噴施外源茉莉酸類(lèi)化合物對(duì)紅松防御酶及蛋白酶抑制劑的影響1)

王琪 楊浩倫 烏恩泰 嚴(yán)善春

(黑龍江省森林保護(hù)研究所，哈爾濱，150040)(林木遺傳育種與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

冷杉梢斑螟(Dioryctriaabietella)和赤松梢斑螟(D.sylvestrella)是紅松(Pinuskoraiensis)球果和枝梢的重要害蟲(chóng)，大發(fā)生年份球果被害率達(dá)80%以上，受其危害后紅松種子的質(zhì)量和產(chǎn)量大幅下跌；樹(shù)干分叉，木材材質(zhì)和出材率明顯下降，嚴(yán)重影響林區(qū)的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)建設(shè)[1]。2種梢斑螟成蟲(chóng)羽化期較長(zhǎng)，由每年6月持續(xù)至8月[2]，且幼蟲(chóng)生活于球果或枝條蟲(chóng)包內(nèi)，傳統(tǒng)藥劑防治效果欠佳。植物的誘導(dǎo)抗性可以增強(qiáng)植物自身的抗蟲(chóng)能力，從而抵御害蟲(chóng)對(duì)寄主植物的危害，適用于防御營(yíng)隱蔽性生活的害蟲(chóng)[3]。

茉莉酸甲酯(MJA)和茉莉酮(ZJ)是茉莉酸防御反應(yīng)途徑中重要的中間產(chǎn)物，在植物防御、生長(zhǎng)及代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。茉莉酸甲酯或茉莉酮可作為外源誘導(dǎo)劑[4-6]，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性反應(yīng)。研究認(rèn)為2種物質(zhì)誘導(dǎo)反應(yīng)途徑不同，誘導(dǎo)的防御策略也不同[5-8]。茶樹(shù)(Camelliasinensis)[9]、云杉(Piceaabies)[10]、落葉松(Larixgmelinii)和楊樹(shù)(Populusspp.)[11]等許多植物在經(jīng)茉莉酸甲酯處理后，均可誘導(dǎo)其產(chǎn)生系統(tǒng)性的誘導(dǎo)抗性，可通過(guò)直接或間接的防御反應(yīng)抵御害蟲(chóng)[12]。茉莉酮誘導(dǎo)的防御研究相對(duì)較少，早期的研究認(rèn)為與茉莉酸途徑的其他茉莉酸異構(gòu)體相比，茉莉酮更主要是通過(guò)刺激植物特異性揮發(fā)物引誘天敵來(lái)控制害蟲(chóng)，既采用間接防御策略減少害蟲(chóng)危害[13]。隨著研究深入人們發(fā)現(xiàn)，用茉莉酮處理也能夠誘導(dǎo)小麥(Triticumaestirum)自身多種防御物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加[14]。課題組先前的研究結(jié)果同樣顯示利用外源茉莉酸甲酯、茉莉酮均可誘導(dǎo)紅松酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，且茉莉酮誘導(dǎo)的酚酸種類(lèi)更多[15]。但具體的機(jī)制尚不十分明確。過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物誘導(dǎo)防御反應(yīng)過(guò)程的關(guān)鍵酶[3，12-16]；蛋白酶抑制劑(PPI)可與害蟲(chóng)消化道蛋白酶相互作用，使昆蟲(chóng)產(chǎn)生厭食反應(yīng)[12]。本研究利用茉莉酸甲酯、茉莉酮的系統(tǒng)及局部噴施，研究誘導(dǎo)處理后紅松主梢和球果防御酶及蛋白酶抑制劑的活性變化，討論應(yīng)用不同種類(lèi)茉莉酸類(lèi)化合物誘導(dǎo)的紅松防御反應(yīng)的差異，從而為探索利用植物化學(xué)防御控制紅松梢斑螟危害奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2016年4月末，在牡丹江林口林業(yè)局刁翎紅松人工林內(nèi)，選擇40年生紅松為試驗(yàn)植株。

1.2 樣品采集及相關(guān)酶活性測(cè)定

將健康紅松樣樹(shù)隨機(jī)分成16組，用不同濃度的茉莉酸類(lèi)化合物進(jìn)行原位噴霧誘導(dǎo)和系統(tǒng)噴霧誘導(dǎo)處理。原位誘導(dǎo)即噴施部位與樣品采集部位相同，系統(tǒng)誘導(dǎo)即噴霧部位與樣品采集部位不同，具體處理方式見(jiàn)表1。每處理組120棵樣樹(shù)，分別在5個(gè)時(shí)間段，即處理后的1、30、60、90、120 d摘取紅松球果(2年生)及主梢，每次取樣24株。赤松梢斑螟的第1次轉(zhuǎn)移期，是初孵幼蟲(chóng)由主梢轉(zhuǎn)移到球果，此轉(zhuǎn)移期相應(yīng)于本研究的1～30 d；其第2個(gè)轉(zhuǎn)移期，是5齡老熟幼蟲(chóng)由球果轉(zhuǎn)移回主梢取食越冬，此轉(zhuǎn)移期相應(yīng)于本研究的90～120 d。采集未噴施任何化合物的健康球果和主梢，作為健康對(duì)照；采集梢斑螟危害的紅松球果和主梢，作為蟲(chóng)害對(duì)照。

