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    高通量測序技術(shù)研究附子理中丸對脾陽虛IBS-D大鼠腸道菌群的影響

    2021-05-27 03:18:08林夏黃友楊莎莎魏馨怡傅超美李銳張臻
    關(guān)鍵詞:陽虛附子造模

    林夏,黃友,楊莎莎,魏馨怡,傅超美,李銳,張臻

    (西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川 成都 611137)

    《靈樞》云:“邪在脾胃,則病肌痛。陽氣有余,陰氣不足,則熱中善饑;陽氣不足,陰氣有余,則寒中腸鳴腹痛?!盵1]《素問》曰:“清氣在下,則生飧泄。”[2]故脾胃虛弱,中陽不健,脾運(yùn)化升清功能失司,水谷糟粕混雜而下,則致泄瀉。由于現(xiàn)代環(huán)境、生活方式、工作節(jié)奏的改變,勞倦過度、飲食失節(jié)、過食生冷辛辣等現(xiàn)象常見,致使胃腸道疾病在現(xiàn)代疾病譜中占據(jù)極其重要的地位。目前最常見的功能性胃腸病是腹瀉型腸易激綜合征(Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome,IBS-D),其以反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、大便溏薄為臨床主要表現(xiàn),該病屬于中醫(yī)泄瀉范疇,主要病機(jī)為脾陽虛[3-6]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對IBS-D的發(fā)病機(jī)制并未完全明確,但大量研究表明IBS-D與腸道菌群紊亂密切相關(guān)[7-10]。

    腸道菌群可以通過和宿主進(jìn)行共代謝參與到機(jī)體的各項(xiàng)生理活動(dòng)中,是機(jī)體不可缺少的一個(gè)“器官”,被稱為“人體第二基因組”[11-12]。在長期進(jìn)化過程中,腸道菌群與宿主形成了能相互交流物質(zhì)和信息的腸道微生態(tài),腸道微生態(tài)紊亂是各種疾病的誘發(fā)因素[13-14]。研究發(fā)現(xiàn),IBS-D機(jī)體的腸道菌群密集度、多樣性明顯降低,具體表現(xiàn)有腸桿菌數(shù)量升高,乳桿菌、雙歧桿菌、類桿菌數(shù)量降低[7]。

    附子理中丸出自宋代《太平惠民和劑局方》,溫中健脾,溫腎助陽,多用于脾胃虛寒所致脘腹冷痛,嘔吐泄瀉,手足不溫等癥,是治療脾陽虛泄瀉的經(jīng)典方劑[15]。近年來,附子理中丸常用于IBS-D的臨床治療,且療效確切[16-18],然而其作用機(jī)制尚未完全明確,其對脾陽虛泄瀉疾病腸道菌群的影響也未見報(bào)道。因此,本文采用高通量測序技術(shù),研究附子理中丸對復(fù)合法誘導(dǎo)的脾陽虛IBS-D模型大鼠腸道菌群的影響。

    1 材料

    1.1 藥材與試劑

    附子(批號(hào):1804038)、干姜(批號(hào):1806012)、炒白術(shù)(批號(hào):1803009)、甘草(批號(hào):1807031)、黨參(批號(hào):1806128)、番瀉葉(批號(hào):1711080)均購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司,以上藥材由成都中醫(yī)藥大學(xué)陳江副教授分別鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根炮制加工品,姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖,菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖的炮制加工品,豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖,桔??浦参稂h參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.的干燥根,豆科植物狹葉番瀉CassiaangustifoliaVahl的干燥小葉。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,批號(hào):2018022601)購自成都市科隆化學(xué)品有限公司,HiPure Soil DNA Kit B試劑盒(批號(hào):180920,Axygen Biosciences),SOD生化試劑盒(批號(hào):20181105)和MDA生化試劑盒(批號(hào):20181026)均購自南京建成生物工程研究所。精煉豬油、高脂高糖飼料、普通飼料均由四川達(dá)碩生物科技有限公司提供。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Agilent 2100生物分析儀(美國Agilent公司);Qubit3.0 Fluorometer(加拿大Invitrogen公司);Illumina miseq測序儀(美國Illumina公司)含MiSeq Control軟件;5424R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);QL-866微型漩渦混合儀(美國Thermo公司);HGC-12A氮吹儀(恒奧科技發(fā)展有限公司);Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國Thermo公司);Qubit3.0 Qubit熒光計(jì)(德國Life公司);Tecan酶標(biāo)儀(瑞士F200公司);Covaris M220超聲波破碎儀(美國Covaris公司);7900HT熒光定量PCR測定儀(美國Thermo公司);ARSS4CN十萬分之一分析天平(美國Ohaus公司);Arium mini超純水儀(德國Sartorius公司);DZ-20半自動(dòng)中藥制丸機(jī)(青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司);DL-720D超聲機(jī)(上海之信儀器有限公司)。

