烏司他丁對(duì)外源性過(guò)氧化氫介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

雷蘭萍，魏毅君，熊紅燕，楊 陽(yáng)，陳 濤，金振曉

·基礎(chǔ)研究·

烏司他丁對(duì)外源性過(guò)氧化氫介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

雷蘭萍，魏毅君，熊紅燕，楊 陽(yáng)，陳 濤，金振曉

目的研究烏司他丁對(duì)外源性過(guò)氧化氫介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法 體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）培養(yǎng)液中加入外源性過(guò)氧化氫（250 μmol/L）制作內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，加入不同濃度的烏司他?。?00、500、1 500、3 000和5 000 U/ml），MTT法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞存活率，同時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性、一氧化氮含量和彈性蛋白酶活性，并測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力。結(jié)果 外源性過(guò)氧化氫可以顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞存活率，同時(shí)培養(yǎng)液中LDH活性顯著升高、一氧化氮含量顯著降低、彈性蛋白酶活性顯著升高，內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力下降。烏司他丁雖然可以在一定程度上抑制細(xì)胞培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性的升高，但是對(duì)細(xì)胞存活率、LDH的釋放、一氧化氮的釋放、細(xì)胞黏附能力均無(wú)明顯改善作用。結(jié)論 本研究采用的烏司他丁劑量對(duì)外源性過(guò)氧化氫介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷無(wú)明顯保護(hù)效果。

烏司他??；內(nèi)皮細(xì)胞；過(guò)氧化氫；彈性蛋白酶

血管內(nèi)皮細(xì)胞介于血液與組織間，發(fā)揮著屏障作用，同時(shí)具有多種生理功能，對(duì)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著積極作用。內(nèi)皮功能異常是II型糖尿病患者血管并發(fā)癥的始發(fā)因素[1]。氧化應(yīng)激是糖尿病患者血管內(nèi)皮功能異常的重要原因[2]。抗氧化治療對(duì)于預(yù)防和治療糖尿病性血管病變具有重要的臨床意義[3]。內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)溶酶體膜不穩(wěn)定和溶酶體內(nèi)蛋白酶的釋放，是氧化應(yīng)激造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。采用適當(dāng)措施穩(wěn)定溶酶體膜并對(duì)抗這些蛋白酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的溶解破壞作用是對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的重要方法。目前，臨床上最常用的蛋白酶抑制劑是烏司他丁，烏司他丁是一種從正常男性尿液中提取的蛋白酶抑制劑，常用于對(duì)抗過(guò)度炎癥反應(yīng)引起的各種組織損傷[4]。本研究的主要目的是觀察烏司他丁是否能在體外抑制過(guò)氧化氫介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并初步探討其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑、細(xì)胞與儀器 重組人腫瘤壞死因子α（rhTNF-α）（R＆D公司，美國(guó)），干擾素γ（IFN-γ）（R＆D公司，美國(guó)），烏司他?。◤V州天普藥業(yè)公司）。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株由第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科實(shí)驗(yàn)室提供，小牛血清（杭州四季青公司），DMEM低糖培養(yǎng)液（Hyclone，美國(guó)），胰蛋白酶（Sigma，美國(guó)），MTT（Sigma公司），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所），彈性蛋白酶活性的檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），DMSO（Sigma，美國(guó)），細(xì)胞裂解液（碧云天，上海）。彈性蛋白酶細(xì)胞熒光探針AAPV Elastase CellProbeTMReagent（Beckman公司，美國(guó)）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma，美國(guó)），酶標(biāo)儀（Biotech，美國(guó)），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備儀器廠），倒置顯微鏡（O-lympus，日本），低速離心機(jī)（賽特湘儀，湖南）。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的培養(yǎng)、準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)分組 HUVECs用含10％小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d。待細(xì)胞融合后，用0.25％胰蛋白酶消化。鏡下觀察到細(xì)胞收縮變圓時(shí)棄去消化液，加入培養(yǎng)液以終止胰蛋白酶的作用。用滴管吹打壁上的細(xì)胞，使其完全脫落并分離。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要按2×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞融合后，換用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化，然后即可進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。過(guò)氧化氫濃度為250 μmol/L，實(shí)驗(yàn)分為7組：對(duì)照組，H2O2損傷組，H2O2+烏司他丁保護(hù)組（烏司他丁濃度分別為100、500、1 500、3 000和5 000 U/ml）。對(duì)照組，HUVECs在DMEM中孵育4 h；H2O2損傷組，HUVECs在含有H2O2的DMEM中孵育4 h；H2O2+烏司他丁保護(hù)組，HUVECs在含有H2O2和不同濃度烏司他丁的DMEM中孵育4 h。孵育完成后，收集培養(yǎng)液用于其它檢測(cè)。