將采集到的球果及主梢裝入夾鏈袋中，迅速放入冰盒內(nèi)帶回室內(nèi)，于-20 ℃保存、備測(cè)。CAT、SOD、POD、PPO和PAL，蛋白酶抑制劑的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 11.5軟件計(jì)算防御酶、蛋白酶抑制劑活性的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD，α=0.05)比較不同處理、不同時(shí)間段防御酶、蛋白酶抑制劑活性的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康、蟲(chóng)害及不同茉莉酸類(lèi)化合物處理的紅松球果和主梢防御酶活性

健康、蟲(chóng)害及不同濃度茉莉酸類(lèi)化合物原位噴霧或系統(tǒng)噴霧處理，誘導(dǎo)紅松球果內(nèi)各防御酶隨時(shí)間的變化趨勢(shì)見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，10 mmol·L-1茉莉酮原位及系統(tǒng)噴施茉莉酮誘導(dǎo)的球果SOD活性，只在處理60 d時(shí)略低于蟲(chóng)害取食誘導(dǎo)，其他處理時(shí)間段高于(處理90 d)或與蟲(chóng)害取食無(wú)顯著差異。健康球果CAT活性隨其生長(zhǎng)不斷增加，但蟲(chóng)害誘導(dǎo)的CAT活性在檢測(cè)的1～120 d均顯著高于健康球果，以不同濃度茉莉酸類(lèi)化合物誘導(dǎo)球果CAT，發(fā)現(xiàn)尤以10 mmol·L-1茉莉酮原位及系統(tǒng)噴施球果誘導(dǎo)的CAT活性與蟲(chóng)害誘導(dǎo)最為接近。不同濃度茉莉酸類(lèi)化合物處理誘導(dǎo)的球果POD活性在處理1 d時(shí)顯著增加，與茉莉酸甲酯相比，茉莉酮誘導(dǎo)的POD更接近蟲(chóng)害取食誘導(dǎo)。不同濃度茉莉酸類(lèi)化合物處理誘導(dǎo)的球果PPO活性在處理1 d后顯著增加，10 mmol·L-1茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的PPO活性與蟲(chóng)害誘導(dǎo)無(wú)顯著差異，100 mmol·L-1茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的PPO活性顯著高于蟲(chóng)害誘導(dǎo)，10 mmol·L-1茉莉酮原位噴施及100 mmol·L-1茉莉酮原位、系統(tǒng)噴施，誘導(dǎo)的PPO活性均顯著高于100 mmol·L-1茉莉酸甲酯誘導(dǎo)。方差分析結(jié)果表明，在檢測(cè)的30～120 d，10 mmol·L-1茉莉酮原位及系統(tǒng)噴施誘導(dǎo)的球果PPO活性與蟲(chóng)害誘導(dǎo)無(wú)顯著差異。分析不同茉莉酸類(lèi)化合物誘導(dǎo)的球果PAL活性，發(fā)現(xiàn)10 mmol·L-1茉莉酮原位誘導(dǎo)的PAL，在處理的1～120 d與蟲(chóng)害誘導(dǎo)無(wú)顯著差異。

表2 健康、蟲(chóng)害及不同濃度茉莉酸類(lèi)化合物處理的紅松球果防御酶活性

處理時(shí)間/dCAT活性/U·g-1·min-1ckCDCBC-MJA10CC-MJA10BC-MJA100CC-MJA100BC-ZJA10CC-ZJA10BC-ZJA100CC-ZJA100 1(0.221±0.045)fD(0.270±0.025)dD(0.450±0.039)aC(0.249±0.034)eC(0.391±0.028)bD(0.339±0.028)cD(0.278±0.044)dE(0.277±0.025)dD(0.440±0.012)aD(0.250±0.053)eD30(0.119±0.046)fD(0.530±0.041)bC(0.250±0.054)eD(0.119±0.0615)fD(0.530±0.064)bC(0.463±0.035)cC(0.412±0.039)dD(0.535±0.026)bC(0.615±0.038)aC(0.641±0.031)aC60(0.499±0.044)eC(0.713±0.036)bB(0.480±0.030)eC(0.388±0.031)fB(0.563±0.038)dC(0.481±0.034)eC(0.705±0.0275)bC(0.759±0.0314)aB(0.635±0.031)cC(0.656±0.030)cC90(0.733±0.036)efB(1.016±0.038)bcA(0.756±0.037)eB(0.728±0.022)fA(0.763±0.027)eB(0.826±0.040)dB(1.040±0.055)bB(1.210±0.073)aA(0.908±0.102)cB(0.904±0.026)cB120(0.957±0.014)eA(1.209±0.023)dA(0.978±0.012)eA(0.801±0.041)fA(1.309±0.023)bcA(1.382±0.012)aA(1.336±0.002)abA(1.275±0.012)cA(1.314±0.101)bA(1.314±0.099)bA