    1.3 灌胃液制備

    取附子、干姜、甘草、炒白術(shù)、黨參5種飲片(1∶1∶1∶1.5∶2),按照2015年版《中國藥典》一部附子理中丸制法項(xiàng)下規(guī)定,粉碎成細(xì)粉,過篩,混勻。按比例加煉蜜,趁熱混勻制成小蜜丸[19]。取適量附子理中丸置于研缽中,加入適量0.5%CMC-Na溶液,研磨成糊狀,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,繼續(xù)加入0.5%CMC-Na溶液研磨,如此3~4次,待附子理中丸轉(zhuǎn)移完全后,加0.5%CMC-Na稀釋至刻度,分別制備成合生藥量為0.05、0.15 g/mL的混懸液。

    將番瀉葉浸漬于純凈水中,每100 mL含生藥量100 g,于70 ℃恒溫水浴鍋浸漬過夜,濾過,濾液置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    60只SD大鼠(250±20)g,SPF級(jí),雄性,由四川達(dá)碩生物科技有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(川)2015-030。將60只大鼠隨機(jī)分為空白組,模型組,附子理中丸低、高劑量組,每組15只。于室溫20~25 ℃,相對濕度65%~69%環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,期間自由進(jìn)食進(jìn)水。本文涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究獲得成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):2014DL-024)。

    2 方法

    2.1 造模與給藥

    按照復(fù)合因素法“飲食失節(jié)+勞倦過度+番瀉葉灌胃”建立病證結(jié)合的大鼠脾陽虛IBS-D模型[20-22]:第一階段(第1~6天),單日喂飼甘藍(lán)10 g/只,雙日喂高脂混合飼料10 g/只;每日下午,38 ℃溫水中游泳至疲勞(疲勞的標(biāo)準(zhǔn)為全身下沉至沒頸,不能堅(jiān)持游泳)。第二階段(第7~21天),在第一階段施加因素的基礎(chǔ)上,每日加灌番瀉葉水浸液10 mL/kg。每日稱量并記錄各組大鼠體質(zhì)量。在造模第21天,每組隨機(jī)選擇6只大鼠,眼眶取血,進(jìn)行MDA、SOD指標(biāo)檢測[23-25],同時(shí)結(jié)合腹瀉癥狀、體征與行為改變情況[26],發(fā)現(xiàn)造模大鼠出現(xiàn)大便稀溏,體質(zhì)量明顯下降、喜扎堆、食欲不振、毛稀疏枯槁無光澤、游泳時(shí)間明顯縮短、肛門周圍污濁等現(xiàn)象,則可判定造模已成功。

    造模成功后,模型組,附子理中丸低、高劑量組仍按復(fù)合因素法繼續(xù)造模。空白組、模型組每日于造模后5 h灌胃等量生理鹽水,附子理中丸低、高劑量組每日分別灌胃0.5、1.5 g/kg附子理中丸混懸液,各組連續(xù)灌胃給藥3周。

    2.2 樣品采集與制備

    42 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將大鼠處死,迅速取出直腸中內(nèi)容物至對應(yīng)編號(hào)的無菌凍存管中,置-80 ℃冰箱凍存,待測。

