鈣蛋白酶抑制劑MDL28170減輕大鼠缺血再灌注心肌損傷

顧曉明，武 峰，張建英，王躍民，李 娟，張淑苗，楊 敏，周京軍，高 峰

鈣蛋白酶抑制劑MDL28170減輕大鼠缺血再灌注心肌損傷

顧曉明，武 峰，張建英，王躍民，李 娟，張淑苗，楊 敏，周京軍，高 峰

目的我們前期的結(jié)果表明，鈣蛋白酶抑制劑MDL28170對離體灌注心臟可產(chǎn)生保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)評價(jià)MDL28170對在體缺血再灌注心肌的保護(hù)作用。方法 建立急性缺血40 min、再灌注2 h的大鼠心肌損傷模型；缺血前5 min靜脈推注MDL28170（3 mg/kg b.w.），再灌注結(jié)束后TTC染色測量心肌梗死面積，原位末端標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)，比色法檢測血清LDH和組織casapase 3活化的水平。結(jié)果 與對照組相比，缺血再灌注心肌出現(xiàn)明顯的梗死灶、血清LDH水平升高；MDL28170處理可顯著縮小梗死面積，降低LDH水平。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，缺血再灌注心肌凋亡指數(shù)與casapase 3活性顯著增加，而MDL28170顯著逆轉(zhuǎn)二者的變化。MDL28170對正常心肌未產(chǎn)生明顯的壞死或凋亡作用。結(jié)論 MDL28170對在體缺血再灌注心肌具有保護(hù)作用；抑制鈣蛋白酶激活可能是一種行之有效的心肌保護(hù)方法。

鈣蛋白酶；心肌缺血再灌注；心肌凋亡；心肌保護(hù)

隨著冠脈溶栓術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)、心臟外科體外循環(huán)等技術(shù)的推廣應(yīng)用，心肌缺血再灌注損傷成為阻礙患者獲得最佳療效的瓶頸問題，因而缺血心肌保護(hù)的研究一直是心血管研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。N-芐氧羰基-纈氨酸-苯丙氨醛（Benzyloxycarbonyl-Val-Phe-H，MDL28170）是針對鈣蛋白酶（calpain）研發(fā)的肽類化合物[1]，其膜通透性高，筆者和他人在離體心臟灌流的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MDL28170能夠抑制鈣激

活的中性蛋白水解酶（calcium-activated neutral protease，CANP）活性，進(jìn)而減少細(xì)胞骨架分子胞襯蛋白（α-fodrin）降解、改善鈉泵活性，最終改善鈣超載、缺血再灌注后心功能、提高心肌存活率[2-4]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察MDL28170對在體缺血再灌注心肌損傷的影響，以進(jìn)一步明確其保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 清潔級Sprague-Dawley雄性大鼠，250～300 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。MDL28170購自Tocris公司，TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒購自Roche公司，氯化三苯基四氮唑（TTC）、伊文思藍(lán)（Evans blue）、4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自Sigma公司，caspase 3活性檢測試劑盒購自EMD Millipore公司，LDH活性檢測試劑盒購自南京建成生物技術(shù)公司。

1.2 大鼠在體心臟缺血再灌注模型制備 依據(jù)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作規(guī)范[5]，3％戊巴比妥鈉（30 mg/kg，ip）麻醉大鼠，仰臥位固定。肝素化后行頸靜脈插管用于給藥，針狀電極插入左下肢連續(xù)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)心電圖。分離氣管并插管后立即正壓人工呼吸（呼吸頻率50次/分，流量20 ml/kg），從左側(cè)第3、4肋間打開胸腔、暴露心臟，剪破心包膜，在肺動(dòng)脈圓錐左緣平左心耳根下緣2 mm冠狀動(dòng)脈處進(jìn)針，用5/0無損傷縫合線穿過心肌層，以備結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，引起缺血用。實(shí)驗(yàn)中夾閉動(dòng)脈40 min，引起心肌缺血，解除結(jié)扎、再灌注2 h制備缺血再灌注心肌損傷模型。以心電圖ST段抬高、T波高聳標(biāo)志心肌缺血的存在；以抬高的ST段下降，T波逐漸恢復(fù)以確定再灌注的成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為4組，處理如下：①對照組（CON組），進(jìn)行開胸、冠狀動(dòng)脈左前降支掛線等操作，不阻斷冠脈血流；②MDL28170對照組（MDL-C組），在開胸、冠狀動(dòng)脈左前降支掛線等操作后，5 min內(nèi)完成頸靜脈單次推注MDL28170（3.0 mg/kg），不阻斷冠脈血流；③缺血再灌注組（IR組），行左冠狀動(dòng)脈前降支夾閉40 min，解除夾閉（再灌注）2 h；④MDL28170處理組（MDL組），缺血前5 min，頸靜脈快速推注MDL28170（3.0 mg/kg），之后40 min缺血、2 h再灌注處理。