處理時(shí)間/dPOD活性/U·g-1·min-1ckCDCBC-MJA10CC-MJA10BC-MJA100CC-MJA100BC-ZJA10CC-ZJA10BC-ZJA100CC-ZJA100 1(0.044±0.010)cB(0.061±0.001)aA(0.055±0.006)bA(0.064±0.001)cA(0.062±0.002)aA(0.067±0.005)aA(0.063±0.010)aA(0.069±0.005)aA(0.069±0.006)aA(0.056±0.003)aA30(0.045±0.002)aB(0.046±0.001)aB(0.048±0.001)aB(0.041±0.001)aC(0.045±0.001)aB(0.035±0.005)bC(0.038±0.004)bC(0.035±0.006)bC(0.044±0.005)aC(0.041±0.002)aB60(0.045±0.002)aB(0.045±0.006)aB(0.045±0.015)aB(0.049±0.002)aC(0.047±0.006)aB(0.040±0.003)aC(0.048±0.002)aB(0.040±0.006)aBC(0.049±0.014)aBC(0.041±0.002)aB90(0.057±0.002)aA(0.053±0.014)aAB(0.059±0.018)aA(0.045±0.001)aC(0.059±0.001)aA(0.055±0.005)aB(0.054±0.002)aB(0.054±0.014)aB(0.053±0.01)aB(0.055±0.006)aA120(0.059±0.001)aA(0.058±0.002)aA(0.053±0.001)aAB(0.050±0.002)aB(0.051±0.001)aAB(0.057±0.001)aB(0.066±0.001)aAB(0.047±0.001)aB(0.058±0.001)aB(0.053±0.001)aA

處理時(shí)間/dPPO活性/U·g-1·min-1ckCDCBC-MJA10CC-MJA10BC-MJA100CC-MJA100BC-ZJA10CC-ZJA10BC-ZJA100CC-ZJA100 1(0.051±0.003)fB(0.060±0.002)eB(0.058±0.002)eA(0.060±0.002)eB(0.097±0.009)cA(0.102±0.005)cA(0.065±0.006)dB(0.137±0.003)aA(0.112±0.007)bA(0.115±0.005)bA30(0.067±0.002)dA(0.078±0.010)bA(0.053±0.002)fA(0.066±0.002)dB(0.057±0.001)eC(0.082±0.002)aB(0.070±0.005)cA(0.079±0.008)dB(0.056±0.007)eBC(0.069±0.006)cdC60(0.053±0.001)eB(0.066±0.001)cB(0.033±0.003)fB(0.064±0.002)cdB(0.059±0.005)dC(0.070±0.010)aC(0.068±0.008)bB(0.070±0.006)eB(0.066±0.001)cB(0.056±0.001)dD90(0.033±0.001)fC(0.064±0.001)cB(0.059±0.002)dA(0.070±0.005)abA(0.068±0.002)bB(0.050±0.002)eD(0.062±0.005)eB(0.065±0.008)bcC(0.052±0.001)deC(0.072±0.008)aB120(0.039±0.001)eC(0.059±0.002)aB(0.041±0.002)eB(0.032±0.003)eC(0.026±0.008)fD(0.065±0.003)bC(0.072±0.008)aA(0.059±0.001)cC(0.050±0.008)dC(0.052±0.001)dD

處理時(shí)間/dPAL活性/U·g-1·min-1ckCDCBC-MJA10CC-MJA10BC-MJA100CC-MJA100BC-ZJA10CC-ZJA10BC-ZJA100CC-ZJA100 1(136.84±2.03)eC (153.19±10.03)bC(130.76±8.34)fC(137.08±9.34)eC(142.69±2.34)dD(135.70±8.23)eD(148.38±7.34)cC(142.19±8.90)dC(153.19±9.34)bB(165.00±2.34)aC30(142.31±3.23)fBC(158.94±3.45)abC(148.38±3.45)eC(142.19±2.45)fC(153.19±1.34)dC(157.44±3.45)dC(148.93±2.56)eC(175.53±1.23)bB(161.54±3.45)cB(179.24±3.45)aC60(152.31±3.76)fB(178.94±9.34)abB(161.55±2.34)eB(182.67±4.34)cA(186.82±1.15)bB(210.75±3.45)aA(153.18±3.46)fC(172.10±2.34)dB(152.31±3.45)fB(208.94±7.45)abB90(186.82±2.34)deA(230.75±3.46)bA(181.62±4.36)eA(177.82±3.27)fA(199.90±5.90)dA(182.75±4.76)eB(223.47±3.25)cdA(233.63±3.20)abA(235.15±1.23)aA(225.00±3.21)cA120(159.67±2.23)fB(200.00±3.24)cA(161.50±1.09)aB(164.94±2.07)bB(158.22±2.14)bC(187.33±2.34)efB(179.08±1.34)eB(214.55±7.23)fA(205.42±3.78)cdA(206.85±7.09)dB

