液相色譜法測定飲料中日落黃、檸檬黃和胭脂紅的含量

李 娟,張 彤，龍 麗

(1.綿陽師范學院化學與化學工程學院，四川綿陽 621000；2.綿陽市安州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站，四川綿陽 622651)

0 引言

人工合成色素的檢測方法有高效液相色譜法[1-5]、薄層色譜法[6]、紫外-可見分光光度法[7]、液一質(zhì)聯(lián)用法[8]等.很多方法包括前處理只適用于檢測基質(zhì)比較簡單的食品[9-10]，對于一些蛋白質(zhì)含量高且基質(zhì)復雜的食品(如：海產(chǎn)品，腌制蔬菜等)卻不能準確測定其中的含量，而國家標準《食品中合成著色劑的測定》 (GB/T 5009. 35-2003)[4]中規(guī)定的高效液相色譜法、薄層色譜法和示波極譜法來測定色素，這些方法前處理步驟繁瑣，費時，成本高.

為了方便檢測不同飲料中檸檬黃、胭脂紅和日落黃的含量，本文建立了同時檢測以上3種合成色素的方法，該方法適用于各類不同飲料中日落黃、檸檬黃和胭脂紅的測定，適用范圍廣、準確、操作簡便、成本低且重復性好.

1 日落黃、檸檬黃、胭脂紅的介紹和含量測定的研究現(xiàn)狀

1.1 日落黃、檸檬黃、胭脂紅的簡介

日落黃(sunset yellow，簡稱 SY)[11](圖1-1)，又名食用黃色5號(日本)、食用黃色3號、橘黃、夕陽黃、晚霞黃，是一種水溶性偶氮類著色劑.化學名稱為1-(4′-磺基-1′-苯偶氮)-2-萘酚-6-磺酸二鈉鹽，分子式為C16H10N2Na2O7S2，相對分子質(zhì)量452.37，是一種常用的人工食用色素，性質(zhì)穩(wěn)定，價格較低，廣泛用于食品和藥物的著色..

檸檬黃又稱酒石黃、肼黃[12](圖1-2).分子式為C16H9N4O9S2Na3，化學名稱為1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三鈉鹽，食用檸檬黃外觀為橙黃色粉末，微溶于酒精，不溶于其他有機溶劑.主要生產(chǎn)原料為對氨基苯磺酸及酒石酸，由對氨基苯磺酸經(jīng)重氮化，與1-(4-磺基苯基)-3-羧基-5-吡唑啉酮在堿性溶液中偶合、精制而成.大多用于食品、飲料、藥品、化妝品、飼料、煙草、玩具、食品包裝材料等的著色，也可以用于羊毛、蠶絲的染色.

胭脂紅，又名食用赤色102號(日本)、食用紅色7號、麗春紅4R、大紅、亮猩紅[13](圖1-3)，為水溶性偶氮類著色劑.分子式為C22H20O13，化學名稱為1-(4′-磺酸基-1′-萘偶氮)-2-萘酚-6,8-二磺酸三鈉鹽，是莧菜紅的異構體.胭脂紅(Ponceau 4R)是目前我國使用最廣泛、用量最大的一種單偶氮類人工合成色素.胭脂紅作為食品色素可用于果汁飲料、配制酒、碳酸飲料、糖果、糕點、冰淇淋、酸奶等食品的著色，而不能用于肉干、肉脯制品、水產(chǎn)品等食品中，主要是為了防止一些不法分子通過使用色素將不良的原料肉如變質(zhì)肉的外觀掩蓋起來，欺騙消費者.

圖1 日落黃Fig.1 The sample of sunset yellow圖2 檸檬黃Fig.2 The sample of tartrazine圖3 胭脂紅Fig.3 The sample of carmine

1.2 日落黃、檸檬黃、胭脂紅含量測定的研究現(xiàn)狀

檸檬黃、日落黃、胭脂紅色素是世界上最常用的合成食用色素，在飲料調(diào)色方面起著至關重要的作用.而作為廣泛應用于飲料中的合成食用色素，消費者對這些色素的超標使用和食品安全也越來越關注，推動研究學者們不斷地對這幾種色素的測定進行研究.