1.4 心肌梗死面積測量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組夾閉冠狀動(dòng)脈，從頸動(dòng)脈注入3％伊文思藍(lán)2 ml；1 min后摘取心臟，去除非心臟組織，左右心耳，4℃生理鹽水沖洗心臟，濾紙吸去水分后置于-20℃凍存2 h；之后與心臟縱軸垂直切成1 mm的均勻薄片，浸入1％氯化三苯基四氮唑（TTC）的磷酸鹽緩沖液中（pH 7.4），37℃孵育15 min；最后用4％福爾馬林固定24 h。根據(jù)顏色不同區(qū)分各區(qū)域，藍(lán)色為非缺血區(qū)，紅色為缺血區(qū)（Area at Risk，AAR）；蒼白色為梗死區(qū)（Infarct Size，IS）。數(shù)碼相機(jī)采樣染色的心臟切片。使用OPTIMAS軟件（NIH）測量相關(guān)區(qū)域面積，用缺血區(qū)占左室的面積比值（AAR/LV）反映缺血范圍，用梗死區(qū)占缺血區(qū)的面積比值（IS/AAR）反映心肌死亡程度。

1.5 乳酸脫氫酶（LDH）活性測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后獲取動(dòng)物血清。依據(jù)LDH催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2，4二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈色的原理，比色法檢測LDH活性[6]。簡要步驟為：按照南京建成生物技術(shù)公司提供的試劑盒要求，在待測樣品中加入基質(zhì)緩沖液與輔酶I，37℃孵育15 min，之后加入2，4二硝基苯肼，酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以對照組為1，取實(shí)驗(yàn)組吸光值與對照組的比值代表各組LDH的相對活性。

1.6 TUNEL染色 常規(guī)方法，石蠟包埋組織，制備3 μm切片，依次脫蠟、至水；依據(jù)原位末端標(biāo)記法（TUNEL）原理，按照羅氏公司提供的試劑盒要求進(jìn)行標(biāo)本處理[5]。之后，4，6二氨基2苯基吲哚（DAPI）復(fù)染細(xì)胞核；用配置有FV10-ASW軟件的激光共聚焦顯微鏡（Olympus，F(xiàn)V1000）系統(tǒng)采集圖像，每張玻片上隨機(jī)選擇4個(gè)區(qū)域，正常細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈綠色熒光；計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，用百分比來反映凋亡指數(shù)（apoptotic index）。

1.7 天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3）活性測定 再灌注2 h后剪取缺血區(qū)心肌組織80 mg，熒光比色法檢測caspase 3活性[5]。簡要過程為：采用EMD Millipore公司提供的試劑勻漿組織，離心取上清即獲得檢測樣品，37℃下與顯色底物Ac-DEVD-pNA孵育2 h，405 nm讀取熒光值，以對照組熒光值為1，將處理組熒光值除以對照組，所獲比值表示caspase 3的相對活性。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)立10 μM AC-DEVD-CHO（caspase 3抑制劑）處理的對照組，以確認(rèn)結(jié)果的特異性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ±SE）表示，應(yīng)用Graphpad Prism 4.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較用Tukey檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MDL28170對缺血再灌注后心肌壞死的影響各組間AAR/LV的比值無明顯差異（圖1），說明各組的結(jié)扎部位相同，具有可比性。與CON組相比，IR組左心室出現(xiàn)明顯的梗死灶，MDL28170處理顯著縮小梗死面積（圖1）。與心肌梗死面積結(jié)果相一致，IR組大鼠血清LDH活性顯著增加，MDL28170則顯著降低酶的活性（圖2）。這些結(jié)果表明，MDL28170具有減少細(xì)胞壞死，提高心肌抗缺血再灌注損傷能力的作用。另外，MDL-C組與CON組的TTC染色和血清LDH水平不存在顯著差異，提示MDL28170對正常心肌的存活無明顯影響。

圖1 心臟組織切片的伊文思藍(lán)與TTC雙重染色（上）以及缺血范圍（中）和梗死區(qū)（下）

圖2 MDL28170降低缺血再灌注大鼠血清LDH水平

2.2 MDL28170對缺血再灌注心肌凋亡的影響 與對照組相比，缺血再灌注組心肌組織切片可見大量TUNEL染色陽性細(xì)胞，caspase 3的活性顯著增加；給予MDL28170顯著減少細(xì)胞凋亡指數(shù)，抑制caspase 3活化（圖3、4），表明MDL28170具有抗細(xì)胞凋亡作用。此外，凋亡指數(shù)和caspase 3的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，MDL-C組與CON組間不存在顯著差異（圖3、4）。