表3蟲(chóng)害誘導(dǎo)主梢POD活性在取食的30 d時(shí)略低于健康主梢，但差異不顯著，而此時(shí)恰好為赤松梢斑螟在球果內(nèi)危害的時(shí)期，其他時(shí)間段均顯著高于健康主梢。不同濃度茉莉酸類(lèi)化合物原位及系統(tǒng)噴施誘導(dǎo)的主梢POD活性在處理1 d時(shí)，10 mmol·L-1原位噴施茉莉酮誘導(dǎo)的酶活性最高，10 mmol·L-1與蟲(chóng)害無(wú)顯著差異，并在之后的4個(gè)時(shí)間段2種處理均與蟲(chóng)害無(wú)顯著差異。蟲(chóng)害誘導(dǎo)主梢PPO活性在處理的1～30 d與健康主梢無(wú)顯著差異，其他時(shí)間段均顯著高于健康主梢。10 mmol·L-1茉莉酸甲酯系統(tǒng)噴施及不同濃度茉莉酮系統(tǒng)和原位噴施誘導(dǎo)的PPO在處理后的1～120 d均顯著高于或與蟲(chóng)害取食無(wú)差異。蟲(chóng)害誘導(dǎo)的主梢SOD只有在取食后的30 d與健康主梢無(wú)顯著差異，其他時(shí)間段均顯著高于健康主梢。測(cè)定噴施不同茉莉酸化合物誘導(dǎo)的主梢SOD活性，發(fā)現(xiàn)1 d時(shí)，茉莉酮誘導(dǎo)的酶活性顯著高于茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，并在處理的30和60 d一直保持較高水平，雖然在處理的90～120 d酶的活性有所下降，但10 mmol·L-1茉莉酮原位和系統(tǒng)噴施及100 mmol·L-1系統(tǒng)噴施誘導(dǎo)的酶活性仍高于蟲(chóng)害取食。蟲(chóng)害誘導(dǎo)的PAL活性在取食的1～120 d均顯著高于健康主梢。不同濃度茉莉酸化合物誘導(dǎo)的PAL活性在處理后1 d顯著低于蟲(chóng)害，但從處理的30 d開(kāi)始，不同濃度茉莉酮處理誘導(dǎo)主梢PAL活性均高于或與蟲(chóng)害無(wú)顯著差異。

表3 健康、蟲(chóng)害及不同濃度茉莉酸類(lèi)化合物處理的紅松主梢防御酶活性

處理時(shí)間/dCAT活性/U·g-1·min-1ckTDTBT-MJA10TT-MJA10BT-MJA100TT-MJA100BT-ZJA10TT-ZJA10BT-ZJA100TT-ZJA100 1(0.381±0.045)cB(0.374±0.036)dD(0.263±0.032)fC(0.332±0.035)eD(0.471±0.071)bC(0.462±0.045)bC(0.384±0.027)cC(0.385±0.045)cB(0.552±0.024)aB(0.345±0.067)eC30(0.374±0.065)fB(0.421±0.072)eC(0.463±0.023)cB(0.434±0.025)deCD(0.475±0.026)bC(0.461±0.025)cC(0.382±0.035)fC(0.381±0.036)fB(0.552±0.026)aB(0.443±0.027)dC60(0.278±0.024)fC(0.471±0.024)eC(0.887±0.062)aA(0.685±0.027)cdB(0.646±0.017)dB(0.855±0.027)bA(0.635±0.026)dB(0.725±0.026)cA(0.651±0.037)dB(0.725±0.037)cB90(0.398±0.027)fB(0.547±0.016)dB(0.794±0.017)aA(0.514±0.017)dC(0.683±0.038)cB(0.715±0.028)bB(0.423±0.019)eC(0.674±0.018)cA(0.554±0.037)dB(0.682±0.018)cB120(0.457±0.018)fA(0.621±0.018)eA(0.872±0.019)cA(0.912±0.045)bA(0.712±0.028)dA(0.772±0.019)dB(0.854±0.027)cA(0.765±0.028)dA(1.034±0.036)aA(0.913±0.067)bA

