Dicamba對高粱成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及繼代的影響

郝曜山，王曉清，王亦學(xué)，張歡歡，杜建中，孫 毅

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西 太原 030031)

【研究意義】高粱是全世界僅次于玉米、水稻、小麥和大麥的第5大禾谷類作物，在我國也是重要的雜糧作物之一，是糧食、釀酒及飼料的重要原料來源[1]。目前，由于高粱的種質(zhì)資源匱乏及有性雜交不親和等原因[2]，傳統(tǒng)的育種方法改良品種進程緩慢，現(xiàn)代基因工程技術(shù)為高粱的快速遺傳改良提供了新的途徑。但植物基因工程技術(shù)常常依賴于植物組織培養(yǎng)高頻再生體系。盡管對高粱較早就開始了基因轉(zhuǎn)化體系方面的研究，但進展緩慢。高粱被公認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)化最困難的作物之一[3]，主要是由于高粱組織培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)及再生頻率較低，高效再生體系建立比較困難。研究并使用新的植物誘導(dǎo)激素是改變這一困境的手段之一?！厩叭搜芯窟M展】麥草畏(Dicamba)是一種植物生長調(diào)節(jié)劑、除草劑[4]，近些年，利用小麥、玉米等作物的幼胚和成熟胚作為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)和分化方面都有較成熟的研究及應(yīng)用，但在高粱組織培養(yǎng)方面鮮有研究報道。Maria等[5]首次使用Dicamba對小麥成熟胚進行離體培養(yǎng)，證實其在愈傷組織再生方面比2,4-D有更好的效果。彭琳等[6]在小麥成熟胚高頻再生基因型篩選及再生體系研究中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中麥草畏的誘導(dǎo)效果顯著優(yōu)于2,4-D。Ren等[7]研究結(jié)果表明，當(dāng)麥草畏濃度為4.0 mg· L-1時，周麥18的植株再生頻率最高(82.65 %)。李海霞等[8]研究表明，麥草畏誘導(dǎo)的玉米掖478愈傷組織培養(yǎng)一年后仍能保持良好的生長狀況，其在提高愈傷組織質(zhì)量方面具有明顯的促進作用?！颈狙芯壳腥朦c】以高粱組織培養(yǎng)常用的的誘導(dǎo)激素2,4-D 為對照，研究Dicamba對高粱成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及繼代再生的影響及效果，國內(nèi)外鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以4個基因型的高粱成熟胚為外植體，研究Dicamba對高粱愈傷組織誘導(dǎo)、繼代及愈傷組織再生質(zhì)量的影響，并與2,4-D誘導(dǎo)高粱成熟胚的效果進行比較研究，建立并優(yōu)化其組織培養(yǎng)再生體系，為今后高粱遺傳轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

4個來源不同國家、地區(qū)的高粱品種或品系:太粒105(中國)、Is-623(印度)、88BP28(美國)和299(日本)均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所保存提供。

1.2 培養(yǎng)基

誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基：①MS培養(yǎng)基+ Dicamba (1、2.5、5、7.5、10 mg·L-1) +蔗糖30 g·L-1+KH2PO41.53 g·L-1+Gelrite 2.4 g·L-1+硝酸銀5 mg·L-1+ N-Z-Amine 100 mg·L-1。②MS培養(yǎng)基+2,4-D (1、2.5、5、7.5、10 mg·L-1) +蔗糖30 g·L-1+KH2PO41.53 g·L-1+Gelrite 2.4 g·L-1+硝酸銀5 mg·L-1+ N-Z-Amine 100 mg·L-1(表1)。③分化培養(yǎng)基：MS+KT 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+KH2PO41.53 g·L-1+Gelrite 2.4 g·L-1。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基Table 1 The callus induction medium

用KOH將以上培養(yǎng)基pH調(diào)為5.8，121 ℃高壓滅菌20 min，在滅菌后溫度降至60 ℃左右時于超凈工作臺加入硝酸銀和N-Z-Amine。以上試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

