人參皂苷納米點的制備工藝探索研究

張 陽，王新宇，孫天霞，肖利智，匡玉蘭，趙 雨，姜英男

（長春中醫(yī)藥大學，長春 130117）

人參（Panax ginsengC.A.Mey）作為一種植物源性中草藥，自古以來享有“百草之王”的美譽?，F(xiàn)代臨床證明人參有多種治療功效，主要歸因于人參含有大量多種的生物活性物質(zhì)，如人參皂苷，揮發(fā)油，多糖等[1]。其中人參皂苷是人參中最主要生物活性物質(zhì)，很多研究證明其在抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗衰老、抗心律失常、抑制細胞凋亡和免疫功能等方面均有很好的作用[2-5]。目前研究人員已從各類人參制品中分離出了60 多種人參皂苷，根據(jù)化學結(jié)構(gòu)可分為3 種類型：原人參二醇型、原人參三醇型及齊墩果酸型[6]。其中，人參總皂苷是人參根莖提取加工制成的總皂苷，人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1的含量較高，約占人參總皂苷的70%[7]。

碳納米點（carbon nanodots,CDs）作為新興的納米材料，具有良好的熒光光學特性[8-10]。CDs 制備方式多樣，大多研究以水熱反應(yīng)為主，兼有微波反應(yīng)，超聲反應(yīng)等。制備CDs 的來源也十分廣泛：碳納米管、檸檬酸、葡萄糖、氨基酸、高分子聚合物和富碳的普通食品用品，如圓蔥、檸檬汁、廢紙等[11-14]。由于制備成本低、尺寸小、水溶性好、生物相容性高等特點，CDs 近年來一直是納米材料領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點，并在生物醫(yī)療領(lǐng)域展現(xiàn)了獨有的優(yōu)勢和應(yīng)用前景[15-18]。

在生物界大量碳源中，還沒有人將人參作為反應(yīng)源制備納米點并對其化學、生物性質(zhì)進行考察。而我國作為傳統(tǒng)中藥大國，中藥材種類繁多，資源豐富。因此，本實驗預(yù)以人參有效藥用成分為原料，結(jié)合水熱法對人參皂苷納米點制備工藝進行探索，結(jié)果表明合成的人參皂苷納米點具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和熒光特性，并為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 人參總皂苷粉末（上海源葉生物科技有限公司）；蒸餾水（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）；氯化鈉（北京化工廠）；氯化鉀（北京化工廠）；溴化鉀（北京化工廠）；磷酸氫二鈉（北京化工廠）；磷酸二氫鈉（北京化工廠）。

1.2 主要儀器 ALC2100.2 型電子天平（賽多利斯公司），AL204 型電子天平（梅特勒-托利多公司），WP-UP-JY-40 型超純水機（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司），Centrifuge 5804 R 型離心機（德國Eppendorf 公司），WFO-400W 型送風定溫干燥箱（上海愛朗儀器有限公司），Centrifuge-5804r 型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司），C-MAG hS7 型控溫磁力攪拌器（德國IKA 公司），碳支持膜（新興百瑞公司），Shimadzu RF-5301 型熒光光譜儀（日本島津公司），UV-2550 型紫外分光光度計（日本島津公司），Spectra S 型透射電子顯微鏡（賽默飛世爾科技有限公司），Nicolet AVATAR 360 傅里葉紅外光譜儀（Thermo 公司）。

1.3 人參皂苷納米點制備工藝的研究 精密稱取人參總皂苷粉末0.5 g，加入10 mL 去離子水中，磁力攪拌使其溶解。將溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜內(nèi)，控制不同反應(yīng)溫度（140～200 ℃）和不同反應(yīng)時間（2～10 h）。反應(yīng)后，靜置冷卻至室溫，過0.22 μm微孔濾膜，除去大的沉淀物和團聚物，得到人參皂苷納米點溶液，放置于4 ℃保存。

1.4 人參皂苷納米點的外貌形態(tài)、尺寸大小特征 分別取不同反應(yīng)溶液至樣品瓶中，從顏色、氣味、黏稠度、透明度及溶液在室溫下的穩(wěn)定狀態(tài)進行人參皂苷納米點的觀察分析，再利用TEM 觀察尺寸大小。