處理時(shí)間/dPOD活性/U·g-1·min-1ckTDTBT-MJA10TT-MJA10BT-MJA100TT-MJA100BT-ZJA10TT-ZJA10BT-ZJA100TT-ZJA100 1(0.051±0.010)cC(0.064±0.005)bAB(0.056±0.006)cB(0.055±0.004)cB(0.064±0.006)bA(0.056±0.005)cB(0.062±0.010)bB(0.075±0.005)aA(0.068±0.006)bB(0.064±0.010)bB30(0.066±0.004)eB(0.054±0.006)fB(0.067±0.005)bB(0.069±0.004)aA(0.064±0.006)cdA(0.056±0.005)eB(0.062±0.004)dB(0.054±0.006)fB(0.065±0.005)cB(0.062±0.004)dB60(0.060±0.002)aBC(0.070±0.006)aA(0.068±0.014)aB(0.066±0.004)aA(0.068±0.006)aA(0.066±0.005)aB(0.065±0.002)aB(0.066±0.006)aAB(0.063±0.014)aB(0.062±0.002)aB90(0.068±0.006)aB(0.061±0.014)aAB(0.061±0.010)aB(0.063±0.004)aAB(0.064±0.006)aA(0.068±0.005)aB(0.061±0.006)aB(0.065±0.014)aAB(0.064±0.010)aB(0.064±0.006)aB120(0.081±0.004)aA(0.074±0.006)aA(0.076±0.005)aA(0.075±0.004)aA(0.074±0.006)bA(0.086±0.005)aA(0.072±0.004)aA(0.075±0.006)aA(0.078±0.005)aA(0.084±0.004)aA

處理時(shí)間/dPPO活性/U·g-1·min-1ckTDTBT-MJA10TT-MJA10BT-MJA100TT-MJA100BT-ZJA10TT-ZJA10BT-ZJA100TT-ZJA100 1(0.058±0.001)fA(0.060±0.007)eA(0.076±0.001)aA (0.074±0.011)abA(0.061±0.002)eA(0.073±0.006)bAB(0.063±0.002)dBC(0.076±0.002)aAB(0.069±0.006)cB(0.072±0.003)bA30(0.059±0.004)fA(0.060±0.003)fA(0.067±0.002)dAB(0.055±0.003)fB(0.064±0.002)eA(0.064±0.004)eB(0.076±0.003)bAB(0.082±0.001)aA(0.087±0.003)aA(0.073±0.004)cA60(0.053±0.002)eA(0.061±0.003)cA(0.065±0.015)bAB(0.056±0.002)dB(0.064±0.010)cA(0.047±0.001)fC(0.068±0.002)deB(0.055±0.003)aB(0.065±0.003)bcB(0.065±0.007)bA90(0.033±0.002)fB(0.045±0.009)eB(0.059±0.007)cB(0.070±0.003)aA(0.068±0.003)abA(0.050±0.003)dCB(0.052±0.003)dC(0.065±0.003)bB(0.052±0.003)dB(0.072±0.011)aA120(0.039±0.003)fB(0.061±0.007)dA(0.072±0.007)cAB(0.046±0.006)eB(0.067±0.003)cA(0.085±0.005)aA(0.085±0.002)aA(0.082±0.002)abA(0.078±0.006)bAB(0.063±0.002)dA

處理時(shí)間/dPAL活性/U·g-1·min-1ckTDTBT-MJA10TT-MJA10BT-MJA100TT-MJA100BT-ZJA10TT-ZJA10BT-ZJA100TT-ZJA100 1(116.57±7.38)cC(150.43±9.28)aB(101.77±3.57)eC(102.28±9.28)eC(98.87±10.87)fC(98.96±2.89)fC(106.82±3.92)dC(127.16±3.89)bB(106.81±7.28)dB(105.31±10.39)dD30(133.19±10.89)fB(172.11±10.98)dA(136.99±9.20)efB(140.84±15.28)eB(191.50±9.29)bA(177.87±4.39)dB(179.88±5.17)dB(192.51±8.27)bA(203.35±7.38)aA(183.67±3.21)cC60(153.19±8.38)fA(172.11±8.39)eA(151.77±4.29)fAB(175.65±9.28)eA(190.74±4.27)dA(193.58±4.19)dA(207.77±3.21)cA(196.97±8.26)dA(212.66±4.21)bA(225.31±8.31)aA90(161.55±5.46)eA(182.67±11.42)cA(166.92±10.81)dA(178.34±3.41)cA(152.68±12.35)fB(195.65±13.41)bA(190.74±9.34)bAB(193.58±7.25)bA(207.77±6.31)aA(196.97±14.32)bBC120(159.67±13.43)fA(180.66±15.54)dA(165.61±7.36)eA(180.77±5.37)dA(192.45±4.21)cA(198.40±8.36)bA(200.74±9.26)bA(191.70±8.45)cB(194.30±6.28)bcA(204.42±9.21)aB

