兩種石蠟包埋腎活檢組織轉(zhuǎn)制電鏡樣品的方法比較

沈麗君，李鐸，方周溪，陳朝生

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325015

電鏡檢查在腎臟病的診斷中起著十分重要，有20%～30%的腎臟病患者需要依賴電鏡得以確診[1-3]。 然而由于標本量不足或者取材不滿意等原因，在常規(guī)電鏡標本（組織經(jīng)戊二醛和鋨酸雙重固定后，經(jīng)脫水、樹脂包埋等步驟制作的標本）不可用的情況下，需要用4%中性甲醛固定、石蠟包埋的組織轉(zhuǎn)制電鏡標本用于診斷。石蠟包埋標本轉(zhuǎn)制電鏡樣品的方法有多種[4-6]，需要在日常工作中根據(jù)所在實驗室的實際情況（如標本類型、包埋劑種類、脫水劑種類等）選擇合適的實驗方案。目前各電鏡室常用的方法是將石蠟標本脫蠟后再水化，后經(jīng)戊二醛和鋨酸雙固定后，再脫水包埋成塊。在結(jié)合多年的臨床實驗經(jīng)驗和文獻報道[7]的基礎(chǔ)上，我們改進了一種以EPON 812為包埋介質(zhì)的適合腎穿刺活檢標本石蠟塊轉(zhuǎn)制電鏡樣品的快速方法（以下簡稱快速脫蠟固定法），經(jīng)與傳統(tǒng)水化后再轉(zhuǎn)制電鏡樣品的方法（以下簡稱水化法）對比研究，發(fā)現(xiàn)快速脫蠟固定法能夠得到比水化法更高質(zhì)量的電鏡圖像，同時有效縮短樣品制備時間，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本：選取2018年5月至2019年9月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科確診的石蠟包埋塊標本共20例，其中IgA腎病6例、冷球蛋白血癥腎小球腎炎1例、狼瘡性腎炎5例、糖尿病腎病5例和腎淀粉樣變性病3例，所有患者均經(jīng)腎臟穿刺病理診斷確診。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.1.2 試劑配置：①含1%四氧化鋨的二甲苯溶液配置：1 g四氧化鋨（OSO4，TED PELLA，18456）溶于100 mL二甲苯溶液中；②包埋劑配置：選取PELCO?Eponate12試劑盒（TED PELLA，18010），參考Luft法的配方比例[8]，分別量取Resin 25.7 mL、DDSA 9.3 mL、MNA 16.5 mL，充分混勻后，加入0.8 mL DMP-30并再次混勻；③2%醋酸鈾水溶液配置：1 g醋酸鈾粉末溶于50 mL雙蒸水；④1%枸櫞酸鉛水溶液配置：0.1 g枸櫞酸鉛粉末（TED PELLA，96049）溶于5 mL雙蒸水，充分混勻后，滴加1 mol/L NaOH溶液至顆粒全部溶解且p H值約為12，加雙蒸水定容至10 m L，并用0.22 μm微孔濾器過濾，密封備用；⑤硅膠定向包埋板（北京中鏡科儀技術(shù)有限公司）；⑥被覆芳華膜的200目銅載網(wǎng)（北京中鏡科儀技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 石蠟標本取材方法：經(jīng)4%中性甲醛固定、石蠟包埋的腎穿刺標本塊在體視顯微鏡下，對照HE染色結(jié)果，在蠟塊上腎小球相應(yīng)位置用剃須刀片小心切下兩段1 mm長組織塊（見圖1）。一段用改進的快速脫蠟固定法處理，另一段采用經(jīng)脫蠟-水化法處理后再轉(zhuǎn)制電鏡樣品[9]，并將兩種轉(zhuǎn)制方法所得的結(jié)果與同一樣品的常規(guī)電鏡的結(jié)果進行比較。

