不同糖種類及濃度對百子蓮‘Big Blue’體胚發(fā)生的影響

岳建華，史亞冰，李文星，董 艷，張 燕，李文楊*

(1.信陽農林學院園藝學院，河南 信陽 464100；2.信陽農林學院林學院，河南 信陽 464100；3.信陽市大別山區(qū)園藝植物遺傳改良重點實驗室，河南 信陽 464100)

【研究意義】碳源可為植物離體培養(yǎng)提供能量，合成細胞碳骨架，參與滲透壓、氧化脅迫平衡的調節(jié)[1]。不同種類及濃度碳源可顯著調節(jié)植物離體培養(yǎng)過程中的形態(tài)建成，影響植物器官發(fā)生途徑(Organogenesis)或體細胞胚胎發(fā)生(Somatic embryogenesis，SE)效果[2]。不同植物、同種植物在離體培養(yǎng)不同階段所需要的碳源種類及濃度不同[2]。蔗糖為最普遍應用的碳源，牡丹(Paeoniasuffruticosa)組織培養(yǎng)時，蔗糖效果優(yōu)于可溶性淀粉、無水葡萄糖[3]；麥芽糖利于棉花(Gossypiumhirsutum)胚性愈傷組織誘導，葡萄糖利于其胚狀體的形成和植株再生[4]；3 %蔗糖利于布朗百合(Liliumbrownii)離體再生[5]；2 %葡萄糖利于山核桃(Caryacathayensis)胚性愈傷組織的誘導，而5 %的蔗糖利于其體胚萌發(fā)[6]。綜上，碳源種類及濃度可顯著影響離體培養(yǎng)的效果[2,7]，對特定物種特定發(fā)育階段進行精細的碳源調控可顯著提升離體培養(yǎng)的效果?！厩叭搜芯窟M展】百子蓮‘Big Blue’(Agapanthuspraecoxssp.orientalis‘Big Blue’)又稱藍百合，為藍色大花品種，花姿優(yōu)雅，具有極高的觀賞價值，且抗逆性極強，在國內已逐步推廣，市場前景廣闊[8]。植物組織培養(yǎng)，尤其是SE技術成為百子蓮快繁的重要途徑[9]。雖然百子蓮的SE體系已經建立[9-10]，但植物體胚發(fā)生的機制仍是未解之謎[11]，導致體胚發(fā)生效率較低。離體條件下，植物SE過程是一個受激素[12]、碳源[2,13]、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)及培養(yǎng)環(huán)境[14]共同調控的復雜發(fā)育過程[15]，目前百子蓮SE體系的研究僅以PIC為激素、蔗糖作為碳源[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c】碳源對植物離體培養(yǎng)具有重要影響，但對百子蓮SE的調節(jié)效果未見系統(tǒng)研究，尤其是在成熟胚發(fā)育階段的調節(jié)效果及機理鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬利用胚性愈傷(Embryogenic callus，EC)為試材，通過蔗糖、葡萄糖、麥芽糖及濃度(2 %～4 %)[13]的比較，優(yōu)化百子蓮‘Big Blue’體胚發(fā)生體系，為百子蓮SE快繁提供技術參考。同時，通過測定糖代謝、激素代謝、氧化脅迫等生理指標，初步揭示碳源種類及濃度對成熟胚發(fā)育的生理調節(jié)機制，豐富植物體胚發(fā)生理論。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

百子蓮‘Big Blue’購自南京市彩虹花卉公司，2018年5月，選取5年生植株未開裂的小花苞，切取小花梗作為外植體進行愈傷組織的誘導，參照何葉[16]的方法。愈傷組織每月繼代1次，7～9個月后，得到單細胞起源的EC，繼代6個月后用于試驗研究。選取狀態(tài)一致、顏色鮮黃、結構疏松的EC。

1.2 試驗設計

按照表1糖種類及濃度進行培養(yǎng)基配制。

1.3 培養(yǎng)基配制

稱取MS干粉(Phytotech Lab M519)4.43 g·L-1、

表1 培養(yǎng)基中糖種類及濃度

按2 %、3 %、4 %(w/v)濃度分別加入3種糖，用磁力攪拌器溶解混勻，1 mol/L NaOH溶液調pH至6.0，加瓊脂粉7.0 g·L-1，121 ℃高壓滅菌25 min，降溫至60 ℃置于超凈工作臺內，分裝至90 mm× 16 mm玻璃培養(yǎng)皿，每培養(yǎng)皿分裝25 mL培養(yǎng)基，冷卻至室溫后接種。