劉奮等介紹了用高效液相色譜法配合DAD檢測器對檸檬黃、胭脂紅、日落黃含量進行測定的方法[14]，流動相為甲醇和0.02 mol/L乙酸銨，梯度洗脫.針對各種合成色素的不同出峰時間，分別選用其最佳檢測波長檢測，大大提高檢測靈敏度，并有效克服了在254 nm處的梯度洗脫時造成的基線漂移，提高了定量準確性.

林壯森等介紹了采用分光光度法檢測飲料中檸檬黃和日落黃的方法[15-16]，通過測定飲料在426 mm和482 nm波長處的吸光度，與檸檬黃和日落黃標準溶液比較，計算樣品中檸檬黃和日落黃的含量.

Medeiros等采用摻硼金剛石電極結(jié)合流動注射分析，實現(xiàn)了對飲料和明膠樣品中4種合成色素(檸檬黃、日落黃、亮藍和SY)的同時檢測[17].

2 液相色譜法測定三種色素含量的實驗原理

日落黃、檸檬黃、胭脂紅均具有苯磺酸鈉結(jié)構，本文選用Cleanert PWAX-SPE混合型弱陰離子交換柱和Cleanert PA聚酰胺小柱，用以吸附不同飲料中的合成著色劑，選用氨化甲醇洗脫，采用Venusil? XBP C185 μm 4.6×150 mm，以0.02 mol/L乙酸銨溶液和色譜純甲醇為流動相梯度洗脫，最后再經(jīng)反相色譜分離.根據(jù)保留時間進行定性和比較峰面積進行定量.這種方法濃縮時間短，適用于大批量樣品的同時檢測.

3 實驗部分

3.1 實驗藥品

甲醇(分析純佛山予華儀器科技有限公司、色譜純西安天茂化工有限公司)；乙醇、甲酸、檸檬酸、氨水(優(yōu)級純佛山予華儀器科技有限公司)；乙酸銨(色譜純西安天茂化工有限公司)；檸檬黃標準儲備液、日落黃標準儲備液、胭脂紅標準儲備液(標準物質(zhì)500 μg/mL)深圳市時得佳科技有限公司)；超純水(該實驗所用水均為超純水).

3.2 主要實驗儀器

賽默飛高效液相色譜儀(UltiMate3000美國賽默飛世爾熱電儀器有限公司)；PH計(PHS-25型北京合悅達科技有限公司)；圓形水浴氮吹儀(CM-36型北京成萌偉業(yè)科技有限公司)；多管真空固相萃取儀(5982-9110安捷倫科技(中國)有限公司)；固相萃取柱(Cleanert PWAX杭州賽析科技有限公司)；溶劑過濾器(AL-01北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司)

3.3 實驗條件

實驗所需條件如下所示：

家長不了解學生在校的心理情況，學校通常在學生發(fā)生了一些重大的意外情況，如學生突發(fā)心理危機事件、嚴重人際沖突、學籍異動、嚴重違反校規(guī)校紀乃至觸犯法律等，為了解決危機，事后才通知家長[2]。家長的參與具有被動性和臨時性。

色譜柱：Venusil? XBP C185 μm 4.6×150 mm；流速：1.0 mL /min；進樣量：20 μL；波長：254 nm；柱溫：35 ℃.

3.4 實驗步驟

3.4.1 樣品提取 用分析天平分別稱取市售10 g(精確至0.000 1g)茶類飲料(康師傅冰紅茶、和其正)、果蔬汁類飲料(統(tǒng)一鮮橙多、農(nóng)夫果園30%混合果蔬)、碳酸飲料(芬達、美年達)、功能飲料(東鵬特飲、樂虎)放入100 mL燒杯中，含二氧化碳的樣品(芬達、美年達)先加熱以除去二氧化碳.