1.3 MTT法檢測(cè)不同濃度烏司他丁對(duì)過(guò)氧化氫介導(dǎo)HUVECs損傷后細(xì)胞存活率的影響 加入DMEM培養(yǎng)液（100 μl）和含0.5％MTT的培養(yǎng)液（10 μl），37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，加入100 μl的DMSO原液，振蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后，同時(shí)用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值（OD值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 培養(yǎng)液中LDH含量的測(cè)定 LDH試劑盒購(gòu)至南京建成生物工程研究所，按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)上述收集到的培養(yǎng)液進(jìn)行LDH含量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 培養(yǎng)液中一氧化氮（NO）含量的測(cè)定 以Griess法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量[5]。方法簡(jiǎn)述如下：100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液與100 μl的Griess試劑（1％磺胺溶于2.5％磷酸與等體積的0.1％萘乙二胺鹽酸鹽混合液）在室溫下反應(yīng)10 min，在酶標(biāo)儀上于540 nm測(cè)定吸光度。根據(jù)NaNO2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性的檢測(cè) 培養(yǎng)液中中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性采用顯色性底物方法檢測(cè)，彈性蛋白酶將其特異性底物N-methoxysucciny-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide分解后，釋放出pnitroanilide，即可在分光光度計(jì)測(cè)定其含量。方法簡(jiǎn)述如下：培養(yǎng)上清液400 g離心10 min后，加入含有顯色底物和NaCl（0.5 M）的Tris-HCl（0.1 mM）緩沖液，37℃孵育10 min，0.1 M NaOH終止反應(yīng)，彈性蛋白酶消化底物釋放出的p-nitroanilide的含量在405 nm波長(zhǎng)分光光度計(jì)下檢測(cè)。以損傷組的平均OD值為1，其它各組培養(yǎng)液中彈性蛋白酶的活性表示為1的倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞黏附能力 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[6]，具體為：細(xì)胞種于50 ml培養(yǎng)瓶中，各組細(xì)胞處理4 h后，PBS洗3遍，用0.25％胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心、重懸后，每組細(xì)胞計(jì)數(shù)5×105/ml，種于96孔板，每組8個(gè)復(fù)孔。接種0.5 h后棄去培養(yǎng)液，加入DMEM培養(yǎng)液（100 μl）和含0.5％MTT的培養(yǎng)基（10 μl），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，倒置顯微鏡拍照，不同觀察者對(duì)同一視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)報(bào)道[7]，ROS可以將非熒光的2′，7′-DCFH-DA轉(zhuǎn)化能發(fā)出熒光的DCFH。內(nèi)皮細(xì)胞接種在黑色96孔板中，進(jìn)行分組處理后，PBS（pH 7.4）洗滌然后加入含有DCFH-DA（20 μM）的PBS，37°C孵育2 h.孵育結(jié)束后，F(xiàn)LX 800型微孔板熒光檢測(cè)儀（Biotech Instruments Inc.，USA）檢測(cè)熒光（波長(zhǎng)530 nm）強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)為485 nm。無(wú)細(xì)胞微孔為本底值。以對(duì)照孔的平均熒光強(qiáng)度為100，結(jié)果表示為對(duì)照孔熒光強(qiáng)度的百分比。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean SD）表示，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)烏司他丁對(duì)H2O2致HUVECs損傷的保護(hù) H2O2可以顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞存活率，而本研究采用的烏司他丁劑量都沒(méi)有顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞存活率。見(jiàn)圖1。

圖1 MTT法檢測(cè)不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞存活率比較

2.2 培養(yǎng)液中LDH含量 各組細(xì)胞處理后檢測(cè)培養(yǎng)液中的LDH含量與單純DMEM孵育組相比，過(guò)氧化氫與HUVECs共孵育可引起培養(yǎng)液中LDH含量的顯著升高。本研究采用的烏司他丁劑量均未能顯著抑制過(guò)氧化氫與HUVECs共孵育引起的培養(yǎng)液中LDH的升高。見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量比較

2.3 培養(yǎng)液中NO含量的檢測(cè) 各組細(xì)胞處理后檢測(cè)培養(yǎng)液中的NO含量，與單純DMEM孵育組相比，過(guò)氧化氫與HUVECs共孵育可以引起培養(yǎng)液中NO含量的顯著下降。本研究采用的烏司他丁劑量均未能顯著抑制過(guò)氧化氫與HUVECs共孵育引起的培養(yǎng)液中NO含量下降。見(jiàn)圖3。

2.4 培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性的檢測(cè) 各組細(xì)胞處理后檢測(cè)培養(yǎng)液中的彈性蛋白酶的活性，對(duì)照組HUVECs的培養(yǎng)液中幾乎檢測(cè)不到彈性蛋白酶的活性，過(guò)氧化氫與HUVECs共孵育可以引起培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性顯著升高。超過(guò)3 000 U/ml的烏司他丁可有效抑制過(guò)氧化氫與HUVECs共孵育引起的培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性。見(jiàn)圖4。