1.5 人參皂苷納米點的穩(wěn)定性考察

1.5.1 不同pH 對人參皂苷納米點熒光強度的影響 取不同pH（5.8、6.4、7.0、7.4、8.0）的磷酸鹽緩沖溶液，分別加入到170 ℃，10 h 水熱反應(yīng)后的納米點溶液中，混合均勻后，進行熒光強度測試。

1.5.2 不同鹽離子對人參皂苷納米點溶液穩(wěn)定性的影響 取不同濃度KCl和NaCl溶液，分別加入到170 ℃，10 h 水熱反應(yīng)后的納米點溶液中，混合均勻，使最終混合液的鹽濃度分別達到0.2 mol/L 和2 mol/L，測試人參皂苷納米點的熒光光譜。

1.5.3 不同放置時間對人參皂苷納米點溶液穩(wěn)定性的影響 170 ℃，10 h 水熱反應(yīng)后的納米點溶液離心過濾處理完成后，放置于室溫環(huán)境中，分別在0、30、60、90、120、150、180 min 后測試人參皂苷納米點的熒光光譜。

1.6 人參皂苷納米點的基礎(chǔ)性質(zhì)表征

1.6.1 熒光（PL）光譜表征 取不同反應(yīng)條件合成的人參皂苷納米點溶液，進行熒光光譜測試。

1.6.2 紫外-可見光（UV-vis）光譜表征 取人參皂苷納米點溶液（170 ℃，10 h）進行紫外光譜測試。

1.6.3 傅里葉變化紅外（FT-IR）光譜表征 取適量人參皂苷納米點溶液（170 ℃，10 h）加入到被研磨好的KBr 中，烘干后壓片，進行紅外測試。

2 結(jié)果

2.1 不同反應(yīng)條件下人參皂苷納米點的形貌表征 如表1，圖1，2，3 所示，通過宏觀性狀觀察和TEM 共同對不同反應(yīng)條件合成的人參皂苷納米點進行外貌和尺寸大小表征。在檢驗結(jié)果中篩選出合適的人參皂苷納米點的制備工藝條件：200 ℃-6 h，200 ℃-10 h，180 ℃-3 h，180 ℃-6 h，170 ℃-6 h，170 ℃-10 h。這些條件下制備出的人參皂苷納米點尺寸在2～30 nm之間，尺寸分布窄，且碳點分散均勻不發(fā)生聚集，宏觀溶液透明不黏稠，處理后狀態(tài)穩(wěn)定。

表1 部分不同反應(yīng)條件下的人參皂苷納米點的粒徑尺寸，分布和溶液狀態(tài)

圖1 200 ℃條件下人參皂苷納米點TEM 圖

圖2 180 ℃條件下人參皂苷納米點TEM 圖

圖3 170 ℃條件下人參皂苷納米點TEM 圖

2.2 人參皂苷納米點溶液穩(wěn)定性測試 對人參皂苷納米點溶液，進行不同pH、不同鹽離子、不同濃度和不同放置時間下的熒光穩(wěn)定性考察。在不同條件下測得的最佳發(fā)射峰強度總結(jié)，如圖4 所示。納米點溶液最佳發(fā)射峰的熒光強度沒有隨pH、鹽離子濃度和靜置時間的改變而發(fā)生明顯變化。結(jié)果表明制備的人參皂苷納米點性能比較穩(wěn)定，可以為后續(xù)其在生物成像等實驗奠定基礎(chǔ)。

圖4 人參皂苷納米點溶液穩(wěn)定性測試

2.3 人參皂苷納米點的基礎(chǔ)性質(zhì)表征

2.3.1 人參皂苷納米點的熒光光譜分析 對不同反應(yīng)條件制備的人參皂苷納米點溶液進行熒光光譜測試，熒光光譜圖如圖5，人參皂苷納米點溶液都表現(xiàn)出明顯的熒光發(fā)射激發(fā)依賴性，即隨著激發(fā)峰增加，發(fā)射峰位紅移，峰強由最初逐漸增加至最高而后發(fā)生下降。（a）-（f）各個譜圖熒光變化規(guī)律基本相似，熒光發(fā)射都是從藍色向綠色至黃綠色變化，但最佳激發(fā)和最佳發(fā)射峰位隨反應(yīng)條件不同而有所不同。人參皂苷納米點激發(fā)波長范圍在460～495 nm 之間，發(fā)射波長范圍在550～573 nm 之間。

