右旋美托咪定抑制胰島素樣生長因子2通路對卵巢癌大鼠免疫功能和癌細(xì)胞侵襲遷移的影響及調(diào)控機(jī)制研究①

陳飛任 陳 揚(yáng) 黎真真 遠(yuǎn) 征 吳紅發(fā) （?？谑袐D幼保健院麻醉科，?？?71400）

近年來，卵巢癌發(fā)病率和患病率持續(xù)增高，主要治療方法是根治性切除，對于大多數(shù)患者而言療效較好［1-2］。但手術(shù)過程中麻醉藥的不正確使用可導(dǎo)致患者生命體征不穩(wěn)定，甚至呼吸抑制和其他不良反應(yīng)［3］。因此，選擇合適的麻醉藥已成為卵巢癌根治術(shù)成功與否的關(guān)鍵［4］。鉑類藥物化學(xué)療法的最佳減量化仍然是卵巢癌治療的基礎(chǔ)，但復(fù)發(fā)率較高［5］。研究證實(shí)，卵巢癌患者免疫系統(tǒng)功能被抑制，免疫活性因子和細(xì)胞功能降低，進(jìn)一步引發(fā)腫瘤細(xì)胞生長和遷移［6］。右美托咪定是臨床常用鎮(zhèn)靜藥，是具有高度選擇性的α2腎上腺素能受體激動劑，可與脊髓和腦干核小腦中的α2受體結(jié)合，起鎮(zhèn)痛和抗焦慮作用［7］。與鎮(zhèn)靜藥物（如丙泊酚和芬太尼）相比，右旋美托咪定的優(yōu)勢在于不會引起患者呼吸抑制［8］。目前，關(guān)于右旋美托咪定在麻醉、鎮(zhèn)靜和器官保護(hù)方面的研究較多，但在腫瘤治療方面的研究較少。胰島素樣生長因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）信號通路是癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的重要通路［9］。IGF2信號通路及其關(guān)鍵蛋白在順鉑耐藥卵巢癌中起主要作用［10］。但I(xiàn)GF2信號通路是否受相關(guān)藥物影響，以及是否影響腫瘤的生物學(xué)特性尚未明確?；谒幬镏委煹姆肿訖C(jī)制，本研究探討右旋美托咪定通過IGF2通路對卵巢癌大鼠免疫功能和腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞了來源 30只清潔雌性Fischer 344大鼠購自動科院研究所，10～12周齡，體重（150±10）g，飼養(yǎng)適應(yīng)期1周；低分化的上皮卵巢癌細(xì)胞系NUTU-19購自中國上海喬都生物技術(shù)有限公司，每24 h換液1次培養(yǎng)，每2 d傳代1次。

1.1.2 主要試劑與儀器 右旋美托咪定（Cisen Pharmaceutical Co，Ltd）；無血清培養(yǎng)基（YB356234，上海裕博生物技術(shù)有限公司）；TRIzol試劑（美國In‐vitrogen公司）；RT-PCR試劑（SYBRGreen）；HE染色試劑（SBT10001，北京索拉爾生物技術(shù)有限公司）；PI（107-21-1，天津鼎盛鑫化學(xué)工業(yè)有限公司）；LPS（美國Sigma Corporation）；ELISA試劑盒（PH029 RAT，上海Phygene）；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒、MTT試劑（南京建成生物工程研究所有限公司）；ABI PRISM 7300系統(tǒng)（美國Applied Biosystems）；酶標(biāo)儀（可孚醫(yī)療科技發(fā)展有限公司）；倒置顯微鏡（德國Leica）。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 選取20只大鼠建立卵巢癌大鼠模型。將對數(shù)生長期的NUTU-19低分化上皮性卵巢癌細(xì)胞濃度調(diào)整為2×107個(gè)/ml，皮下接種細(xì)胞懸液于大鼠右腋（0.5 m/l只）。大鼠毛發(fā)干燥、體重明顯減輕且身體活動減少視為造模成功。當(dāng)右腋下腫瘤長至0.4 cm×0.4 cm時(shí)，將大鼠分為2組：模型組和右旋美托咪定治療組［4.5μg/（kg·h）］，右旋美托咪定治療組通過腹膜內(nèi)注射右旋美托咪定，1 d/次，持續(xù)15 d，正常組和模型組大鼠注射等量生理鹽水。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)動物研究倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2 RT-qPCR 收集組織置于預(yù)冷的裂解緩沖液中冰上裂解，收集上清。采用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，共合成50 ng總RNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系50μl，包括2 mmo/lL dNTP mixture 2μl，Buffer 5μl，Tag酶0.4μl，引物2μl，DNA模板4μl和ddH2O 36.6μl，采用ABIPRISM 7300系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。