2.2 健康、蟲(chóng)害及不同茉莉酸類(lèi)化合物處理的紅松球果和主梢蛋白酶抑制劑活性

表4蟲(chóng)害取食誘導(dǎo)的球果胰蛋白酶抑制劑活性在取食的1～120 d顯著高于健康球果，不同濃度茉莉酮原位及系統(tǒng)噴施誘導(dǎo)的胰蛋白酶抑制劑活性顯著高于(1～60 d)或與蟲(chóng)害無(wú)顯著差異(90、120 d)。蟲(chóng)害取食誘導(dǎo)球果胰凝乳蛋白酶抑制劑活性只有在取食后60 d顯著低于健康球果，其他時(shí)間二者無(wú)顯著差異。不同濃度茉莉酸化合物誘導(dǎo)的胰凝乳蛋白酶抑制劑，除系統(tǒng)噴施茉莉酸甲酯30 d時(shí)誘導(dǎo)的抑制劑顯著低于蟲(chóng)害外，在處理的1～120 d的其他處理均高于或與蟲(chóng)害無(wú)顯著差異。

表4 健康、蟲(chóng)害及不同濃度茉莉酸類(lèi)化合物處理的紅松球果蛋白酶抑制劑活性

處理時(shí)間/d胰凝乳蛋白酶抑制劑活性/U·g-1·min-1ckCDCBC-MJA10CC-MJA10BC-MJA100CC-MJA100BC-ZJA10CC-ZJA10BC-ZJA100CC-ZJA100 1(12.12±0.82)fC(13.32±0.93)eB(13.48±0.74)eB(22.64±0.94)bA(14.19±0.23)dB(18.38±0.42)cA(13.15±0.980eC(12.75±0.34)fC(18.19±0.350cAB(27.29±0.78)aA30(19.54±0.87)dA(20.31±0.93)cA(19.75±0.82)dA(18.75±0.84)eAB(18.50±0.54)eA(11.75±0.43)fB(22.05±0.78)bA(24.29±0.35)aA(20.21±0.98)cA(24.23±0.45)aAB60(15.17±0.92)cdB(12.65±0.39)eB(15.75±0.34)cB(11.25±0.95)efD(15.28±0.75)dB(10.15±0.83)fB(16.15±0.89)bB(20.63±0.45)aA(20.23±0.47)abA(20.17±0.87)aBC90(12.84±0.75)fC(13.03±0.94)fB(18.75±0.78)cA(13.25±0.49)fDC(19.23±0.34)bA(19.25±0.35)bA(15.25±0.98)eBC(16.13±0.45)dB(20.15±0.78)aA(16.75±0.43)dC120(12.54±0.33)dC(12.31±0.83)dB(10.75±0.45)fC(15.75±0.78)bB(15.15±0.99)bB(11.75±0.34)eB(12.05±0.86)deC(24.16±0.78)aA(16.25±0.38)bB(14.17±0.92)cC

表5蟲(chóng)害誘導(dǎo)的主梢胰蛋白酶抑制劑活性只有在處理后120 d低于健康主梢，其他時(shí)間段均顯著高于健康主梢。不同濃度茉莉酸類(lèi)化合物誘導(dǎo)的胰蛋白酶抑制劑活性在處理后1和30 d均顯著高于蟲(chóng)害取食。處理后60 d，只有系統(tǒng)噴施10 mmol·L-1茉莉酮顯著低于蟲(chóng)害取食，處理后90 d，10 mmol·L-1茉莉酸甲酯原位噴施處理顯著低于蟲(chóng)害取食。在120 d，各處理均顯著低于或與健康主梢無(wú)顯著差異。蟲(chóng)害取食誘導(dǎo)的胰凝乳蛋白酶抑制劑在取食的1～120 d均顯著高于健康主梢。不同濃度茉莉酸化合物處理主梢后，主梢胰凝乳蛋白酶抑制劑活性顯著增高，除處理后30 d原位噴施茉莉酸甲酯顯著高于同一濃度同種化合物系統(tǒng)噴施外，其他時(shí)間段的系統(tǒng)噴施誘導(dǎo)的抑制劑活性均較高。