圖3 不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量比較

圖4 不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性比較

2.5 黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞黏附能力 各組細(xì)胞處理后黏附0.5 h后細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，見(jiàn)圖5，結(jié)果表明H2O2可以有效降低內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力，而不同濃度烏司他丁均未能顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力。

圖5 不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力的比較

2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量測(cè)定 各組細(xì)胞處理后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)含量，以對(duì)照組HUVECs中ROS含量為100，過(guò)氧化氫與HUVECs共孵育可以引起細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高。本研究采用的烏司他丁劑量未能有效抑制過(guò)氧化氫與HUVECs共孵育引起的細(xì)胞內(nèi)ROS含量的升高。見(jiàn)圖6。

圖6 不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS含量的比較

3 討 論

H2O2能很容易地穿透細(xì)胞膜自由進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞核內(nèi)的H2O2可轉(zhuǎn)變成具有高活性羥自由基，從而造成DNA鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[8]。LDH是細(xì)胞損傷后釋放到細(xì)胞外的細(xì)胞內(nèi)容物，其在細(xì)胞外的活力反映細(xì)胞損傷的程度[9]。本實(shí)驗(yàn)中H2O2損傷組HUVECs培養(yǎng)液中LDH含量明顯升高，這表明H2O2能引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同時(shí)抑制細(xì)胞的增殖代償能力。內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力也是血管內(nèi)皮損傷后修復(fù)能力的體現(xiàn)，本研究結(jié)果提示過(guò)氧化氫處理可以顯著降低培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力，表明循環(huán)血液中氧化應(yīng)激水平的升高確實(shí)可以對(duì)內(nèi)皮的損傷修復(fù)能力造成損害。內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧含量反映了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平，而細(xì)胞培養(yǎng)液中彈性蛋白酶的含量反映的是內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，溶酶體釋放的細(xì)胞溶解酶的釋放量。NO是由內(nèi)皮細(xì)胞合成的血管活性物質(zhì)，它具有舒張血管平滑肌，抑制異常增殖和炎癥反應(yīng)，以及抑制血小板聚集等作用[10]。內(nèi)皮源性NO對(duì)心血管系統(tǒng)具有廣泛而明確的調(diào)控作用，維持正常的NO水平，對(duì)心血管保護(hù)作用具有重要的意義。II型糖尿病患者常有血管內(nèi)皮功能異常，內(nèi)皮源性NO表達(dá)減少[5]。

本實(shí)驗(yàn)中不同劑量的烏司他丁雖然在一定程度上降低了細(xì)胞培養(yǎng)液中彈性蛋白酶的活性，但是不能對(duì)抗外源性H2O2損傷造成的內(nèi)皮細(xì)胞存活率下降，也不能抑制內(nèi)皮細(xì)胞LDH的釋放，不能抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的升高，不能改善外源性過(guò)氧化氫損傷后內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力及提高培養(yǎng)液中的NO含量，提示烏司他丁對(duì)這種外源性過(guò)氧化氫造成的內(nèi)皮細(xì)胞損傷沒(méi)有明顯的保護(hù)作用。

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The protective effects of ulinastatin against exogenous H2O2-induced vascular endothelial cells injury

Lei Lan-ping，Wei Yi-jun，Xiong Hong-yan，Yang Yang，Chen Tao，Jin Zhen-xiao.
Department of Cardiovascular Surgery，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi＇an 710032，China Corresponding author：Jin Zhen-xiao.Email：jinzx10262＠aliyun.com

ObjectiveTo investigate the protective effect of ulinastatin on exogenous H2O2-induced vascular endothelial cells injury.MethodsIn vitro H2O2mediated endothelial cell injury model was established by adding H2O2（250 μmol/L）into the Human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）culture system.Serial concentrations（100，500，1 500，3 000 and 5 000 U/ml）of ulinastatin were added to the culture system.Cellular viability was determined with MTT assay；lactate dehydrogenase（LDH）content，NO content and elastase activity in the culture medium were examined.Cellular adhesive ability was also measured.ResultsThe co-culture process of H2O2and HUVECs significantly decreased the viability and adhesive ability of HUVECs，decreased the NO content and increased the LDH and elastase content in the culture medium.Ulinatatin inhibited the changes of medium elastase contents at some level，but had no significant effects on cellular viability and adhesive ability.It had no significant effects on the medium content of LDH，NO either.ConclusionUlinastatin，in the dose used in this study，has no significant protective effects on H2O2mediated endothelial cell injury.

Ulinastatin；Endothelial cell；H2O2；Elastase.

R654.1

A

1672-1403（2013）04-0238-04

2013-07-15）

2013-07-26）

陜西省攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2012SF2-21-1，2012K15-02-01）；天普研究基金項(xiàng)目（01201104）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科（雷蘭萍、段維勛、楊 陽(yáng)、陳 濤、金振曉）；721004寶雞，解放軍第三醫(yī)院神經(jīng)外科（魏毅君）；710003西安，西安市中心醫(yī)院胸心外科（熊紅燕）

金振曉，Email：jinzx10262＠aliyun.com