1.2.3 Western blot 取大鼠卵巢組織，PBS洗滌2次，液氮中研磨，冰浴中采用苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液（RIPA：PMSF=100：1）通過放射免疫沉淀測定RIPA裂解緩沖液裂解，每5 min搖動1次以確保細(xì)胞完全裂解，4℃、12 000/rmin離心30 min，吸取上清至新的EP管中，BCA法測定蛋白濃度。上清體積記錄為V，取1/3 V 4×上樣緩沖液至EP管中，浸入100℃ 金屬浴中10 min，-20℃保存?zhèn)溆?。?0μg蛋白與加樣緩沖液混合，變性并加至10%SDS-PAGE凝膠的各泳道中。將轉(zhuǎn)移至PVDF膜上的蛋白在5%脫脂牛奶中22℃封閉1 h，凝膠記錄和分析系統(tǒng)拍照，Adobe Photoshop 7.0.1版軟件測量條帶強(qiáng)度，并對β-肌動蛋白表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以進(jìn)行定量分析。

1.2.4 HE染色 第25天處死大鼠，取卵巢和卵巢癌組織，放入10%甲醛中固定24 h，石蠟包埋，60℃切片（5μm），60℃放置1 h，二甲苯脫蠟，重新水化，HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)變化。

1.2.5 MTT測定脾淋巴細(xì)胞增殖率 頸脫位法處死大鼠，浸入0.5%碘伏溶液中5 min，無菌條件下取出大鼠各脾臟，切薄片，PBS中研磨，200目篩過濾，懸浮，1 500/rmin離心10 min，稀釋至2×106個(gè)/ml，置于96孔板。在前3塊板中添加100μl LPS（10 g/ml）作為實(shí)驗(yàn)板，最后3塊板添加100μl RPMI1640培養(yǎng)基作為對照板，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，結(jié)束前4 h棄100μl上清，加入20μl MTT溶液（5 mg/ml）混合，培養(yǎng)4 h，100μ/l孔加入DMSO，30 min后采用ELx800微孔板讀數(shù)器測量490 nm處光密度（OD）值，酶標(biāo)儀測定570 nm處OD值。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)測定CD4+和CD8+T細(xì)胞百分比及細(xì)胞周期 麻醉大鼠，腹主動脈取血，10 000/rmin離心5 min，棄上清，清洗2次，與5 ml 70%乙醇混合，4℃ 培養(yǎng)48 h，PBS清洗，重懸于1 ml PBS中，加入5μl RNase（10 mg/ml）37℃ 孵育1 h。加入碘化丙錠（100μg/ml）室溫避光染色30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+和CD8+T細(xì)胞百分比并計(jì)算CD4+與CD8+T細(xì)胞比例。收集細(xì)胞，冷PBS洗滌并離心，重懸至終濃度為1×105個(gè)/ml，4℃與1 ml 75%預(yù)冷乙醇固定1 h，離心，PBS洗滌，37℃下加入100 ml RNase A處理30 min，加入400μl PI于4℃染色30 min，488 nm處檢測到紅色熒光，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。

