匍匐翦股穎HSP26.7基因啟動(dòng)子的表達(dá)分析

魏佳興，朱俊飛，董康挺，王亭亭，秦玉嬌，郭琦，魏雨佳，李軍霖，邊秀舉，孫鑫博

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/河北省作物生長(zhǎng)調(diào)控實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

熱激蛋白(Heat-Shock Protein,HSP)是生物在逆境脅迫的情況下(如干旱、高溫等不良環(huán)境)，體內(nèi)才開始合成或合成量急劇增加的具有分子伴侶活性的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)[1-2]。植物體內(nèi)的一些功能蛋白在逆境條件下常導(dǎo)致高級(jí)構(gòu)象被破壞，從而影響蛋白質(zhì)功能，最終影響生物的生理代謝[3]。分子伴侶雖不具有催化活性，但能協(xié)助失活蛋白重新恢復(fù)活力，構(gòu)建正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而減少不良環(huán)境引起的蛋白變性對(duì)生物體的影響[4]。因此，熱激蛋白是植物對(duì)抗逆境的重要蛋白質(zhì)。根據(jù)熱激蛋白分子量的大小，熱激蛋白可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及sHSP 5大家族[5-6]。小熱激蛋白(sHSP)是熱激蛋白中的一個(gè)重要家族，雖然其分子量較小，但種類豐富，在植物體內(nèi)普遍存在[7]。研究發(fā)現(xiàn)熱激蛋白均對(duì)高溫脅迫具有敏感性[1]。小熱激蛋白的表達(dá)不僅限于高溫誘導(dǎo)，且一個(gè)亞家族的小熱激蛋白的表達(dá)方式與效應(yīng)蛋白也不盡相同。除了受外界環(huán)境誘導(dǎo)外，許多小熱激蛋白的表達(dá)還具有時(shí)空特異性，即在植物不同的發(fā)育階段，小熱激蛋白的表達(dá)量也表現(xiàn)出明顯的變化。

匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)是一類性狀優(yōu)良的多年生冷季型草坪草，耐陰能力較強(qiáng)，具有一定的耐踐踏以及耐低修剪能力，常被用作高爾夫球場(chǎng)的果嶺草，當(dāng)修剪至3～5 mm高度時(shí)可以形成高質(zhì)量草坪[8-9]；耐寒但不耐熱，在絕大多數(shù)北方地區(qū)可安全過(guò)冬，但在河北省一些地區(qū)常出現(xiàn)“夏枯”現(xiàn)象，極大地影響了草坪的使用功能以及維護(hù)成本[10]。在匍匐翦股穎熱激蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)較為抗熱的品種往往要比不抗熱品種多出1～2類熱激蛋白[11]。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)黃炳茹課題組對(duì)熱激蛋白的研究已經(jīng)有了一定的成果[12]，但是目前對(duì)匍匐翦股穎中小熱激蛋白啟動(dòng)表達(dá)的信息傳遞方式以及與下游蛋白互作的具體模式尚不清晰。因此還需從微觀領(lǐng)域進(jìn)一步研究小熱激蛋白的具體構(gòu)造以及功能。Luo Hong課題組在匍匐翦股穎抗非生物脅迫的研究中鑒定出3個(gè)sHSPs：AsHSP17，AsHSP26.7和AsHSP26.8。前期的研究表明，AsHSP26.7的表達(dá)受到高溫脅迫的誘導(dǎo)，并且分別在過(guò)表達(dá)水稻SUMOE3連接酶基因OsSIZ1和轉(zhuǎn)水稻microRNA393的轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎中的表達(dá)有所增加，且轉(zhuǎn)基因植株的抗熱性都有所增加[13-15]。因此，AsHSP26.7基因在匍匐翦股穎響應(yīng)高溫脅迫中起著重要作用。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)于AsHSP26.7啟動(dòng)子的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)基因克隆得到HSP26.7的啟動(dòng)子序列，并進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析、轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS組織化學(xué)染色和轉(zhuǎn)基因擬南芥脅迫后的表達(dá)分析，來(lái)闡述該基因啟動(dòng)子的表達(dá)模式，從而為探討HSP26.7基因的功能提供一定的理論和分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用匍匐翦股穎Penn-A4品種，擬南芥為Columbia生態(tài)型，兩者皆由河北省作物生長(zhǎng)調(diào)控實(shí)驗(yàn)室自行保存，于人工氣候室進(jìn)行養(yǎng)護(hù)繁殖，培養(yǎng)條件為：23℃，16 h光照，光照強(qiáng)度為6 000 lx。

