IL-27在RA中的作用機(jī)制分析①

滑雅娜 朱凌妍 白 力 王永福

（包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（包頭醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所），包頭014010）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)慢性炎癥為特征的全身系統(tǒng)性疾病，可導(dǎo)致軟骨和骨損傷，甚至殘疾［1］。盡管目前多數(shù)RA患者的治療效果比較樂觀，但仍有患者病情未得到有效控制。因此，急需進(jìn)一步闡明RA的發(fā)病機(jī)制，以開發(fā)新的治療方案。研究發(fā)現(xiàn)，IL-27在自身免疫性疾病中具有免疫抑制作用，但對RA的作用尚未明確［2］。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清IL-27水平明顯高于骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者，且血清IL-27水平與RA疾病活動性呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，本研究通過構(gòu)建小鼠膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（col?lagen-induced arthritis，CIA）模型，探究IL-27在RA疾病進(jìn)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性DBA/1小鼠（8周齡，SPF級，中國南京生物醫(yī)學(xué)研究所）；小鼠rIL-27蛋白購自eBiosci?ence；Power UpTMSYBRTMGreen Master Mix購自美國Thermo Fisher Science；5X All-in-OneRTMaster Mix購自ABM；牛Ⅱ型膠原（CⅡ）和完全弗氏佐劑（CFA）購自Chondrex；核內(nèi)因子染色試劑盒購自eBio-science；滲透緩沖液購自EBioscience；抗體均購自eBio-sci?ence；CantoⅡ流式細(xì)胞儀購自BD；Linegene9600系統(tǒng)購自杭州博日。

1.2 方法

1.2.1 造模及關(guān)節(jié)炎評估 牛Ⅱ型膠原充分混合于完全弗氏佐劑并乳化，分別間隔21 d，2次對DBA/1小鼠進(jìn)行尾部皮下注射牛CⅡ型膠原（100μl/只），構(gòu)建CIA小鼠模型。第2次免疫后約7 d可見小鼠足爪紅腫，觀察并評分直至實驗結(jié)束。采用五級評分法對小鼠關(guān)節(jié)進(jìn)行量化評分（AI）并觀察，2次/周。評分標(biāo)準(zhǔn)：踝關(guān)節(jié)至整個腳掌腫脹記為4分；腳趾至踝關(guān)節(jié)腫脹記為3分；腳趾及腳趾關(guān)節(jié)腫脹記為2分；腳趾關(guān)節(jié)紅斑或腫脹記為1分；正常記為0分，關(guān)節(jié)炎評分為四肢評分總和［3］。

1.2.2 IL-27干預(yù)及分組 小鼠隨機(jī)分為3組：空白對照組（control）、CIA小鼠+同源IgG干預(yù)組（IgG）、CIA小鼠+IL-27干預(yù)組（IL-27干預(yù)組），空白對照組不做任何干預(yù)，IgG組與IL-27干預(yù)組每天腹腔注射等劑量（100μl/只）同源IgG或rIL-27蛋白（2μg），連續(xù)5 d，觀察小鼠關(guān)節(jié)情況并評分。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17、Tr1和Treg比例 收集小鼠脾細(xì)胞，按核內(nèi)因子染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用PMA/離子霉素混合物+BFA/莫能菌素混合物刺激5 h，脾細(xì)胞采用抗CD4和抗CD25染色，固定，細(xì)胞內(nèi)固定和滲透緩沖液滲透，抗IL-17、抗IL-10和抗Foxp3染色，流式細(xì)胞儀收集數(shù)據(jù)并分析。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2.4 ELISA檢測小鼠血清炎癥因子含量 實驗結(jié)束時，心臟采血收集小鼠血液樣本，靜置30 min，離心（3 000 g，15 min），收集血清，-80℃保存?zhèn)溆?，根?jù)ELISA試劑盒說明書檢測血清細(xì)胞因子水平。

1.2.5 RT-PCR檢測小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥因子IL-6、IL-17、IL-10或TGF-β基因表達(dá) 引物由Invitrogen公司合成，以Cyclophilin A為內(nèi)參，序列見表1，Line?gene9600系統(tǒng)檢測，相對量分析基因表達(dá)，所有實驗至少重復(fù)3次。