1.4 材料接種

體胚誘導階段，每個培養(yǎng)皿平板接種1.0 gEC，平分為大小基本相同的7個細胞團，每處理接種5個培養(yǎng)皿，重復3次。獲得均勻一致的幼胚用于成熟胚發(fā)育階段實驗，接種方法同體胚誘導。

1.5 培養(yǎng)條件

幼胚誘導、成熟胚發(fā)育過程設溫度(25±2) ℃，相對濕度65 %，暗培養(yǎng)1周后，轉至光下培養(yǎng)(14 h/10 h，光/暗)，光照強度為50 μmol·m-2·s-1。光下繼續(xù)培養(yǎng)3周后統(tǒng)計數據。

1.6 數據記錄

以誘導獲得的幼胚及成熟胚數量作為數據統(tǒng)計指標，分別統(tǒng)計幼胚(≥1 mm，乳白色)和成熟胚(≥5 mm，具有完整植株結構，形態(tài)學上端轉為綠色)數量。

1.7 生理測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定糖類、激素、活性氧與保護酶等生理指標，參照Pradko(2015)的方法[17]，委托上海酶聯(lián)生物科技有限公司測定。

1.8 數據分析

用Excel 2016、GraphPad Prism 5、Adobe Acrobat DC、Adobe Photoshop軟件進行數據整理和制圖，用IBM SPSS Statistics 20數據分析軟件進行顯著性檢驗(Duncan法，P< 0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同糖種類及濃度對百子蓮幼胚誘導的影響

由圖1可知，3種糖及其濃度對體胚誘導效果具有顯著影響，蔗糖的誘導效果相對較好，其次為葡萄糖、麥芽糖。其中3 %蔗糖處理成胚數量最多，平均為117.33個，顯著高于其他各處理(P< 0.05)，幼胚呈現(xiàn)松散的顆粒狀，乳白色。3種濃度葡萄糖處理，對成胚數量影響不顯著，其中3 %葡萄糖處理成胚數量較多，其次為2 %和4 %葡萄糖處理；葡萄糖處理幼胚的一致性較好，尺寸略小于蔗糖處理。以麥芽糖作為碳源的成胚數量較少，同步化效果較差。

2.2 不同糖種類及濃度對百子蓮成熟胚發(fā)育的影響

不同種類和濃度糖對百子蓮成熟胚發(fā)育存在顯著影響，蔗糖相對較好，其次為葡萄糖、麥芽糖(圖2)。其中2 %蔗糖處理成熟胚數量最多，為51.75個，顯著高于其他各處理(P<0.05，圖2-B)，多為鮮綠色(圖2-A)，而4 %麥芽糖處理效果最差，平均為4.00個。隨蔗糖濃度的提高，成熟胚數量逐漸減少。3種葡萄糖濃度處理對百子蓮成熟胚數量影響不顯著，其中2 %葡萄糖處理成熟胚數量相對較多。麥芽糖作為碳源的成熟胚數量最少，處理間差異不顯著，3 %效果相對較好，多為黃綠色(圖2-A)。

2.3 不同糖濃度對百子蓮成熟胚發(fā)育糖代謝的影響

碳源對百子蓮成熟胚發(fā)育期糖代謝具有顯著影響(圖3)?？偺呛繙y定結果顯示，葡萄糖和麥芽糖處理整體上高于蔗糖處理，隨著蔗糖濃度的升高總糖含量逐漸降低，與成熟胚數量的變化規(guī)律基本一致。而葡萄糖處理下，百子蓮總糖含量差異不顯著。麥芽糖處理下百子蓮總糖含量最高(圖3-A)；百子蓮淀粉含量的變化規(guī)律與總糖差異較大，蔗糖處理下淀粉含量相對較高，其中3 %蔗糖處理百子蓮淀粉含量最高(圖3-B)；百子蓮體胚組織內蔗糖含量在3種糖類濃度處理下呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，3 %濃度處理下百子蓮內源蔗糖含量較低(圖3-C)；葡萄糖處理百子蓮內源葡萄糖含量相對高，其中3 %葡萄糖處理顯著高于其他處理(圖3-D)；百子蓮麥芽糖的變化規(guī)律和總糖呈現(xiàn)出相似的規(guī)律，蔗糖處理下呈現(xiàn)梯度變化規(guī)律(圖3-E)；不同碳源處理下，百子蓮果糖含量的差異相對較小(圖3-F)。成熟胚發(fā)育階段糖代謝分析結果表明，總糖、淀粉、蔗糖與麥芽糖含量與成熟胚發(fā)育相關性較強。