培養(yǎng)室的溫度為(27±3) ℃，光周期條件為光16 h/暗8 h，光照強度為2000～5000 lx[9]。

1.3 試驗方法

1.3.1 高粱成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo) 挑選成熟飽滿的高粱種子，用自來水沖洗除去表面雜質(zhì)，無菌條件下75 %的酒精消毒1 min，再用30 %的雙氧水消毒1.5～3.0 h。處理后的種子用無菌水沖洗6 遍，用無菌吸水紙吸干種子表面殘留的水分，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上黑暗、25 ℃環(huán)境條件下誘導(dǎo)愈傷組織。

1.3.2 愈傷組織誘導(dǎo)率及胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的統(tǒng)計 高粱成熟種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng) 14 d后(誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后高粱種子萌動，部分會長出 1 cm 左右的畸形嫩芽，用鑷子將嫩芽生長點部分掐掉，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，愈傷組織大部分由胚軸或胚根誘導(dǎo)產(chǎn)生)，調(diào)查統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率(即出愈率)及不同類型愈傷組織比率；將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織繼代培養(yǎng)2次，繼續(xù)統(tǒng)計不同類型愈傷組織的比例；將存活的不同類型愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，26 ℃光照條件下培養(yǎng)14～21 d，在光下變綠的愈傷組織計算為胚性愈傷組織，統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導(dǎo)率[10]。

在愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代過程中,參照 AMSTRONG 等[11]、胡彥民等[12]的標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合本研究高粱成熟胚培養(yǎng)的實際試驗情況，把高粱產(chǎn)生的愈傷組織劃分為 3 種類型。Ⅰ型： 膨大的愈傷部分結(jié)構(gòu)緊密、堅硬，不易分開，表面有尖狀或條狀突起，生長緩慢，有時會產(chǎn)生叢生芽，不易產(chǎn)生胚狀體，不易繼代培養(yǎng)；Ⅱ型：介于Ⅰ型和 Ⅲ型之間，愈傷組織呈顆粒狀，結(jié)構(gòu)松散、按壓易碎，易散， 白色或淡黃色，有光照呈淡綠色，易分化為胚狀體，可長期繼代培養(yǎng)； Ⅲ型：結(jié)構(gòu)較松軟，呈水漬狀，有些表面有粘稠的細(xì)胞團，常為白色透明或半透明狀，繼代培養(yǎng)容易，該愈傷組織生長迅速， 但很少能分化為胚狀體。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理和分析 出愈率(%)=(高粱種子成熟胚經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)/ 接種高粱成熟種子數(shù) )×100 %

E(%)=[Ⅱ型愈傷率/(Ⅰ型愈傷率+Ⅱ型愈傷率+Ⅲ型愈傷率)]×100 %

U(%)=(Ⅱ型愈傷組織分化產(chǎn)生的胚性愈傷組織數(shù)/ 該處理獲得的總胚性愈傷組織數(shù))×100 %

胚性愈傷率(%)=(產(chǎn)生的胚性愈傷組織數(shù) /轉(zhuǎn)接的總愈傷組織數(shù)) ×100 %

統(tǒng)計時已去除因污染、操作失誤等原因不能計數(shù)的愈傷組織。

2 結(jié)果與分析

2.1 Dicamba對高粱成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將不同基因型的高粱種子(成熟胚)接種在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng) 14 d，進行出愈率的統(tǒng)計調(diào)查(表2)。各基因型高粱的愈傷組織誘導(dǎo)率(出愈率)在不同濃度激素處理下存在差異，較低濃度的Dicamba處理下(D1、D2)，材料88BP28和299的平均出愈率較高，培養(yǎng)基中Dicamba濃度(D3、D4、D5)提高時，材料Is-623和88BP28的平均出愈率最高；各個2，4-D濃度(M1、M2、M3、M4、M5)誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中，材料Is-623和88BP28的出愈率均高于其他材料；不同濃度Dicamba的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，各基因型材料出愈率在24.7 %～90.7 %變化，而不同濃度的2，4-D處理時，出愈率范圍則在72.5 %～90.5 %之間變化，表明各基因型材料使用不同激素處理時，出愈率變化范圍不同， Dicamba處理的材料隨著濃度變化出愈率變化范圍更大；不同基因型材料最佳出愈率的激素種類和質(zhì)量濃度不同，Is-623在 Dicamb質(zhì)量濃度為5.0 mg·L-1(D3處理)時出愈率最高，達88.3 %，而Dicamb質(zhì)量濃度為 7.5 mg·L-1時，太粒105、88BP28和299的出愈率最高，分別達到84.2 %、90.7 %和79.6 %，說明不同基因型對 Dicamb最佳誘導(dǎo)質(zhì)量濃度的要求有差異，在 2.5 mg·L-12,4-D(M2處理)處理時，所有基因型材料較其它處理濃度出愈率高，不同基因型材料間有較好的一致性；在誘導(dǎo)高粱成熟胚愈傷組織方面，88BP28在Dicamb 7.5 mg·L-1(D4處理)時，出愈率達到90.7 %，2,4-D 2.5 mg·L-1(M2處理)時達到90.5 %，同樣Is-623在2種激素誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中最高出愈率分別為87.7 %和89.6 %，太粒105在2種激素誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中最高出愈率分別為84.2 %和80.0 %，299在2種激素誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中最高出愈率分別為79.6 %和82.6 %，說明2種激素在誘導(dǎo)高粱成熟胚出愈率方面無明顯差異。

