min時80%A，6～8 min時80%A→50%A，8～30 min時50%A）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：248 nm；柱溫：25℃；進樣量：50μL。

2.2 溶液制備

取肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸酯對照品各適量，精密稱定，置同一容量瓶中，加流動相制成質(zhì)量濃度分別為1 009.7，417.4，1 004.4μg／mL的混合對照品貯備溶液（地塞米松磷酸酯質(zhì)量折算為地塞米松磷酸鈉質(zhì)量）；精密移取1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻，即得混合對照品溶液。精密量取樣品1 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻，即得供試品溶液。按復(fù)方硫酸新霉素滴眼液處方和工藝制備缺肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2項下3種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果陰性對照品溶液色譜中，在與肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸酯對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項下混合對照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置20 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各50μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉進樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y1＝1.313 6×105X1-5.926 7×104（r1＝0.999 7），Y2＝2.277 8×105X2-7.274 6×104（r2＝0.999 5），Y3＝7.160 3×104X3-7.971 5×104（r3＝0.999 5）。結(jié)果表明，肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸 鈉 進 樣 量 在2.525～7.575μg、1.055～3.160μg、2.510～7.535μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉峰面積的RSD分別為0.29%，0.33%，0.44%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉峰面積的RSD分別為0.57%，0.46%，0.42%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密稱取樣品（批號為18080106）1mL，各6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉平均含量分別為937，283，982μg／mL，RSD分別為0.68%，0.94%，0.51%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為18080106）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，計算樣品含量，并與原標(biāo)準(zhǔn)方法測得的地塞米松磷酸鈉含量進行比較。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（μg／mL，n＝3）Tab.2 Content determination of three constituents in the samples（μg／mL，n＝3）

3 討論

預(yù)試驗中，參考文獻［6-8］，分別考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-1%三乙胺溶液為流動相時等度洗脫和梯度洗脫對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，采用甲醇-1%三乙胺溶液梯度洗脫體系，基線平穩(wěn)，各峰出峰時間適宜，且分離度較好，因此最終選擇甲醇-1%三乙胺溶液作為流動相，并優(yōu)化梯度洗脫程序。同時，考察了檢測波長分別為240，243，248，253 nm時的色譜圖，結(jié)果以248 nm為檢測波長時，各峰吸收強度適宜，分離度好。

眼用制劑中的抑菌劑是導(dǎo)致眼部不良反應(yīng)的重要因素［9-10］，長期使用該類眼用制劑可能損害眼部健康，因此控制眼用制劑中抑菌劑的含量對于減少用藥風(fēng)險具有重要意義。本研究中采用HPLC法對地塞米松磷酸鈉含量進行測定，與原標(biāo)準(zhǔn)中異煙肼比色法測定的地塞米松磷酸鈉含量相比，結(jié)果準(zhǔn)確度相當(dāng)，且增加了對肌苷和抑菌劑羥苯乙酯的含量測定，方法簡便，其他組分干擾小，精密度、重復(fù)性、回收率均良好，可用于復(fù)方硫酸新霉素滴眼液的質(zhì)量控制。