2.4 不同糖濃度對百子蓮成熟胚發(fā)育內源激素含量的影響

碳源對成熟胚激素代謝存在顯著影響(圖4)。蔗糖處理下，IAA含量與成熟胚數量變化趨勢相反，葡萄糖和麥芽糖處理下，IAA含量與成熟胚數量變化趨勢相同，而IAA-氧化酶活性和IAA含量的變化趨勢相反(圖4-A，圖4-C)。隨著碳源濃度的升高，GAs總量出現(xiàn)升高的趨勢(圖4-D)，GAs組分中GA3和GA4含量高于GA1；蔗糖處理下，GA1和GA4含量隨濃度的升高而升高，而GA3含量隨濃度升高而降低；葡萄糖處理下，GA4含量與成熟胚數量呈現(xiàn)相反的變化規(guī)律；麥芽糖處理下，GA1和GA3含量與成熟胚數量呈現(xiàn)相反的變化規(guī)律(圖4-E，圖4-G)。CTK和BR是除了生長素和GA之外調節(jié)植物生長的重要激素，蔗糖和麥芽糖處理下，兩者含量變化呈現(xiàn)相反的規(guī)律(圖4-H，圖4-I)。蔗糖處理下，ABA含量相對較低，而葡萄糖和麥芽糖處理下，ABA含量相對較高(圖4-J)。乙烯、JA含量的變化幅度相對較小，且趨勢相似(圖4-K，圖4-L)。激素定量結果表明，生長素、GA因具有梯度變化規(guī)律，在成熟胚發(fā)育過程中可能作用顯著。

2.5 不同糖濃度對百子蓮成熟胚發(fā)育活性氧含量及保護酶活性的影響

不同糖處理對活性氧及保護酶活性具有顯著影響(圖5)。ROS活性與成熟胚發(fā)育數量趨勢相似，在2 %蔗糖、2 %葡萄糖、3 %麥芽糖處理下相對較高(圖5-A)。蔗糖處理下，·OH含量整體上高于葡萄糖、麥芽糖，但不同濃度蔗糖處理·OH含量差異不顯著(圖5-B)。H2O2含量整體上隨著糖濃度增加而升高，葡萄糖處理下呈現(xiàn)梯度變化(圖5-C)。

保護酶活性變化幅度大于ROS及其組分，POD、CAT活性規(guī)律性相對較弱(圖5-D，圖5-E)。SOD活性隨著蔗糖濃度的升高而升高，但與成熟胚發(fā)育效果趨勢相反(圖5-F)。

3 討 論

除了光自養(yǎng)體系，碳源是植物離體培養(yǎng)中不可或缺的因素[15]。碳源可構成細胞碳骨架，并為細胞呼吸代謝提供底物與能量[1]，植物對碳源的需求因種類、基因型、發(fā)育階段均有差異[15]。本研究發(fā)現(xiàn)百子蓮體胚誘導及發(fā)育成熟階段對碳源濃度的需求分別為3 %和2 %，蔗糖可作為百子蓮SE體系的優(yōu)選碳源，葡萄糖利于體胚同步化，而麥芽糖效果較差，與山核桃(Caryacathayensis)基本一致[6]。蔗糖可通過改變培養(yǎng)基的滲透壓，使細胞失水，內含物濃度升高，影響體細胞胚的數量及成熟[18]，例如內源蔗糖的積累對荔枝(Litchichinensis)SE效率至關重要[19]。而在成熟胚的發(fā)育及生根過程中，低濃度的碳源可促進淀粉向蔗糖的轉化，使體胚內滲透壓升高，造成細胞吸水，致使代謝增強，另一方面，成熟胚發(fā)育過程中，較低的滲透壓利于根系從培養(yǎng)基中吸收養(yǎng)分。