表2 不同植物激素培養(yǎng)基對對高粱成熟胚愈傷組織出愈率的影響Table 2 Effect of different plant hormone medium on callus induction rate of sorghum mature embryo

2.2 不同質(zhì)量濃度Dicamba與2,4-D對初代培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織類型的影響

各基因型高粱材料在Dicamba及2,4-D不同質(zhì)量濃度及配比下誘導(dǎo) 14 d，將愈傷組織周邊的畸形嫩芽、根及種皮去除，切取誘導(dǎo)的愈傷組織并夾碎，放在與原誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分相同的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，7 d后調(diào)查各基因型愈傷組織類型的比例(表3)。將高粱種子(成熟胚)初代誘導(dǎo)培養(yǎng)，各基因型材料畸形生長或死亡率(未脫分化率)均比較高，褐變率較低，誘導(dǎo)出愈傷組織的類型中，Ⅰ型和Ⅲ型居多，Ⅱ型相對較少，且多和其它2種類型嵌合生長。E值是所誘導(dǎo)的Ⅱ型愈傷組織率與誘導(dǎo)出的所有愈傷組織率的比值，以往的研究表明，植物組織培養(yǎng)分化再生與Ⅱ型愈傷組織能否產(chǎn)生有很大的關(guān)系，因此，E值可以有效預(yù)測組織培養(yǎng)再生的效率。不同基因型材料間產(chǎn)生的愈傷組織類型存在差異，太粒105與Is-623Ⅱ型愈傷率在不同激素種類及質(zhì)量濃度處理條件下均顯著高于88BP28與299，其中Is-623初代愈傷培養(yǎng)時在D3培養(yǎng)基中誘導(dǎo)E值達到13.3 %，太粒105初代愈傷培養(yǎng)時在M2培養(yǎng)基中誘導(dǎo)E值達到15.8 %，雖然88BP28出愈率顯著高于其它基因型材料，但誘導(dǎo)的愈傷組織類型中Ⅰ型占絕大多數(shù)，Ⅱ型幾乎沒有，各激素種類及質(zhì)量濃度處理條件下E值均接近0，材料299初代愈傷誘導(dǎo)類型中Ⅲ型愈傷率顯著高于其它基因型材料，E值顯著低于太粒105與Is-623Ⅱ，但又顯著高于材料88BP28。在初代培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織類型統(tǒng)計試驗中，Dicamba與2,4-D相比并沒有顯著優(yōu)勢，太粒105的E值最高點出現(xiàn)在2,4-D的M2培養(yǎng)基處理中，而Is-623的E值最高點出現(xiàn)在Dicamba的D3培養(yǎng)基處理中。

表3 成熟胚在不同植物激素脫分化14 d后各基因型誘導(dǎo)愈傷組織的生長情況Table 3 Callus growth of mature embryo induced by different plant hormones 14 days after dedifferentiation