1.2.7 ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠眼球取血，3000/rmin 4℃下離心15 min分離血清。然后收集血清并儲存在-20℃。根據(jù)ELISA試劑盒說明書測量大鼠血清中IL-2和TNF-含量，各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 Transwell試驗(yàn) 將200μl Matrigel添加到4℃200μl無血清培養(yǎng)基中，將50μl Matrigel添加到Transwell小室中孵育2～3 h，消化并計(jì)數(shù)，2%含血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，將200μl細(xì)胞懸液添加到各孔Transwell小室。設(shè)置右旋美托咪定低、中、高劑量組（終濃度分別為1、10、100 ng/ml），并將含有20%FBS的800μl條件培養(yǎng)基添加到空白組培養(yǎng)板中，將Transwell板37℃ 孵育24 h，PBS漂洗3 min，浸入甲醛中10 min，水洗3次，3 min/次，0.1%結(jié)晶紫染色，室溫放置1 h，PBS沖洗2次，棉球擦拭細(xì)胞，風(fēng)干，倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)字段，計(jì)算平均值。

1.2.9 刮擦黏附試驗(yàn) 12孔板后每0.5 cm處畫水平線以確保至少有5條線穿過各孔，加入約5×105個(gè)細(xì)胞以確保該板過夜鋪展。第2天，采用直尺進(jìn)行刮擦黏附力測試，最大限度地確保移液器吸頭垂直于板的背面進(jìn)行刮擦測試，避免板傾斜，PBS沖洗3次，1 min/次，除去交叉細(xì)胞。右旋美托咪定低、中、高劑量組終濃度分別為1、10、100 ng/ml，空白組加入等量生理鹽水，各組細(xì)胞均在37℃、5%CO2中培養(yǎng)，0 h和48 h取樣，拍照并分析劃痕寬度以評估細(xì)胞遷移情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，多組間采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織中IGF2、IGF1R和IRS1 mRNA表達(dá) RT-qPCR顯示，與對照組相比，模型組、右旋美托咪定治療組IGF2、IGF1R和IRS1 mRNA表達(dá)升高，與模型組相比，右旋美托咪定治療組IGF2、IGF1R和IRS1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05，表1）。

2.2 右旋美托咪定抑制p38MAPK/NF-κB信號通路激活 如圖1所示，Western blot檢測大鼠組織樣本中p38MAPK/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組和右旋美托咪定治療組p38、NF-κB蛋白表達(dá)升高，與模型組相比，右旋美托咪定治療組p38、NF-κB蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

表1 卵巢組織中IGF2、IGF1R和IRS1 mRNA表達(dá)（±s）Tab.1 IGF2，IGF1R and IRS1 mRNA expressions in ovarian tissue（±s）

表1 卵巢組織中IGF2、IGF1R和IRS1 mRNA表達(dá)（±s）Tab.1 IGF2，IGF1R and IRS1 mRNA expressions in ovarian tissue（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

GroupsIGF2IGF1RIRS1 Control1.02±0.180.86±0.211.11±0.25 Model2.26±0.351）1.98±0.311）2.12±0.331）Dexm tr ee d at emt oemn it dine1.54±0.241）2）1.25±0.221）2）1.68±0.191）2）F 9.13511.68210.731 P 0.0180.0360.004

圖1 Western blot檢測p38、NF-κB蛋白表達(dá)Fig.1 Western blot analysis of p38 and NF-κB protein ex?pressions

2.3 右旋美托咪定對卵巢癌大鼠血清CD4和CD8 T細(xì)胞百分比的影響 與對照組相比，模型組和右旋美托咪定治療組CD4和CD8 T細(xì)胞亞群百分比降低，CD4+/CD8+比值降低，與模型組相比，右旋美托咪定治療組CD4和CD8 T細(xì)胞亞群百分比升高，CD4/+CD8+比值升高（P＜0.05，表2）。

2.4 HE染色觀察大鼠卵巢組織變化 如圖2所示，對照組卵巢組織僅有1個(gè)扁平或立方的上皮，底部有1個(gè)致密的纖維組織。模型組卵巢組織呈現(xiàn)卵圓形腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞核擴(kuò)大，細(xì)胞核數(shù)增加，核仁染色較深。右旋美托咪定組中觀察到變種組織，腫瘤體積不同程度縮小，腫瘤發(fā)展被抑制。