1.2.6 組織病理學(xué)分析 實驗結(jié)束時處死小鼠，解剖并留取小鼠后肢關(guān)節(jié)，石蠟包埋，切片（5μm），關(guān)節(jié)HE和番紅O染色用于關(guān)節(jié)滑膜炎癥和軟骨損傷病理學(xué)觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism Version 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析和Kruskal-wallis檢驗，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-27對小鼠CIA的改善作用 第2次免疫后開始至實驗結(jié)束時，連續(xù)對CIA小鼠關(guān)節(jié)進(jìn)行觀察評分，結(jié)果顯示，與IgG組相比，IL-27干預(yù)組小鼠關(guān)節(jié)炎評分顯著降低，IL-27干預(yù)后CIA小鼠足爪腫脹程度明顯減輕，且小鼠日?；顒佣容^IgG陽性對照組明顯增強(qiáng)（圖1）。

圖1 小鼠關(guān)節(jié)外形及關(guān)節(jié)炎評分（×100）Fig.1 Joint morphology and arthritisscoreof mice（×100）

2.2 IL-27對小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞、Treg和Tr1細(xì)胞的影響 為更好地了解IL-27對RA的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟中CD4+IL-17+Th17細(xì)胞及CD4+IL-10+Tr1細(xì)胞百分比，結(jié)果顯示，IgG組小鼠脾臟細(xì)胞中CD4+IL-17+Th17細(xì)胞比例明顯高于空白對照組（P＜0.01），IL-27干預(yù)后小鼠脾細(xì)胞中CD4+IL-17+Th17細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.01）。IL-27干預(yù)組小鼠脾細(xì)胞中CD4+IL-10+Tr1細(xì)胞較IgG陽性對照組表達(dá)明顯上調(diào)，3組小鼠脾細(xì)胞內(nèi)CD4+FOXP3+Treg比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明IL-27干預(yù)緩解CIA小鼠病情與抑制Th17細(xì)胞表達(dá)而上調(diào)Tr1細(xì)胞表達(dá)有關(guān)，但并不依賴Treg的負(fù)免疫調(diào)控能力（圖2）。

2.3 IL-27對血清細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用 采用ELI?SA法及RT-PCR法檢測小鼠體內(nèi)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)結(jié)果顯示，與空白對照組相比，IgG組的CIA小鼠血清IL-10、TGF-β、IL-6和IL-17A表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖3A），IL-27干預(yù)后IL-6、IL-17A表達(dá)明顯降低，而IL-10表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），與小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)相關(guān)炎癥因子mRNA表達(dá)趨勢一致（圖3B）。此外，IL-27干預(yù)并未對Treg特征性細(xì)胞因子TGF-β表達(dá)產(chǎn)生影響。表明IL-27可能通過上調(diào)負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子IL-10表達(dá)抑制CIA小鼠促炎因子表達(dá)，如IL-17、IL-6。

圖2 各組小鼠體內(nèi)Th17、Tr1和Treg比例Fig.2 Ratio of Th17，Tr1 and Treg in each group of mice

圖3 小鼠血清及關(guān)節(jié)內(nèi)IL-6、IL-17A、TGF-β和IL-10表達(dá)Fig.3 Expressions of IL-6，IL-17A，TGF-βand IL-10 in mouse serum and intra-articular

圖4 各組小鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)改變（×100）Fig.4 Pathological changes of joint tissue of mice in each group（×100）

2.4 IL-27對CIA小鼠關(guān)節(jié)病理學(xué)狀態(tài)的影響 關(guān)節(jié)受累是RA中最主要的臨床癥狀，對此，本研究進(jìn)一步觀察IL-27干預(yù)對CIA小鼠關(guān)節(jié)骨與軟骨的病理學(xué)狀態(tài)的影響，HE染色（圖4A）及番紅O染色（圖4B）結(jié)果顯示，IgG陽性對照組較空白對照組小鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生和軟骨侵蝕更為嚴(yán)重，IL-27干預(yù)后CIA小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕，關(guān)節(jié)及軟骨表面破壞較IgG陽性對照組明顯減輕。

3 討論

RA是最常見的自身免疫性疾病，其典型病理特征包括滑膜炎癥和關(guān)節(jié)損傷，后期病情若得不到有效控制將嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［4］。因此，深入研究RA的發(fā)病機(jī)制，針對性預(yù)防和治療RA，是當(dāng)前風(fēng)濕領(lǐng)域研究的熱點及重點。

RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其治療方案也多樣化，目前藥物雖可在一定程度上緩解大部分患者病情，但毒副作用較多，停藥后易復(fù)發(fā)，急需開發(fā)新的治療方案。機(jī)體免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子相互作用，共同參與RA發(fā)生發(fā)展［5-8］。其中，部分具有負(fù)調(diào)節(jié)作用的免疫細(xì)胞及因子的作用效果不容忽視。IL-27作為IL-12家族新的細(xì)胞因子，隨疾病種類、病情嚴(yán)重程度及機(jī)體所處應(yīng)激狀態(tài)差異，可通過促進(jìn)Th1細(xì)胞增殖或抑制Th2、Th17細(xì)胞及Treg分化形式發(fā)揮促炎與抑炎雙向效應(yīng)［2，9-10］。近年研究發(fā)現(xiàn)，IL-27可通過負(fù)調(diào)控體內(nèi)TNF-α或Th17細(xì)胞生成延緩AIDS疾病進(jìn)展［11-12］。RA患者病變關(guān)節(jié)滑膜組織與滑膜液中也發(fā)現(xiàn)IL-27表達(dá)，但其潛在作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。此外，Tr1細(xì)胞作為體內(nèi)具有免疫抑制作用的誘導(dǎo)Treg主要通過活化時所分泌的IL-10和TNFβ抑制T細(xì)胞反應(yīng)，或分泌穿孔素B和顆粒酶及通過直接接觸殺傷靶細(xì)胞，從而發(fā)揮負(fù)免疫調(diào)節(jié)功能［13-14］。研究報道，Tr1細(xì)胞參與誘導(dǎo)的多條應(yīng)激信號通路激活可能與RA關(guān)節(jié)損傷和炎癥發(fā)病機(jī)制相關(guān)。IL-27某些免疫調(diào)節(jié)功能發(fā)揮同樣依賴Tr1細(xì)胞［12，15］。因此，為更好研究IL-27在RA中的作用機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測CIA小鼠體內(nèi)Tr1細(xì)胞表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-27干預(yù)后CIA小鼠體內(nèi)Tr1細(xì)胞比例明顯提高，且小鼠體內(nèi)IL-10含量也相應(yīng)升高，表明IL-27可通過促進(jìn)Tr1細(xì)胞及其相關(guān)抑炎因子IL-10生成進(jìn)一步延緩CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，注射給予小鼠牛CⅡ膠原免疫誘導(dǎo)后，其體內(nèi)炎癥因子，如Th17細(xì)胞、IL-17、IL-6等含量升高，且小鼠足爪關(guān)節(jié)紅腫甚至變形，表明小鼠CIA模型構(gòu)建成功。經(jīng)IL-27干預(yù)后，CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀明顯緩解，表現(xiàn)為小鼠關(guān)節(jié)紅腫程度明顯減輕，關(guān)節(jié)炎評分明顯降低，且小鼠日?；顒幽芰γ黠@增強(qiáng)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞和IL-17表達(dá)明顯下調(diào)，表明IL-27可通過抑制小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞表達(dá)及其分泌的IL-17生成，進(jìn)而緩解小鼠關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)展。研究表明，活化的Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17在關(guān)節(jié)滑膜中浸潤是導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟骨損傷的重要原因［16-17］。體內(nèi)Th17細(xì)胞與Treg形成的Th17/Treg軸在生理狀態(tài)下保持動態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體發(fā)生病理性改變，Th17細(xì)胞增多或Tregs表達(dá)受抑制，導(dǎo)致Th17/Treg比例失衡，進(jìn)而導(dǎo)致RA患者病情加重［18］。但本研究并未發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)Treg及其特征性細(xì)胞因子TGF-β表達(dá)變化，因此推測IL-27的抗關(guān)節(jié)炎作用可能主要通過Th17相關(guān)途徑發(fā)揮作用，而非依賴Tregs相關(guān)途徑。與PICKENS等［19］在關(guān)于炎癥性腸病研究中發(fā)現(xiàn)的，IL-27可上調(diào)IBD小鼠脾臟Treg表達(dá)結(jié)論不同，可能與該研究與本實驗所選用疾病模型不同有關(guān)，因此，IL-27在緩解RA疾病進(jìn)展中對Treg的具體作用有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明，IL-27可通過促進(jìn)Tr1細(xì)胞及其相關(guān)抑炎因子IL-10表達(dá)，同時通過抑制Th17相關(guān)途徑緩解CIA小鼠病情進(jìn)展，為IL-27在RA及其他炎癥性疾病治療提供依據(jù)。