實(shí)驗(yàn)所用pEASY-T1 Simple Cloning Vector，PCRmix，限制性內(nèi)切酶均購(gòu)于Takara公司，GUS試劑采購(gòu)于奧博萊公司，載體pCAMBIA1301、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101均由本實(shí)驗(yàn)室自行保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 匍匐翦股穎HSP26.7啟動(dòng)子的克隆 利用CTAB法分離純化得到匍匐翦股穎的DNA，從NCBI上查詢得到HSP26.7的起始密碼子之前的2 403 bp的序列作為啟動(dòng)子，根據(jù)所得到的序列信息設(shè)計(jì)了其前后引物HSP26.7pro-F1和HSP26.7pro-R1，并以匍匐翦股穎DNA為模板對(duì)HSP26.7基因啟動(dòng)子進(jìn)行體外擴(kuò)增。擴(kuò)增所得產(chǎn)物連接T載體并測(cè)序，序列無(wú)誤后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

HSP26.7pro-F1:5′- TA TGA AAG GCA TCA AAT AGC TCT-3′

HSP26.7pro-R1:5′- TG CTC AAG CGA GAA TCA CAG -3′

1.2.2 生物信息學(xué)分析 通過(guò)啟動(dòng)子序列分析軟件PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)將已知的HSP26.7的基因啟動(dòng)子序列與一些已經(jīng)被證實(shí)了功能的順式作用元件進(jìn)行比對(duì)，尋找序列中可能參與環(huán)境脅迫、信號(hào)通路和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的順式作用元件。

1.2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 為了檢測(cè)HSP26.7基因啟動(dòng)子是否成功被克隆以及能否在植物體內(nèi)正常表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了HSP26.7基因啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因融合的表達(dá)載體pHL-pHSP26.7-GUS/35S-bar(圖1)。具體過(guò)程為：以HSP26.7pro-F1和HSP26.7pro-R1為前后引物，在前后引物的兩端分別添加BamH I酶切位點(diǎn)，用1.2.1的方法進(jìn)行體外擴(kuò)增。通過(guò)電泳檢測(cè)所得的條帶與預(yù)想大小是否一致，并將所需的目標(biāo)條帶切割分離后連接pEASY-T1 Simple Cloning Vector，挑選連接方向正確的質(zhì)粒，用BamH I進(jìn)行單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)分離后再連入pSB表達(dá)載體。體系如下：

2×Rapid Ligation Buffer10μLpSB1 μL回收片段9 μLT4 ligase1 μL

連接后在人工培養(yǎng)箱內(nèi)4℃，放置12 h。用連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并通過(guò)菌落PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化是否成功，連接方向是否正確，再提取其質(zhì)粒。將序列正確的重組質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。

圖1 植物表達(dá)載體pHLHSP26.7pro-GUS/35S-bar的構(gòu)建Figure 1 Construction of plant expression vector pHLHSP26.7pro-GUS/35S-bar

1.2.4 擬南芥的轉(zhuǎn)化與檢測(cè) 用花序浸染法[16]轉(zhuǎn)化擬南芥野生型。T0代種子收獲后，播種于育苗盤，用草丁膦除草劑進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的篩選。篩選出的陽(yáng)性苗進(jìn)行轉(zhuǎn)基因PCR檢測(cè)。以擬南芥陽(yáng)性苗基因組DNA為模板，以引物HSP26.7F和HSP26.7R對(duì)HSP26.7進(jìn)行體外擴(kuò)增，以引物barF和barR對(duì)bar基因( X17220.1)進(jìn)行體外擴(kuò)增。

barF:5′-GTCTGCACCATCGTCAACCACTAC-3′barR:5′-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3′

PCR擴(kuò)增體系：

10× PCR buffer2.5 μLdNTP mix (2.5mM each)0.5 μLHSP26.7F/barF (10μM)1.0 μLHSP26.7R/barF (10μM)1.0 μLDNA模板1.0 μLTaq DNA polymerase(2.5 U/mL)0.5 μLddH2O補(bǔ)至25μL

反應(yīng)條件：

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的GUS組織化學(xué)染色 將WT擬南芥和轉(zhuǎn)化后的擬南芥移栽至苗床，基質(zhì)為蛭石/營(yíng)養(yǎng)土混合物(v/v=3∶1)，在溫室內(nèi)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3 000 lx，16 h光照，20℃。保持良好的肥水供應(yīng)使其生長(zhǎng)勢(shì)保持一致，待到開花時(shí)進(jìn)行處理。熱處理：植株置于40℃培養(yǎng)箱中處理24 h；鹽處理：將植株根部浸泡在175 mmol/L NaCl溶液8 h；干旱處理：將植株從基質(zhì)中挖出，洗凈根部，用濾紙吸去植株上的水分，將植株放置在實(shí)驗(yàn)室的濾紙上2 h。處理后將植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。