表2 右旋美托咪定對卵巢癌大鼠血清CD4和CD8 T細(xì)胞百分比的影響（±s）Tab.2 Effect of dexotomidine on percentage of serum CD4 and CD8 T cells in rats with ovarian cancer（±s）

表2 右旋美托咪定對卵巢癌大鼠血清CD4和CD8 T細(xì)胞百分比的影響（±s）Tab.2 Effect of dexotomidine on percentage of serum CD4 and CD8 T cells in rats with ovarian cancer（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

GroupsCD4（+%）CD8+（%）CD4/+CD8+Control196.37±18.47106.84±12.652.47±0.41 Model65.24±5.261）25.14±3.291）1.12±0.151）Dexm tr ee da e tm to e mnitd ine137.54±8.061）2）76.33±6.081）2）1.84±0.271）2）F 12.6329.03811.728 P 0.0020.0210.035

圖2 HE染色Fig.2 HE staining

表3 促炎細(xì)胞因子水平（±s，pg/ml）Tab.3 Proinflammatory cytokine levels（±s，pg/ml）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

GroupsIL-2TNF-α Control41.68±5.2698.71±16.42 Model138.29±21.571）237.65±45.161）Dexmedetomidinetreatment84.68±15.741）2）141.37±25.081）2）F 11.69210.928 P 0.0170.035

2.5 促炎細(xì)胞因子水平 與對照組相比，模型組與右旋美托咪定治療組血清IL-2和TNF-α水平升高（P＜0.05），與模型組相比，右旋美托咪定治療組IL-2和TNF-α水平降低（P＜0.05，表3）。

2.6 右旋美托咪定抑制卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲Transwell試驗(yàn)及刮擦黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示，與NUTU-19細(xì)胞相比，右旋美托咪定治療組細(xì)胞遷移率、侵襲率降低（P＜0.05）。提示右旋美托咪定可抑制卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲（圖3、表4）。

2.7 右旋美托咪定促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞生長 如表5所示，MTT檢測各組細(xì)胞脾淋巴細(xì)胞增殖率結(jié)果顯示，第48 h，模型組較右旋美托咪定治療組脾淋巴細(xì)胞增殖率降低，右旋美托咪定治療組較對照組脾淋巴細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05），第72 h，模型組較對照組增殖率降低，右旋美托咪定治療組較模型組增殖率降低（P＜0.01）。

圖3 細(xì)胞侵襲與遷移Fig.3 Cell invasion and migration

表4 右旋美托咪定對卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲的影響（±s，%）Tab.4 Effect of dexmedetomidine on migration and inva?sion of ovarian cancer cells（±s，%）

表4 右旋美托咪定對卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲的影響（±s，%）Tab.4 Effect of dexmedetomidine on migration and inva?sion of ovarian cancer cells（±s，%）

GroupsMigration cellInvasion cells NUTU-1973.62±6.1983.62±7.41 Dexmedetomidine treatment31.74±4.6143.28±5.61 t 9.73111.928 P 0.0220.015

表5 細(xì)胞增殖率（±s，%）Tab.5 Cell proliferation rate（±s，%）

表5 細(xì)胞增殖率（±s，%）Tab.5 Cell proliferation rate（±s，%）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

Groups48 h72 h Control0.86±0.221.44±0.32 Model0.26±0.061）0.61±0.211）Dexmedetomidine treatment0.64±0.191）2）1.25±0.251）2）F 9.28711.421 P 0.0160.001