圖5 人參皂苷納米點溶液熒光光譜圖

2.3.2 人參皂苷納米點的UV-vis 光譜分析 反應(yīng)170 ℃，10 h 時，控制其吸光度值在0.2～0.8 范圍內(nèi)。結(jié)果如圖6，人參總皂苷溶液圖譜中沒有明顯的紫外吸收峰，皂苷糖苷類分子結(jié)構(gòu)不存在共軛電子對和苯環(huán)。而人參皂苷納米點溶液在280 nm 處有明顯的吸收峰，表明其存在活躍電子躍遷。人參皂苷納米點組吸收峰在280 nm 處，與文獻報道的大多數(shù)碳點在260～320 nm 有吸收帶相吻合，也可以認為是sp2雜化碳引起的n →π*躍遷[19]。

2.3.3 人參皂苷納米點的FT-IR 光譜解析 由人參皂苷納米點的紅外光譜圖，圖7 分析可知，3 405 cm-1處出現(xiàn)的峰由O-H 的伸縮振動引起的，2 929 cm-1處出現(xiàn)的峰是C-H 伸縮振動引起，1 653 cm-1處出現(xiàn)的峰是由C=O 拉伸振動引起的；1 397 cm-1處出現(xiàn)的峰是由C-H 彎曲震動引起的，1 078 cm-1處出現(xiàn)的峰的是C-O的吸收峰[20]。FT-IR 紅外光譜表明人參皂苷納米點含有大量的羥基和羧基等多種親水基團，也說明制備的納米點具有良好的水溶性和生物相容性。

圖6 人參皂苷納米點的UV-vis 光譜分析

圖7 人參皂苷納米點的FT-IR 紅外光譜圖

3 討論

本研究以人參有效活性成分人參總皂苷作為反應(yīng)源，一步水熱法制備出了人參皂苷納米點。通過對人參皂苷納米點溶液的狀態(tài)，粒徑大小和分散均勻度等微觀形貌，最終篩選出制備人參總皂苷的工藝：反應(yīng)溫度170 ℃，反應(yīng)6 h、8 h；反應(yīng)溫度180 ℃，反應(yīng)3 h、6 h；反應(yīng)溫度200 ℃，反應(yīng)6 h、10 h。制備出的人參皂苷納米點溶液狀態(tài)穩(wěn)定，溶液透明，伴有中藥香氣。納米點粒徑集中在2～30 nm，粒徑分布比較均勻，粒子在水中分散性良好不易發(fā)生聚集。實驗發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)溫度越高，人參總皂苷水熱反應(yīng)溶液的狀態(tài)越穩(wěn)定，透明度高，越不會發(fā)生溶液變色和渾濁，且納米點的粒徑越小越均勻。若要獲得性質(zhì)優(yōu)良且穩(wěn)定的人參皂苷納米點，需要反應(yīng)溫度在170 ℃以上，且時間至少大于3 h，這樣才能使得皂苷分子在水熱反應(yīng)中克服能量壁壘，自組裝成點。

制備出人參皂苷納米點對pH（5.8～8.0）、無機鹽（濃度在0.2～2 mol/L）均具有較好的熒光穩(wěn)定性。人參皂苷納米點溶液都表現(xiàn)出了明顯的熒光發(fā)射激發(fā)依賴性，即隨著激發(fā)峰增加，發(fā)射峰位紅移。最佳激發(fā)波長范圍在460～495 nm 之間，最佳發(fā)射波長范圍在550～573 nm 之間。對制備溶液的TEM 微觀尺寸形貌表征結(jié)果，可以確認以人參總皂苷為原料，成功制備出了新型人參皂苷納米點。紫外光譜、紅外光譜測試表明人參皂苷納米點表面存在大量的親水基團和豐富的官能團，證明其有良好的水溶性。后序?qū)⑦M行細胞及藥理活性研究，為人參皂苷納米點的生物熒光標記探針開發(fā)方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。