3.4.2 標準系列溶液的配制 配制不同濃度的日落黃、檸檬黃、胭脂紅標準系列溶液.

3.4.3 固相萃取柱凈化 Cleanert PWAX-SPE在全自動固相萃取儀中，依次向Cleanert PWAX-SPE小柱中加入6 mL甲醇，6 mL pH=6的水，完成SPE小柱的凈化過程.將全部提取液轉(zhuǎn)移到柱子中，然后再用6 mL水 (pH=4)、6 mL甲醇-甲酸溶液(6∶4) 和6 mL水 (pH=6) 淋洗；然后通入空氣約5 min吹干小柱，最后用6 mL 2% 氨化甲醇洗脫并接收洗脫液，將洗脫液置于圓形水浴氮吹儀中，在50 ℃水浴中用氮氣吹干，用1 mL超純水溶解并定容，經(jīng)0.45 μm水系濾器過濾到樣品瓶中，供HPLC待測.

3.4.4 測定 取相同體積的樣品溶液和標準系列溶液分別置于高效液相色譜儀中按照3.3所示的實驗條件進行測定，根據(jù)保留時間定性，外標峰面積定量.

4 結(jié)果與討論

4.1 溶液標準曲線的繪制

按照3.3所示的實驗條件，將日落黃、檸檬黃、胭脂紅標準系列工作溶液注人液相色譜儀中，測定相應的峰面積，得到日落黃標準系列濃度與峰面積的關系，黃標準曲線，如圖4、5、6所示.

圖4 日落黃標準曲線圖Fig.4 Standard curve of sunset yellow圖5 檸檬黃標準曲線圖Fig.5 Standard curve of lemon yellow圖6 胭脂紅標準曲線圖Fig.6 Standard curve of carmine red

4.2 各合成色素測定的標準曲線方程和相關系數(shù)

根據(jù)3.3設定的實驗條件測得日落黃、檸檬黃、胭脂紅在設定濃度范圍內(nèi)，具有線性關系良好的標準曲線，日落黃、檸檬黃、胭脂紅標準曲線的回歸方程和相關系數(shù)見表2.

4.3 三種合成色素標準溶液色譜圖

圖7 日落黃、檸檬黃、胭脂紅混合標準溶液色譜圖Fig.7 Chromatogram of mixed standard solution of sunset yellow, tartrazine, and carmine

4.4 樣品中三種合成色素的測定與結(jié)果

4.4.1 樣品中日落黃的測定與結(jié)果 取3.5.3處理好的樣品液，在波長為254 nm處測定其的峰面積，平行測定三次，取平均值.結(jié)果如表5所示：

表5 飲料中日落黃的含量表Tab.5 Content table of sunset yellow in beverage

由表5可知，不同類飲料中，果蔬汁類飲料(統(tǒng)一鮮橙多、農(nóng)夫果園30%混合果蔬)中日落黃含量較茶類飲料(康師傅冰紅茶、和其正)、碳酸飲料(芬達、美年達)和功能飲料(東鵬特飲、樂虎)的高，但均遠小于《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》(GB2760-1996)中規(guī)定的最大使用量.

4.4.2 樣品中檸檬黃的測定與結(jié)果 取3.5.3處理好的樣品液，在波長為254 nm處測定其的峰面積，平行測定三次，取平均值.結(jié)果如表6所示：

表6 飲料中檸檬黃的含量表Tab.6 Content table of tartrazine in beverage

由表6可知，不同類飲料中，果蔬汁類飲料(統(tǒng)一鮮橙多、農(nóng)夫果園30%混合果蔬)中檸檬黃含量比茶類飲料(康師傅冰紅茶、和其正)、碳酸飲料(芬達、美年達)和功能飲料(東鵬特飲、樂虎)的高，但均遠小于《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》(GB2760-1996)中規(guī)定的最大使用量.