3 討論

研究表明，IGF在調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞增殖和生長方面起關(guān)鍵作用［11］。IGF有2種，IGF-1和IGF-2，均存在于正常卵巢中，參與卵巢表面上皮生長調(diào)節(jié)過程，與卵巢癌變相關(guān)。IGF可通過與IGF-1R結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞自身合成和分泌IGF，通過自分泌作用刺激細(xì)胞增殖。右旋美托咪定是高選擇性的腎上腺素能激動劑，作為抗焦慮、鎮(zhèn)靜、止痛類藥物廣泛用于重癥監(jiān)護(hù)病房和外科治療。研究報(bào)道，右旋美托咪定可降低甲狀腺癌患者血清IL-6，IL-8和TNF-α水平，減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥損傷，對術(shù)后認(rèn)知功能恢復(fù)具有重要意義［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，右旋美托咪定可改善卵巢癌大鼠免疫功能，適量的右旋美托咪定有助于減少卵巢癌患者腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與模型組相比，右旋美托咪定治療組組血清T淋巴細(xì)胞亞群CD4+和CD8+百分比提高，提示右美托咪定可抑制手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)引起的細(xì)胞免疫功能降低。IL-2是人體內(nèi)常見細(xì)胞因子，而CD4+、CD8+T細(xì)胞是IL-2的重要組成部分，也是免疫功能調(diào)節(jié)的重要因子［13-14］。脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率已被證明是維持淋巴細(xì)胞和免疫功能的重要因子［15-16］。本研究進(jìn)一步證實(shí)，右旋美托咪定對改善卵巢癌大鼠的免疫功能具有重要作用，對卵巢癌大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率具有積極作用。本研究顯示，右旋美托咪定組術(shù)后IL-2和TNF-α水平降低，提示右美托咪定可減輕卵巢癌術(shù)后應(yīng)激所致的不良反應(yīng)，且對機(jī)體狀況無影響。

化學(xué)抗性和細(xì)胞損傷主要由有絲分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)，磷酸化MAPK可增加對化療的抵抗力，而p38MAPK最為重要［17-18］。核因子-κB（NF-κB）與多種癌癥相關(guān)，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程中重要的多種基因表達(dá)，如NF-κB可通過誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生導(dǎo)致抗凋亡基因表達(dá)水平上升，從而刺激細(xì)胞增殖及結(jié)腸炎相關(guān)大腸癌等疾病中血管生成導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［19］。NF-κB在各種腫瘤細(xì)胞系中被組成性激活，影響癌癥進(jìn)展和化療敏感性，以及對腹膜炎癥和與卵巢癌相關(guān)微環(huán)境的作用［20］。本項(xiàng)研究旨在評估右旋美托咪定對p38MAPK/NF-κB信號通路的抑制作用及其對卵巢癌免疫力和腫瘤生長的影響的相關(guān)性，結(jié)果表明，右旋美托咪定可抑制p38MAPK/NF-κB信號通路激活并改善卵巢癌的治療結(jié)果及其涉及p38MAPK/NF-κB信號通路激活的潛在機(jī)制，與對照組相比，模型組中p38和NF-κB蛋白表達(dá)增加，右旋美托咪定治療組中，p38和NF-κB蛋白表達(dá)下降，表明右旋美托咪定對p38和NF-κB蛋白合成和分布具有一定調(diào)節(jié)作用，與劃痕實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此，課題組推測卵巢組織中p38和NF-κB蛋白表達(dá)可能增加，而右旋美托咪定可抑制p38和NF-κB蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞侵襲和遷移。

IGF2信號通路在腫瘤細(xì)胞黏附過程中起重要作用，IGF2上調(diào)進(jìn)一步激活I(lǐng)GF1R和INSR表達(dá)。一項(xiàng)針對前列腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，抑制IGF1R和INSR表達(dá)可提高前列腺癌患者化療敏感性。本研究中，qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，卵巢癌大鼠中卵巢組織中IGF2信號通路被激活，IGF1R和INSR表達(dá)增加，給予右旋美托咪定治療后，相關(guān)指標(biāo)下調(diào)，信號通路被抑制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了右旋美托咪定可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，并抑制卵巢癌大鼠癌細(xì)胞侵襲和遷移方，作用機(jī)制可能有以下2方面：右旋美托咪定可減少交感神經(jīng)活動抑制手術(shù)創(chuàng)傷；術(shù)前先發(fā)性鎮(zhèn)痛作用可緩解或消除手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)，緩解免疫功能抑制。

綜上所述，右旋美托咪定在卵巢癌治療中具有重要價(jià)值，右旋美托咪定可通過有效抑制IGF2信號通路活化，降低p38、NF-κB蛋白表達(dá)和血清IL-2和TNF-α水平，從而改善卵巢癌大鼠免疫功能和抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移。