續(xù)表3 Continued table 3

2.3 不同質(zhì)量濃度及配比Dicamba與2,4-D對不同基因型高粱繼代培養(yǎng)愈傷組織類型的影響

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的各類型愈傷組織放在與原誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素種類與質(zhì)量濃度相同的繼代培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)2次(14 d/次)，統(tǒng)計調(diào)查不同類型愈傷組織的比例及變化(表4)。結(jié)果顯示，繼代培養(yǎng)與初代誘導(dǎo)培養(yǎng)比較，各基因型材料的褐變率均隨著繼代次數(shù)的增加而增加，88BP28的褐變率在相同濃度梯度下最高；隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織的類型有所變化，105與Is-623組織培養(yǎng)E值較初代誘導(dǎo)培養(yǎng)顯著提高，說明不同類型之間的愈傷組織在繼代培養(yǎng)時會相互轉(zhuǎn)變，Is-623隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)增加在D3培養(yǎng)基中E值最高，達到20.1 %。 88BP28在2種激素不同質(zhì)量濃度處理下E值仍接近0，表明Ⅱ型愈傷組織的產(chǎn)生與基因型有關(guān)；此外，各基因型材料初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的Ⅰ型愈傷率均較高，繼代培養(yǎng)后Ⅲ型愈傷率均顯著提高，Ⅰ型愈傷率顯著降低，說明Ⅰ型愈傷組織不僅可向Ⅱ型愈傷組織轉(zhuǎn)變，也可向Ⅲ型愈傷組織轉(zhuǎn)變；在繼代培養(yǎng)中，Dicamba與2,4-D相比，太粒105與Is-623在Dicamba繼代試驗中E值較初代培養(yǎng)明顯增加，而2,4-D在繼代試驗中E值較初代培養(yǎng)增加緩慢，表明針對一些類型基因型材料如太粒105，Dicamba比2,4-D在繼代培養(yǎng)更容易誘導(dǎo)出Ⅱ型愈傷組織。

表4 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)入與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同濃度激素的繼代培養(yǎng)基培養(yǎng) 2次后各類型的愈傷率統(tǒng)計Table 4 Statistics of callus rate of each type after 2 times of subculture with the same hormone concentration in the media

2.4 不同質(zhì)量濃度Dicamba與2,4-D對胚性愈傷組織概率的影響

繼代誘導(dǎo)所產(chǎn)生的愈傷組織中，胚性愈傷組織的占比與植株再生的概率直接相關(guān)，而Ⅱ型愈傷率與胚性愈傷組織的形成的概率直接相關(guān)。將存活的不同類型愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，26 ℃光照條件下培養(yǎng)14～21 d，統(tǒng)計綠色顆粒狀，結(jié)構(gòu)松散的愈傷組織數(shù)，即胚性愈傷組織數(shù)(表5)。U值為本研究中為了 證實胚性愈傷組織的形成與Ⅱ型愈傷組織相關(guān)而設(shè)定的值，其大小反應(yīng)形成的胚性愈傷組織數(shù)來自Ⅱ型愈傷組織所占的比率。4種基因型材料中， 5.0 mg·L-1Dicamba誘導(dǎo)Is-623的胚性愈傷率最高，胚性愈傷組織中94.4 %由Ⅱ型愈傷組織形成，5.6 %由Ⅰ型愈傷組織形成；太粒105與Is-623胚性愈傷率遠(yuǎn)高于88BP28與299，說明胚性愈傷組織的形成與基因型相關(guān)；相同基因型材料，Dicamba誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上時，胚性愈傷的生成率遠(yuǎn)高于由2,4-D誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織；所有基因型材料及不同的處理的U值均在60 %～100 %，證實了胚性愈傷組織絕大多數(shù)來自Ⅱ型愈傷組織。

表5 不同植物激素對胚性愈傷組織概率的影響Table 5 Effects of different plant hormones on embryogenic callus rate

續(xù)表5 Continued table 5

3 討 論

本研究對 4個親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的高粱材料的成熟胚進行了愈傷組織誘導(dǎo)及繼代研究，相比較其它基因型材料，無論是Dicamba還是2,4-D誘導(dǎo)，Is-623更易誘導(dǎo)出高質(zhì)量愈傷組織，太粒105雖能誘導(dǎo)出較高質(zhì)量的愈傷組織，但誘導(dǎo)率較低，與其它基因型材料相比，88BP28出愈率較高，但高質(zhì)量愈傷組織(Ⅱ型愈傷組織)很難形成。表明用高粱成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的出愈率及愈傷組織類型受基因型差異影響，該結(jié)果與王良群等[13]研究結(jié)論相同。