    2.3 DNA提取與PCR擴(kuò)增

    根據(jù)HiPure Soil DNA Kit B試劑盒說明書進(jìn)行總DNA提取,PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3~V4可變區(qū)(擴(kuò)增條件:94 ℃解鏈3 min,94 ℃ 5 s,57 ℃ 90 s,72 ℃ 10 s,24個(gè)循環(huán),72 ℃終延伸5 min),采用引物5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRGAAT-3'和5'-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3'。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果鑒定,根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程構(gòu)建文庫。使用Agilent 2100生物分析儀檢測文庫質(zhì)量,Qubit 3.0 Fluorometer檢測文庫濃度,將文庫定量到10 nmol/L,Illumina MiSeq測序儀進(jìn)行PE250/FE300雙端測序,MiSeq Control Software讀取序列信息。

    2.4 生物信息學(xué)分析

    質(zhì)量過濾,去除嵌合體序列的有效序列用Vsearch(1.9.6)軟件聚類生成操作分類單元(OTU),相似度為97%。參考數(shù)據(jù)庫Silva 132 16S rRNA database(http://www.arb-silva.de/)比對16S rRNA,用RDP classifier對代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析。隨機(jī)抽樣進(jìn)行α多樣性指數(shù)分析,作出稀釋曲線。用R語言軟件進(jìn)行PCoA分析,基于Brary-Curtis距離矩陣,提取數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu),對一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序,選擇排在前幾位的特征值,做主坐標(biāo)圖,可視化展示樣本β多樣性。LEfSe采用LEfSE在線分析工具(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=lefse_uploa)揭示基因組特征,識(shí)別高維生物標(biāo)識(shí),篩選差異物種(LDA>3)。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    3 結(jié)果

    3.1 脾陽虛IBS-D模型的建立

    造模21 d后,在體征與行為表現(xiàn)方面,所有造模大鼠均存在體質(zhì)量明顯下降,食欲不振,喜扎堆,蜷伏懶動(dòng),毛稀疏枯槁無光澤,游泳時(shí)間明顯縮短,大便稀溏,肛門周圍污濁等現(xiàn)象,初步判定造模成功。測定MDA含量和SOD活力,如表1所示,造模大鼠(模型組和附子理中丸給藥組)較空白大鼠MDA含量顯著升高(P<0.05),SOD活性顯著降低(P<0.05),綜合判斷造模已成功。

    表1 造模后各組大鼠MDA含量和SOD活力比較

    3.2 樣本量合理性考察

    如圖1所示,稀釋曲線和物種累積曲線結(jié)果顯示各樣本的有效序列(>40 000)和總的樣本數(shù)量(40)都能使菌群得到有效的檢測和覆蓋。同時(shí),所有樣本的Good's coverage指數(shù)均達(dá)到99.8%以上,全部待測樣本的測序覆蓋率好,能代表糞便菌群中絕大部分細(xì)菌。

    注:A1~A10.空白組10個(gè)樣本;B1~B10.模型組10個(gè)樣本;C1~C10.附子理中丸低劑量組10個(gè)樣本;D1~D10.附子理中丸高劑量組10個(gè)樣本圖1 稀釋曲線圖(a)和物種累積曲線圖(b)

    3.3 菌群的多樣性分析

    采用α和β多樣性分析,描述和評價(jià)菌群的整體結(jié)構(gòu)。對α多樣性指數(shù)進(jìn)行SPSS統(tǒng)計(jì)分析(表2),表征菌群豐度的ACE(P<0.01)、Chao1(P<0.01)和多樣性的Shannon(P<0.01)在空白組與模型組之間具有顯著性差異,表明模型組的菌群豐度和多樣性較空白組顯著下降(P<0.01),模型組菌群整體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。相較于模型組,附子理中丸給藥組的ACE、Chao1、Shannon指標(biāo)有上升趨勢,表明附子理中丸對菌群的豐度和多樣性有一定的調(diào)節(jié)作用。β多樣性分析中Unweighted unifrac距離矩陣熱圖(圖2)顯示空白組與模型組之間的顏色普遍較深,相異系數(shù)較大??瞻捉M與附子理中丸低、高劑量組之間也有較深色塊,但少于空白組與模型組之間,提示脾陽虛IBS-D造成了較大的菌群差異,而附子理中丸的干預(yù)有助于減少這種差異。