4.4.3 樣品中胭脂紅的測定與結(jié)果 取3.5.3處理好的樣品液，在波長為254 nm處測定其的峰面積，平行測定三次，取平均值.結(jié)果如表7所示：

表7 飲料中胭脂紅的含量表Tab.7 Content table of carmine in beverage

由表7可知，不同類飲料中，果蔬汁類飲料(統(tǒng)一鮮橙多、農(nóng)夫果園30%混合果蔬)中檸檬黃含量比茶類飲料(康師傅冰紅茶、和其正)、碳酸飲料(芬達、美年達)和功能飲料(東鵬特飲、樂虎)的高，但均遠小于《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》(GB2760-1996)中規(guī)定的最大使用量.

4.4.4 日落黃、檸檬黃、胭脂紅的加標回收率和精密度測定 為了驗證該方法的可靠性，進行了加標回收實驗.準確稱取不含日落黃、檸檬黃、胭脂紅的不同類飲料10 g (精確至0.0001 g)，分別加入濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0 μg/mL的混合標準溶液做加標回收實驗，每個加標水平平行測定7次，以此來驗證該方法的回收率和精密度，其結(jié)果如表8所示：

表8 加標回收率和精密度測定結(jié)果表(n=7)Tab.8 Results of standard recovery rate and precision measuring (n=7)

由表8可知日落黃、檸檬黃、胭脂紅的平均加標回收率為82.8%～102.36%,相對標準偏差為0.65%～1.32%.

5 結(jié)論

本文選用Cleanert PWAX-SPE 混合型弱陰離子交換柱和Cleanert PA聚酰胺小柱，用以吸附不同飲料中的合成著色劑，選用氨化甲醇洗脫，采用Venusil? XBP C18 5 μm 4.6×150 mm，以0.02 mol/L乙酸銨溶液和色譜純甲醇為流動相梯度洗脫，最后再經(jīng)反相色譜分離.根據(jù)保留時間定性和比較峰面積進行定量得出：在市售常見的幾類飲料中，果蔬汁類中日落黃、檸檬黃、胭脂紅的含量較另外種類飲料的含量要高.其中茶類飲料中，康師傅冰紅茶的日落黃含量為0.002 7 g/kg、檸檬黃含量為0.002 9 g/kg、胭脂紅含量為0.002 9 g/kg；和其正的日落黃、檸檬黃、胭脂紅含量均為未檢出.果蔬汁類飲料中，鮮橙多的日落黃含量為0.003 2 g/kg、檸檬黃含量為0.002 5 g/kg、胭脂紅含量為0.001 1 g/kg；農(nóng)夫果園30%混合果蔬的日落黃含量為0.003 5 g/kg、檸檬黃含量為0.003 2 g/kg、胭脂紅含量為0.003 0 g/kg.碳酸飲料中，芬達的日落黃含量為0.001 1 g/kg、檸檬黃含量為0.000 5 g/kg、胭脂紅含量未檢出；美年達的日落黃含量為0.000 2 g/kg、檸檬黃含量為0.000 2 g/kg、胭脂紅含量未檢出.功能飲料中，東鵬特飲和樂虎三種合成色素含量均為未檢出.

由實驗數(shù)據(jù)可知，果蔬汁類飲料中合成色素較其他三類飲料相比含量最多，其中農(nóng)夫果園30% 混合果蔬的三種合成色素都是最高的.而在日落黃、檸檬黃、胭脂紅這三種合成色素種，日落黃、檸檬黃含量相對較高，胭脂紅含量最少.同時在這幾類飲料中，日落黃、檸檬黃、胭脂紅的含量都遠小于其檢出限和中國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》中規(guī)定的最大使用量，說明這些飲料的色素添加要求都是符合中國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》的.