碳源在體胚發(fā)生中起著重要作用，不僅為細胞分裂、分化提供能量，參與信號轉導，物質運輸，還可調節(jié)細胞糖代謝，進而影響植物生長[15]。碳源種類和濃度在體胚的發(fā)生和成熟發(fā)育階段代謝復雜[13,15]。趙舒野[20]發(fā)現(xiàn)蔗糖可以顯著提高胡桃楸(Juglansmandshurica)體胚發(fā)生，挪威云杉(Piceaabies)體胚成熟過程中，總可溶性糖的含量降低，蔗糖相對含量升高，利于成熟胚發(fā)育[21]，與本研究結果一致。也有研究表明麥芽糖由于分解較慢，可為體胚后期成熟階段提供更穩(wěn)定的能量供給，從而利于體胚發(fā)生[22]。淀粉的積累通常作為體胚發(fā)生中的重要事件，可在體胚發(fā)育過程中快速分解，為細胞旺盛分裂活動提供能量[11,22]，例如荔枝(Litchichinensis)SE過程中，在淀粉酶、轉化酶作用下，淀粉可轉化為蔗糖，滿足體胚發(fā)生物質能量需求[19]。本研究中2 %蔗糖處理的淀粉含量顯著低于3 %、4 %蔗糖處理，內源蔗糖含量顯著高于3 %蔗糖處理，而該處理成熟胚發(fā)育效果最佳，表明淀粉向蔗糖的轉化可能為體胚發(fā)育提供了充足的能量，而內源蔗糖的積累對體胚發(fā)育更為關鍵[19]。

植物激素是自身合成與代謝的產物，調控細胞分化、生長方向與進程[23]。生長素、GA、CTK、ABA、乙烯等對體胚誘導具有重要作用，但因物種而異[24]。本研究中生長素、GA組分隨蔗糖濃度呈梯度變化，且與成熟胚誘導效果關系密切，其作用可能相對重要。雙子葉植物，例如寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)，體胚誘導時需要加入2,4-D[25]，而百子蓮等單子葉植物胚性誘導及維持則需加入PIC[9,16]。2,4-D和PIC均為外源激素類物質，通過調節(jié)細胞內源IAA的合成與信號調控體胚發(fā)生[23,26]。IAA可通過調節(jié)細胞極性誘導體胚形成，因此體胚誘導階段通常需要較高濃度的IAA，內源IAA含量是調節(jié)體胚發(fā)生的主導因素[27-28]。本研究中，IAA在蔗糖處理下呈現(xiàn)梯度變化，濃度與成熟胚數量趨勢相反，可能是因為體胚誘導階段積累的IAA較多，而在體胚成熟發(fā)育階段，高濃度IAA對成熟胚發(fā)育不利，因為高濃度的IAA會抑制頂端優(yōu)勢的形成，不利于成熟胚發(fā)育成植株。GA對體胚發(fā)生的效果因物種而異，多數研究表明高濃度GA對SE誘導不利[29-30]，本研究中，具有生物活性的GA1、GA4與成熟胚數量相反，與紫花苜蓿(Medicagosativa)[31]、天竺葵(PelargoniumhortorumBailey)[29]結果一致。

離體培養(yǎng)產生的氧化脅迫可導致代謝紊亂，甚至細胞死亡[32]。植物通過增強抗氧化酶活性清除ROS[33]。不適的糖種類及濃度會對植物造成脅迫，而ROS和保護酶活性存在動態(tài)平衡。在ROS類別中，H2O2可影響基因表達，是非生物脅迫重要的信號分子之一[34-35]。中等強度的H2O2對棉花、牡丹(Paeoniasuffruticosa)離體培養(yǎng)有促進作用[24,36]。蒔蘿(Anethumgraveolens)在愈傷組織誘導體細胞胚階段，H2O2含量持續(xù)上升，球形胚時期達到最高，而成熟胚時期含量下降[37]。在本研究中，H2O2含量隨糖濃度的升高而增加，SOD活性加強，而最終成熟胚發(fā)育效果隨糖濃度升高而降低，表明H2O2含量、SOD活性增強時脅迫相對嚴重，對成熟胚發(fā)育不利。

4 結 論

綜上，糖種類及濃度顯著影響百子蓮體胚發(fā)生，蔗糖效果優(yōu)于葡萄糖和麥芽糖，其中3 %蔗糖利于體胚誘導，2 %蔗糖利于成熟胚發(fā)育。培養(yǎng)基碳源對體胚成熟發(fā)育期糖代謝、激素代謝及氧化脅迫具有顯著調節(jié)作用。淀粉與蔗糖之間的代謝平衡對百子蓮成熟胚發(fā)育具有決定作用；高濃度的IAA、GAs對成熟胚發(fā)育不利；H2O2、SOD不利于成熟胚發(fā)育。