    表2 α多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表

    根據(jù)信息的提取和特征值的排列,PCoA主坐標(biāo)分析結(jié)果中第一主坐標(biāo)(PC1)、第二主坐標(biāo)(PC2)和第三主坐標(biāo)(PC3)的貢獻(xiàn)率分別為28.31%、11.62%、9.98%。圖2中樣品點(diǎn)距離的遠(yuǎn)近代表了樣品中功能分類分布的相似性,距離越近,相似度越高。4個(gè)組組內(nèi)聚集性良好,同組樣本內(nèi)部菌群結(jié)構(gòu)的相似性明顯??瞻捉M和模型組之間的菌群結(jié)構(gòu)有明顯的差異;附子理中丸給藥組呈現(xiàn)出明顯的與模型組分離,向正常組靠近的趨勢。

    注:FLZP.附子理中丸;A1~A10.空白組10個(gè)樣本;B1~B10.模型組10個(gè)樣本;C1~C10.附子理中丸低劑量組10個(gè)樣本;D1~D10.附子理中丸高劑量組10個(gè)樣本圖2 距離矩陣熱圖和主坐標(biāo)分析圖

    3.4 菌群的豐度變化

    3.4.1 脾陽虛IBS-D模型大鼠的腸道菌群變化 門水平:與空白組相比,模型組的擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度顯著降低(P<0.05)。綱水平:模型組的擬桿菌綱(Bacteroidia)相對豐度顯著降低(P<0.05)。科水平:模型組的梭菌_1(Clostridiaceae_1)相對豐度顯著升高(P<0.01),Muribaculacea相對豐度顯著降低(P<0.01)。屬水平:模型組的狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、布勞特氏菌屬(Blautia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)的相對豐度均顯著升高(P<0.01),如圖3所示。

    3.4.2 附子理中丸對脾陽虛IBS-D模型大鼠腸道菌群的影響 門水平:與模型組比較,附子理中丸給藥組的擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度顯著增高(P<0.05,P<0.01)。綱水平:附子理中丸給藥組的擬桿菌綱(Bacteroidia)相對豐度顯著升高(P<0.05,P<0.01)。科水平:附子理中丸給藥組的梭菌_1(Clostridiaceae_1)相對豐度顯著降低(P<0.01),Muribaculacea相對豐度顯著升高(P<0.05)。屬水平:附子理中丸給藥組的狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、布勞特氏菌屬(Blautia)的相對豐度均顯著降低(P<0.01)。附子理中丸給藥組的乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度均出現(xiàn)升高,其中附子理中丸高劑量組出現(xiàn)顯著升高(P<0.05),如圖3所示。

    注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;FLZP.附子理中丸。

    3.4.3 差異菌群篩選 LEfSe分析結(jié)果顯示,附子理中丸可以回調(diào)脾陽虛IBS-D紊亂的腸道菌群。擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、Muribaculaceae、梭菌科(Clostridiaceae)、狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、布勞特氏菌屬(Blautia)共7個(gè)腸道菌群類群在附子理中丸低、高劑量組均出現(xiàn)相同回調(diào)趨勢,如表3和圖4所示。附子理中丸高劑量組進(jìn)一步提高了乳桿菌屬(Lactobacillus)的相對豐度,如圖4所示。

    表3 標(biāo)識(shí)性菌群分析結(jié)果表(n=10)