圖3 MDL28170減少缺血再灌注心肌凋亡指數(shù)

圖4 MDL28170減弱缺血再灌注心肌Caspase 3活性

3 討 論

離體器官研究發(fā)現(xiàn)，MDL28170可顯著抑制鈣蛋白酶活性，改善缺血再灌注后心功能，提高組織存活率。本實(shí)驗(yàn)在整體動(dòng)物觀察到，MDL28170可顯著縮小缺血再灌注后心肌梗死面積，降低血清LDH水平，減少細(xì)胞凋亡指數(shù)，減弱caspase 3活化，表明MDL28170是一種有效的心肌保護(hù)藥物，提示抑制鈣蛋白酶活性是防治缺血再灌注損傷的重要途徑。

鈣蛋白酶是一類鈣激活的中性蛋白水解酶。目前發(fā)現(xiàn)，這一家族有1～15種亞型[7]，其中CANP4與其它分子結(jié)構(gòu)不同，其作為小亞單位與CANP1和2構(gòu)成的二聚體即是經(jīng)典的μ-和m-型。分子結(jié)構(gòu)研究表明，位于催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的半胱氨酸殘基具有親核性，是酶活性的核心部位。因此，鈣蛋白酶又稱半胱氨酸蛋白酶。鈣蛋白酶在心臟、骨骼肌、腎臟等多種組織表達(dá)，心肌主要存在μ-和m-型[8]。由于攻擊親核性基團(tuán)是MDL28170的作用機(jī)制，MDL28170并不能選擇性作用于某一種鈣蛋白酶，因此，有必要研發(fā)不同種類鈣蛋白酶的選擇性抑制劑，以進(jìn)一步闡明各自的作用。

再灌注早期是心肌保護(hù)性干預(yù)的重要時(shí)間窗，本實(shí)驗(yàn)只評價(jià)了缺血前給藥的心肌保護(hù)作用，因此，有必要觀察再灌注早期給予MDL28170的心肌保護(hù)效果，以進(jìn)一步明確其心肌保護(hù)作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)在整體動(dòng)物水平觀察到MDL28170提高缺血再灌注后心肌存活率，同時(shí)也提示，抑制鈣蛋白酶激活可能是一種行之有效的心肌保護(hù)方法。MDL28170對心功能、自由基產(chǎn)生等方面的作用還需進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)研究。

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The calpains inhibitor MDL28170 protects heart against ischemia/reperfusion injury in rats

Gu Xiao-ming，Wu Feng，Zhang Jian-ying，Wang Yue-min，Li Juan，Zhang Shu-miao，Yang Min，Zhou Jing-jun，Gao Feng
Department of Physiology，Institute of Basic Medicine，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Xi＇an 710032，China

Zhou Jing-jun，Email：jjzhou＠fmmu.edu.cn

ObjectiveOur previous studies demonstrated that MDL28170，an inhibitor of calpains，produced protective effects in the isolated heart.This study was to evaluate the effects of MDL28170 on myocardial ischemia/reperfusion injury in vivo.MethodsThe rat hearts were subjected to 40 min ischemia/2 h reperfusion.MDL28170 was given i.v.5 min before ischemia at a dose of 3 mg/kg b.w.bolus.The infarcts were measured by TTC staining，the apoptotic index was evaluated by TUNEL staining，and the level of plasma lactate dehydrogenase（LDH）and myocardial caspase 3 activities were determined by colorimetric assay kit.ResultsCompared with the normal，the hearts in ischemia/reperfusion group exhibited increased infarct size，and enhanced plasma LDH activities.More importantly，MDL28170 significantly attenuated these effects induced by ischemia/reperfusion.In addition，the data of TUNEL staining and caspase 3 activities revealed that there was an increase of cell apoptosis in ischemia/reperfusion group，which was also blocked by MDL28170.The last but not the least，MDL28170 had no effects on myocardial infarcts and apoptosis in the normal.ConclusionThese results provide evidence that MDL28170 protects heart against ischemia/reperfusion injury in vivo.It also suggests that inhibiting activation of calpains is an effective strategy for myocardial protection.

Heart；Ischemia/reperfusion；Myocardial apoptosis；Myocardial protection

R654.1

A

1672-1403（2013）04-0248-04

2013-10-10）

2013-10-23）

國家自然科學(xué)基金（81100082，31371181）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生理學(xué)教研室（顧曉明、張建英、王躍民、李 娟、張淑苗、楊 敏、周京軍、高 峰）；710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管內(nèi)科（武 峰）

周京軍，Email：jjzhou＠fmmu.edu.cn