表5 健康、蟲(chóng)害及不同濃度茉莉酸類(lèi)化合物處理的紅松主梢蛋白酶抑制劑活性

處理時(shí)間/d胰凝乳蛋白酶抑制劑活性/U·g-1·min-1ckTDTBT-MJA10TT-MJA10BT-MJA100TT-MJA100BT-ZJA10TT-ZJA10BT-ZJA100TT-ZJA100 1(12.34±0.38)eB(15.67±0.33)cB(18.75±0.29)abC(13.48±0.41)dC(12.63±0.83)deC(11.92±0.94)fC(19.25±0.62)aC(15.93±0.76)cC(16.33±0.38)bB(11.75±0.78)fC30(15.34±0.72)fA(18.75±0.45)cA(18.93±0.65)dC(27.92±0.88)aA(18.95±0.67)dB(26.65±0.44)aA(20.31±0.83)bC(19.43±0.62)bB(18.26±0.82)cB(16.47±0.78)eA60(13.15±0.97)eAB(19.53±0.35)dA(22.67±0.54)cB(25.96±0.46)aB(25.32±0.43)aA(12.31±0.23)fC(23.25±0.75)bC(22.46±0.78)cB(23.73±0.71)bA(12.31±0.65)fC90(12.84±0.82)fB(15.75±0.46)dB(28.24±0.46)aA(15.27±0.78)dC(25.96±0.56)bA(14.42±0.74)eC(25.11±0.93)bcB(25.34±0.66)cA(25.05±0.78)cA(14.06±0.65)eAB120(13.03±0.98)fAB(15.34±0.34)eB(22.24±0.53)dB(28.12±0.35)aA(25.27±0.36)bA(15.15±0.53)eB(29.16±0.56)aA(23.18±0.62)cAB(24.28±0.47)cA(15.60±0.37)eAB

3 結(jié)論與討論

植物防御酶的合成是植物防御體系形成的重要前提[16-18]。環(huán)境脅迫、損傷、昆蟲(chóng)取食或外源激素使植物呼吸作用加強(qiáng)，活性氧(ROS)的產(chǎn)生和代謝失去平衡，導(dǎo)致氧脅迫[19-22]。活性氧爆發(fā)過(guò)程中O2-·常常最先產(chǎn)生，SOD、CAT和POD調(diào)節(jié)氧爆發(fā)過(guò)程中產(chǎn)生的H2O2，協(xié)同植物誘導(dǎo)防御基因的表達(dá)[23]，之后涉及PAL[24]和PPO[25]等催化酚類(lèi)代謝的合成酶的進(jìn)一步提高。

蟲(chóng)害、茉莉酸甲酯和茉莉酮誘導(dǎo)后，球果和主梢SOD、CAT和POD活性在1 d便迅速提高，說(shuō)明3種處理均可誘導(dǎo)植物的抗性反應(yīng)。SOD在抗性反應(yīng)中主要是將O2-·歧化為H2O2[19]。在之后的過(guò)程中CAT可降低H2O2引起的植物表面局部性壞死；并對(duì)作為防御信號(hào)的H2O2起到調(diào)控作用，此過(guò)程可觸發(fā)植物水楊酸代謝途徑，外源施用水楊酸可以顯著誘導(dǎo)H2O2水平，并抑制CAT活性[26]。在植物抗性反應(yīng)中水楊酸途徑與植物抗病性密切相關(guān)并與茉莉酸途徑存在交互作用[27]。本研究利用茉莉酸類(lèi)化合物誘導(dǎo)植物系統(tǒng)防御反應(yīng)可能在一定程度上抑制了水楊酸途徑，從而使CAT的活性更高。POD同樣可以清除H2O2[19]。在細(xì)胞壁中它催化NADH或NADPH氧化產(chǎn)生O-2，O-2進(jìn)一步歧化為H2O2和分子氧，H2O2和POD與細(xì)胞內(nèi)酚底物發(fā)生反應(yīng)，如將酪氨酸低聚物進(jìn)步交聯(lián)，這種作用參與細(xì)胞壁伸展蛋白的偶聯(lián)形成木質(zhì)素[28]。木質(zhì)素被認(rèn)為是抵抗病原侵入和擴(kuò)展以及昆蟲(chóng)取食的重要防衛(wèi)手段。但本研究中POD僅在1 d時(shí)活性較高，后期活性無(wú)顯著增加。研究認(rèn)為當(dāng)參與偶聯(lián)的POD降低時(shí)，細(xì)胞壁的強(qiáng)度降低，則會(huì)促進(jìn)植物細(xì)胞膨大植株生長(zhǎng)[29]。紅松的球果和主梢均為生長(zhǎng)較旺盛的器官，這些部位的特點(diǎn)即為細(xì)胞膨大或增生，因此木質(zhì)素等物理障礙可能不是這些部位的主要防御手段。