    注:a.進(jìn)化分支圖;b.LDA值分布柱狀圖。n=10。

    4 討論

    相比于正常的機(jī)體,擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、Muribaculaceae、梭菌科(Clostridiaceae)、狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、布勞特氏菌屬(Blautia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)在脾陽虛機(jī)體中都出現(xiàn)了顯著性的變化,這些都可能是脾陽虛機(jī)體的特征菌群。

    腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是臨床最常見的功能性胃腸病之一,全球的發(fā)病率約為10%~20%[27]。IBS-D是IBS最主要表型之一,目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為IBS-D是多種因素共同作用的結(jié)果。其傳統(tǒng)的治療藥物(如抗生素、胃腸動(dòng)力調(diào)節(jié)劑、止瀉劑等)常針對某一特定機(jī)制進(jìn)行,無法標(biāo)本兼治,且存在副作用,若用藥失度易衍生新的醫(yī)源性疾病。近年來,中醫(yī)藥治療IBS-D取得了良好的效果[28-30]。作為治療脾陽虛泄瀉的經(jīng)典方劑,附子理中丸全方由理中丸加補(bǔ)火助陽之附子而成,附子、干姜共用以溫運(yùn)中陽,驅(qū)散中寒。合白術(shù)以健脾燥濕,加黨參以益氣健脾,并行炙甘草以調(diào)和諸藥,解其毒性兼補(bǔ)脾和中。故五藥合用以奏溫中焦,補(bǔ)下焦,脾腎并治,補(bǔ)腎火而溫脾陽之效。在臨床上附子理中丸被發(fā)現(xiàn)可以有效地提高IBS-D的治愈率[16-18]。越來越多的研究也發(fā)現(xiàn),腸道菌群失調(diào)與IBS-D存在明顯相關(guān)性,其機(jī)制可能是腸道菌群紊亂引起腸黏膜的過度免疫反應(yīng)和持續(xù)的腸道慢性炎癥,最終誘發(fā)IBS-D的發(fā)生[31]。故本研究建立大鼠脾陽虛IBS-D模型,重點(diǎn)選擇與炎癥/免疫反應(yīng)密切相關(guān)的4個(gè)菌群,研究附子理中丸治療脾陽虛IBS-D的機(jī)制。值得注意的是,脾陽虛證多由脾氣虛日久累及脾陽而致,或由腎陽不足,命門火衰所致,故脾陽虛模型造模時(shí)間較長,在長期游泳致力竭以及寒涼藥物瀉下處理過程中,部分大鼠可能死亡,因此造模過程需要預(yù)留足夠的樣本量,以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利開展。本實(shí)驗(yàn)以每組15只大鼠進(jìn)行造模,在造模成功后每組選取10只進(jìn)行后續(xù)給藥及指標(biāo)檢測。

    勞特氏菌屬(Blautia)相對豐度與IL-6水平呈正相關(guān)性(P<0.05)[32]。如圖5所示,布勞特氏菌屬的變化可引起IL-6的變化,進(jìn)而激活JAK-STAT信號(hào)通路,促進(jìn)更多的免疫因子分泌,誘導(dǎo)機(jī)體的炎癥及自身免疫反應(yīng)。給予附子理中丸后,布勞特氏菌屬相對豐度降低,可促使機(jī)體炎癥反應(yīng)得到改善。蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)的相對豐度則與促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫激活的恒定自然殺傷T細(xì)胞之間存在著潛在的正相關(guān)[33-34]。給予附子理中丸后,蘇黎世桿菌相對豐度的顯著降低,也表明機(jī)體炎癥得到改善。擬桿菌門(Bacteroidetes)作為人體及高等哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)最為優(yōu)勢的革蘭氏陰性菌之一,其死亡裂解脫落的脂多糖(LPS)與LPS結(jié)合蛋白(LBP,可作為內(nèi)毒素血癥的標(biāo)記物)以及細(xì)胞表面的CD14分子結(jié)合后,可激活NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)多種促炎因子的表達(dá),導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥,產(chǎn)生系統(tǒng)炎癥[35-37]。在本研究中,LEfSe分析結(jié)果顯示,在IBS-D模型組中擬桿菌門的相對豐度顯著降低,給予附子理中丸后擬桿菌門的相對豐度顯著升高。研究結(jié)果表明,附子理中丸可以通過回調(diào)相關(guān)菌群改善其異常紊亂狀態(tài),進(jìn)而緩解脾陽虛IBS-D長期存在的過度免疫反應(yīng)和持續(xù)的腸道慢性炎癥。