植物激素是植物愈傷組織誘導(dǎo)和胚性分化的關(guān)鍵性因素[8]。對Dicamba與2,4-D的比較顯示：不同基因型高粱成熟胚初代愈傷組織誘導(dǎo)試驗中，2種激素所誘導(dǎo)的最高出愈率差異不明顯，但Dicamba質(zhì)量濃度 在1～10.0 mg·L-1變化時，其出愈率(Is-623)先從30.0 %(D1)提高到88.3 %(D3)，再下降到80.5 %(D5)，變化幅度50.3 %。其它基因型材料也表現(xiàn)出先升高再降低的變化規(guī)律，變化幅度稍有不同。而2,4 -D質(zhì)量濃度 在1.0～10.0 mg·L-1變化時， Is-623的出愈率先從82.4 %(M1)提高到89.6 %(M3)，再下降到82.1 %(M5)，變化幅度7.5 %，遠(yuǎn)小于Dicamba誘導(dǎo)時的變化幅度，說明不同基因型材料出愈率受Dicamba的濃度梯度影響更為明顯，也說明Dicamba與2,4-D誘導(dǎo)植物形成愈傷組織的機理不同[14]；繼代培養(yǎng)及胚性愈傷組織分化試驗中，對Is-623和太粒105基因型材料而言，培養(yǎng)基中使用Dicamba作為激素更有利于Ⅱ型愈傷組織及胚性愈傷組織的形成，其誘導(dǎo)分化效果優(yōu)于2,4-D，該研究結(jié)果與李海霞等[8]在Dicamba誘導(dǎo)玉米幼胚的研究結(jié)果是相反的，可能由于不同物種之間的基因差異造成。

本試驗中，高粱成熟胚組織培養(yǎng)過程中，愈傷組織的褐變率并沒有隨著Dicamba或2,4-D的質(zhì)量濃度增加而增加，而隨著繼代次數(shù)的增加而增加，且不同基因型材料間褐變率差異明顯，說明高粱組織培養(yǎng)時褐變的發(fā)生受自身的基因型因素影響較大。在初代愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)的愈傷組織類型統(tǒng)計試驗中，發(fā)現(xiàn)初代愈傷組織誘導(dǎo)Ⅰ型愈傷組織占比較高，相同質(zhì)量濃度激素下，隨著繼代次數(shù)增加，愈傷組織類型由Ⅰ型向Ⅱ型、Ⅲ型轉(zhuǎn)變，不同基因型間轉(zhuǎn)變也不盡相同，太粒105與Is-623由Ⅰ型愈傷組織向Ⅱ型、Ⅲ型轉(zhuǎn)變均較多，而88BP28與299則主要向Ⅲ型愈傷組織轉(zhuǎn)變，由此可見，高粱成熟胚遺傳體系的建立受基因型影響較大，選擇合適的基因型材料(如Is-623)十分關(guān)鍵[15]。另外， Dicamba對高粱成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的影響的研究較少,本研究也僅對其愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)進行了統(tǒng)計分析，高粱幼苗再生及生根成活是否有積極作用仍需進一步進行研究。

4 結(jié) 論

利用Dicamba對高粱成熟胚進行初代愈傷組織誘導(dǎo)，其出愈率與2,4-D誘導(dǎo)差異不顯著，在繼代培養(yǎng)及胚性愈傷組織分化試驗中，培養(yǎng)基中使用Dicamba作為激素更有利于Ⅱ型愈傷組織及胚性愈傷組織的形成，其效果優(yōu)于2,4-D；高粱成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織及胚性愈傷組織的發(fā)生受基因型影響較大，材料Is-623在Dicamba 5 mg·L-1時，與其它材料相比胚性愈傷發(fā)生率更高，且褐化及死亡率較低；高粱成熟胚為外植體的組織培養(yǎng)中，隨著繼代次數(shù)增加愈傷組織類型由Ⅰ型向Ⅱ型、Ⅲ型轉(zhuǎn)變的規(guī)律；可用E值[Ⅱ型愈傷率/(Ⅰ型愈傷率+Ⅱ型愈傷率+Ⅲ型愈傷率)%]很好地預(yù)測組培再生的效率。