PPO存在于植物質(zhì)體內(nèi)囊體，基因家族表達(dá)的多樣性是其顯著特征，保證了其能夠?qū)Ω鞣N因子做出反應(yīng)，以滿(mǎn)足植物體復(fù)雜多變的生理活動(dòng)[30]。創(chuàng)傷損傷、取食和茉莉酸甲酯均可誘導(dǎo)雜交楊(Populustrichocarpa×P.deltoides)PPO基因特異性表達(dá)[31]。煙草被棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)和煙夜蛾(Helicoverpaassulta)取食后，棉鈴蟲(chóng)誘導(dǎo)的PPO活性顯著高于煙夜蛾取食[32]。研究認(rèn)為PPO主要通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生的酚底物結(jié)合，生成活性分子醌來(lái)抵御害蟲(chóng)，醌會(huì)將昆蟲(chóng)食物蛋白中的必需氨基酸烷基化，使昆蟲(chóng)不能利用其營(yíng)養(yǎng)[33]。還有研究認(rèn)為PPO在腺體香毛簇中與酚底物結(jié)合后產(chǎn)生類(lèi)似“超級(jí)黏著”的物質(zhì)，以捕獲體型微小的昆蟲(chóng)[31]。Martin用茉莉酸甲酯處理云杉幼苗，6～9 d后靠近形成層的木質(zhì)部細(xì)胞與周?chē)?xì)胞相比，細(xì)胞質(zhì)變濃，細(xì)胞壁變薄，在富含萜的小腔周?chē)纬蓸?shù)脂導(dǎo)管初生上皮細(xì)胞，15 d后小腔充滿(mǎn)樹(shù)脂[10]。本研究中茉莉酸甲酯、茉莉酮和幼蟲(chóng)取食誘導(dǎo)的PPO在處理后的1～120 d均保持較高水平。眾所周知，紅松在受到損傷后傷口會(huì)大量流脂，這種流脂可以黏著害蟲(chóng)、封閉損傷傷口避免傷口感染，因此推測(cè)這可能是紅松球果和主梢防御取食和損傷的一種主要方式。植物蛋白酶抑制劑和PPO都有抗?fàn)I養(yǎng)的作用，使昆蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)缺乏，從而對(duì)害蟲(chóng)進(jìn)行防御。噴施不同濃度茉莉酸類(lèi)化合物使球果和主梢胰蛋白酶抑制劑活性分別在處理后的1～60 d和1～30 d顯著增加，球果和主梢胰凝乳蛋白酶抑制劑活性分別在處理的1～120 d和30～120 d顯著高于或與蟲(chóng)害取食無(wú)顯著差異，且系統(tǒng)誘導(dǎo)主梢胰凝乳蛋白酶抑制劑活性顯著高于原位誘導(dǎo)。

PAL是細(xì)胞壁酚底物形成的關(guān)鍵酶，它催化L-苯丙氨酸通過(guò)非氧化脫氨反應(yīng)，生成反式肉桂酸和氨，為苯丙烷代謝的第一步，由此進(jìn)入植物次生代謝反應(yīng)，生成香豆酸、阿魏酸等一系列酚酸[24]。本研究中PAL活性也在測(cè)定的1～120 d保持較高水平。PAL和PPO活性持續(xù)時(shí)間與課題組先前對(duì)酚酸的測(cè)定結(jié)果[15]相吻合。可見(jiàn)茉莉酮同樣能夠誘導(dǎo)植物自身防御物質(zhì)的積累。Maria利用茉莉酮處理小麥，誘導(dǎo)的除了反式香豆酸、丁香酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸及順式和反式阿魏酸等酚酸外，還包括多種苯并噁唑嗪酮[14]。Dabrowska et al.[34]研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酮的反應(yīng)生成途徑包括2條：PathA通過(guò)順式-OPDA經(jīng)順式茉莉酸異構(gòu)而形成；PathB順式-OPDA在一定條件下可被轉(zhuǎn)化為反式-OPDA，再經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)形成茉莉酮，但這個(gè)驅(qū)使條件目前尚不明確。同樣的反應(yīng)在龍眼焦腐病菌(Lasiodiplodiatheobromae)也被發(fā)現(xiàn)[35]。可見(jiàn)，在防御反應(yīng)中，植物會(huì)根據(jù)自身情況啟動(dòng)不同茉莉酮反應(yīng)途徑，以應(yīng)對(duì)復(fù)雜的外部環(huán)境。

植物對(duì)茉莉酮信號(hào)的響應(yīng)還存在組織特異性。Michael分別用茉莉酸甲酯和茉莉酮的霧化氣體處理蠶豆(Viciafaba)植株，發(fā)現(xiàn)2種物質(zhì)均誘導(dǎo)莖部防御基因D251序列表達(dá)上調(diào)，而葉部D251序列只有在茉莉酮處理的植株上才能穩(wěn)定表達(dá)[13]。本研究中，紅松球果和主梢經(jīng)茉莉酸甲酯或茉莉酮處理后誘導(dǎo)的防御酶與蛋白酶抑制劑無(wú)組織特異性，可能是因?yàn)橹魃液颓蚬鶎儆诩?xì)胞分類(lèi)比較旺盛的組織器官，因此二者無(wú)顯著差異。

此外，研究發(fā)現(xiàn)一些昆蟲(chóng)還將茉莉酮作為其性信息素的成分[36]。茉莉酮以及茉莉酸途徑的化合物在植物病蟲(chóng)害防治過(guò)程中可能存在更多的潛在價(jià)值，需進(jìn)一步挖掘研究。