GUS染液的配制(10 mL)：

0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH7.2)5 mL10% Triton X0.2 mL0.1 mol/L 鐵氰化鉀0.2 mL0.1 mol/L 亞鐵氰化鉀0.2 mL0.1 mol/L X-Gluc0.2 mLddH2O補(bǔ)至10 mL

將生長(zhǎng)正常的擬南芥植株取樣迅速浸泡在上述染液中，真空浸泡30 min，37℃避光溫育12 h。棄染液，95%乙醇脫色，再將樣品放入70%乙醇中待樣品恢復(fù)原有形態(tài)后進(jìn)行切片觀察。染出藍(lán)色的組織制作石蠟切片，置于顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 匍匐翦股穎HSP26.7啟動(dòng)子的克隆與序列分析

以HSP26.7pro-F1和HSP26.7pro-R1分別為前后引物，用提取的匍匐翦股穎DNA為模板進(jìn)行體外擴(kuò)增。電泳結(jié)果表明，在約2 500 bp處有一明顯條帶，其大小與預(yù)期結(jié)果相似(圖2)。將此膠切下來(lái)由Takara公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用PlantCARE軟件進(jìn)行順式元件比對(duì)分析。結(jié)果顯示HSP26.7基因啟動(dòng)子不僅具有響應(yīng)高溫脅迫的HSE元件和響應(yīng)干旱脅迫的MBS元件等與植物抗逆性有關(guān)的順式元件，還有RY-element，Skn-1 motif等參與種子生殖生長(zhǎng)的順式元件(表1)。

圖2 匍匐翦股穎HSP26.7基因啟動(dòng)子的克隆Fig.2 Cloning of HSP26.7 gene promoter from Agrostis stolonifera L.(M: Marker;1:HSP26.7 gene promoter)注：M：Marker；1：HSP26.7基因啟動(dòng)子

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測(cè)結(jié)果

電泳檢測(cè)結(jié)果顯示,在2 500 bp處有一明顯條帶，表明HSP26.7啟動(dòng)子已經(jīng)整合到擬南芥基因組中(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR detection results of transgenic Arabidopsis thaliana

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有在高溫誘導(dǎo)下的擬南芥植株才能啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)，在正常生長(zhǎng)以及干旱和鹽脅迫的情況下并未檢測(cè)到GUS的表達(dá)(圖4)。染色結(jié)果表明，染色區(qū)域主要集中在植株頂部的生殖器官當(dāng)中(花或剛剛抽穗的角果中)，還有少量染色區(qū)域集中在植株葉片的基部(圖4A)。生殖器官中花藥和花絲頂部以及雌蕊的柱頭內(nèi)的表達(dá)相對(duì)較多(圖4B)?；ㄋ幒椭^染色較重的區(qū)域集中在花藥和柱頭的頂部(圖4C)。

表1 匍匐翦股穎HSP26.7基因啟動(dòng)子部分順式元件預(yù)測(cè)

圖4 HSP26.7基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS組織染色Fig.4 Analysis of GUS activity in HSP26.7 promoter transgenic Arabidopsis注：A：轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS染色。1：正常生長(zhǎng)的植株；2：40℃處理8h；3：40℃處理24 h；4：鹽處理8h；5：干旱處理2 h。B：轉(zhuǎn)基因擬南芥熱處理24 h花的GUS染色。6花序；7小花。C：轉(zhuǎn)基因擬南芥熱處理24 h花器官GUS染色。8：花藥和柱頭；9：花藥和花粉粒；10：柱頭。