    乳桿菌屬(Lactobacillus)作為機(jī)體重要的益生菌群,除了幫助機(jī)體轉(zhuǎn)化營養(yǎng)物質(zhì)外,更重要的是積極參與了機(jī)體的免疫系統(tǒng)[38]。一方面,乳桿菌可以通過和機(jī)體的信號(hào)交流調(diào)控免疫系統(tǒng),增強(qiáng)機(jī)體抵抗疾病不良影響的能力,如來源于乳桿菌的P40蛋白在研究中被發(fā)現(xiàn)可以通過激活EGFR/NF-κB刺激腸道上皮細(xì)胞分泌APRIL,從而促進(jìn)腸道抗感染抗體IgA的生成(圖5)[39-41];另一方面,乳桿菌可以通過自身的增殖占位,形成生物屏障,拮抗病原微生物的定植,抑制腸道菌群的紊亂,同時(shí)使緊密連接相關(guān)蛋白重新分布,正?;c道上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu),并且抑制上皮細(xì)胞凋亡,最終協(xié)助恢復(fù)腸壁屏障的功能[38,40-41]。本文的研究結(jié)果顯示,相對于空白組,脾陽虛IBS-D組乳桿菌屬的相對豐度顯著增加,一方面推測可能是因?yàn)槿闂U菌作為與宿主協(xié)同互助的益生菌,當(dāng)機(jī)體免疫力低下,可能發(fā)生疾病時(shí),腸道上皮細(xì)胞和腸道淋巴組織與腸道菌群之間可能通過某種通路,進(jìn)行信息傳遞與交換[41],乳桿菌數(shù)量通過機(jī)體的自我保護(hù)代償性機(jī)制而受到調(diào)節(jié)并增多,進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)正常;另一方面,可能是因?yàn)槟P徒M大鼠脾的運(yùn)化功能受損,腸道菌群可利用的營養(yǎng)物質(zhì)減少,乳桿菌屬這一優(yōu)勢菌種能通過其優(yōu)勢生長,競爭性爭奪潛在致病菌的營養(yǎng),抑制腸道菌群的紊亂。給予附子理中丸后乳桿菌屬的相對豐度進(jìn)一步增長,推測可能是由于附子理中丸促進(jìn)了脾的功能恢復(fù),進(jìn)而協(xié)助了機(jī)體內(nèi)共生菌的增長,而共生菌的繁殖,進(jìn)一步可持續(xù)參與腸道黏膜修復(fù)、免疫應(yīng)答等一系列生理調(diào)節(jié)過程。

    本研究結(jié)果表明,影響和調(diào)控腸道菌群是附子理中丸治療IBS-D的重要機(jī)制之一,其通過增加乳桿菌和擬桿菌相對豐度,降低蘇黎世桿菌和布勞特氏菌相對豐度,來改善機(jī)體的腸道微生態(tài)失衡狀態(tài),從而產(chǎn)生降低機(jī)體的低度炎癥和減少免疫的過度激活等作用,進(jìn)而發(fā)揮治療IBS-D的作用。同時(shí),從腸道菌群角度出發(fā),目前也將益生菌療法作為治療IBS-D的有效方法[42-44]。有臨床研究發(fā)現(xiàn)益生菌聯(lián)合附子理中丸可進(jìn)一步提高IBS-D治愈率[18],一定程度上與附子理中丸可以有效地提高乳桿菌屬的相對豐度有關(guān)。本論文為附子理中丸的深入研究與臨床應(yīng)用提供了新的參考。

    注:a.機(jī)制圖;b.信號(hào)通路圖

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