3 討論

小熱激蛋白是植物對(duì)抗逆境脅迫的一種重要的蛋白因子，屬于分子伴侶的一種，幫助靶蛋白完成正確的折疊，形成正常的構(gòu)象，從而使靶蛋白正常發(fā)揮功能，在植物面對(duì)高溫脅迫時(shí)起到重要作用[1-2]。小熱激蛋白相關(guān)功能的研究在草坪草中也有一定的進(jìn)展[12]，其中，匍匐翦股穎是一類性狀極其優(yōu)良的草種，但由于其耐熱性差，導(dǎo)致夏季的養(yǎng)護(hù)管理成本較高，極大地影響了應(yīng)用[10]。小熱激蛋白的過(guò)表達(dá)則為改善匍匐翦股穎在高溫下的性狀表現(xiàn)提供了一種可能。盡管已有資料指出小熱激蛋白會(huì)受外界環(huán)境以及某些生理生化條件誘導(dǎo)，但是對(duì)于小熱激蛋白感受逆境信號(hào)的機(jī)理以及改善植物抗逆性的機(jī)制尚不明確，本研究明確了小熱激蛋白的表達(dá)部位以及表達(dá)的時(shí)空特異性，為HSP26.7基因的啟動(dòng)子的研究提供了理論基礎(chǔ)。

啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因上游、能夠與RNA聚合酶特異識(shí)別并結(jié)合的一段DNA序列，雖不具有轉(zhuǎn)錄與翻譯活性，卻是在轉(zhuǎn)錄水平上基因表達(dá)調(diào)控的中心[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSP26.7基因的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)特定的引物，將其克隆出來(lái)并轉(zhuǎn)化了擬南芥。經(jīng)過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)該序列除了具有基本的啟動(dòng)子特征外，還有包含很多特異的順式作用元件[18]，響應(yīng)高溫誘導(dǎo)的順式元件和與響應(yīng)干旱誘導(dǎo)的順式元件，由此推測(cè)sHSP26.7不僅僅受高溫誘導(dǎo)表達(dá)，在干旱處理下也可能會(huì)表達(dá)[19]。除此之外本研究還在啟動(dòng)子序列中找到了RY-element和Skin-1 motif等生殖生長(zhǎng)的相關(guān)順式元件。由此推測(cè)sHSP26.7可能在植物不同的生長(zhǎng)階段的表達(dá)不同，可能在生殖生長(zhǎng)階段表達(dá)較高。

在幾種常見(jiàn)的逆境(高溫、干旱、鹽處理)脅迫處理下進(jìn)行GUS染色，結(jié)果表明僅在熱脅迫條件下GUS基因的表達(dá)并顯色，即HSP26.7基因啟動(dòng)子才能激活，說(shuō)明高溫誘導(dǎo)能夠激活或增加熱激蛋白基因的表達(dá)，這與擬南芥HSP70-1、高粱HSP70、葉用萵苣LsHSP70-2711等基因相同[20]。染色結(jié)果還進(jìn)一步表明，染色區(qū)域主要集中在花器官的頂部。這與臘梅熱激蛋白HSP1的啟動(dòng)子類似，該基因啟動(dòng)子在葉和根中幾乎檢測(cè)不到GUS活性，而在莖、花瓣、雄蕊和雌蕊中檢測(cè)到GUS的表達(dá)[21]。此外在大豆GmbZIP33基因轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS的表達(dá)也與本研究相似[16]。本研究結(jié)果表明，植物的不同部位HSP26.7基因啟動(dòng)子的表達(dá)模式不同。本研究還發(fā)現(xiàn)GUS主要在花藥內(nèi)的花粉粒和柱頭頂端的組織中表達(dá)。而HSP26.7基因啟動(dòng)子也含有與生殖發(fā)育相關(guān)的順式元件(表1)，這些結(jié)果表明HSP26.7基因很可能與植物的生殖生長(zhǎng)，種子發(fā)育密切相關(guān)。HSP26.7啟動(dòng)子序列中也含有響應(yīng)干旱的元件，但是本研究中干旱處理后GUS表達(dá)量并沒(méi)有顯著變化，可能是由于試驗(yàn)處理方式、時(shí)間或者是不同物種而出現(xiàn)的結(jié)果，其具體原因還需要做進(jìn)一步的研究和探討。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)克隆了匍匐翦股穎中HSP26.7基因的啟動(dòng)子，并研究了其生物學(xué)功能。結(jié)果表明，HSP26.7啟動(dòng)子含有高溫誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件(HSE，AT-rich element和TATA等)，也含有與生殖生長(zhǎng)相關(guān)的順式作用元件(RY-element和Skin-1 motif等)。GUS染色結(jié)果說(shuō)明，HSP26.7基因啟動(dòng)子只有在高溫脅迫下才能被檢測(cè)出來(lái)，并且主要表現(xiàn)在花粉粒、柱頭組織及葉基中。說(shuō)明HSP26.7只在高溫脅迫下表達(dá)且具有組織特異性，主要在生殖器官中表達(dá)，可能與植物的生殖生長(zhǎng)有關(guān)。