圖1 腎穿組織石蠟包埋標本組織取材示意圖

1.2.2 常規(guī)電鏡[10-11]步驟：1～2 mm長新鮮組織置于含2.5%戊二醛的0.1 mol/L等滲PB緩沖溶液中，4 ℃固定4 h以上。用0.1 mol/L PB緩沖液漂洗3次，并用1% OsO4水溶液4 ℃后固定1 h，隨后用蒸餾水漂洗3次，每次5 min，緊接著用50%、70%、80%、90%、100%（2次）丙酮對組織塊進行梯度脫水，每步 10 min。隨后將組織轉(zhuǎn)至丙酮:包埋劑（體積比為1:1）的溶液中37 ℃過渡1 h，接著用丙酮:包埋劑（體積比為1:4）的溶液37 ℃過夜?jié)B透。次日，用純包埋劑浸泡組織，放置45 ℃恒溫干燥箱1h，使包埋劑充分滲透入組織內(nèi)部。并用硅膠定向包埋板進行定向包埋，包埋操作完成后置于45 ℃恒溫干燥箱3 h，后轉(zhuǎn)入65 ℃干燥箱過夜聚合。待樣品充分聚合后，對組織塊進行半薄切片，直至樣品中切到腎小球組織，隨后對該樣品進行修塊，對腎小球部位進行超薄切片，超薄切片厚度為70 nm，用被覆芳華膜的200目銅網(wǎng)撈片。超薄切片經(jīng)2%醋酸鈾和1%枸櫞酸鉛雙染色后，用日立H7500透射電鏡進行觀察，并用GATAN公司的數(shù)字化CCD成像設(shè)備對數(shù)據(jù)進行拍照采集。

1.2.3 快速脫蠟固定法：將所取的石蠟組織塊置于50 μL 1%四氧化鋨二甲苯溶液中，65 ℃恒溫干燥箱放置10 min；隨后，用牙簽將組織塊挑至100 μL 純二甲苯中，37 ℃恒溫干燥箱放置15 min，并重復(fù)此純二甲苯脫蠟步驟3次，進一步充分脫蠟。將充分脫蠟后的組織用牙簽挑至二甲苯：包埋劑比例為1:1的過渡液中，37 ℃恒溫干燥箱放置1 h。隨后轉(zhuǎn)至純包埋劑中，45 ℃恒溫干燥箱放置1 h。并用硅膠定向包埋板進行定向包埋，包埋操作完成后置于45 ℃恒溫干燥箱3 h，后轉(zhuǎn)65 ℃干燥箱過夜聚合。自樣品取材至包埋完成，共耗時18 h。待樣品充分聚合后，同常規(guī)電鏡標本一樣，對樣品進行切片、染色、觀察和圖像數(shù)據(jù)采集。

1.2.4 水化法：將所取石蠟組織塊放入500 μL二甲苯中，60 ℃恒溫干燥箱放置30 min，并重復(fù)該操作1次。隨后將組織塊置于新的100 μL二甲苯溶液 中，37 ℃恒溫干燥箱放置15 min，并重復(fù)該操作4次。將脫蠟處理完成后的組織置于500 μL二甲苯:乙醇（比例為1:1）溶液中，37 ℃恒溫干燥箱中放置5 min。隨即分別用100%、95%、80%、70%、50%、30%乙醇依次進行梯度水化，每步水化時間各5 min。

水化完成后，將組織塊置于0.1 mol/L PB緩沖液中，室溫放置10 min，隨后換新的0.1 mol/L PB緩沖液，并重復(fù)這一操作3次，將乙醇充分漂洗干凈，并用含2.5%戊二醛的0.1 mol/L PB緩沖液固定組織4 h以上。戊二醛固定后的標本，后續(xù)操作流程同常規(guī)電鏡操作。

1.3 圖像處理與評價指標 本研究所用的電鏡數(shù)字成像設(shè)備為ORIUSTMCCD camera（美國Gatan公司），圖像處理軟件為ImageJ 1.52。每一例標本用不同制樣方法所得的圖像數(shù)據(jù)間進行橫向比較，主要從以下三方面進行對比：①肉眼判斷電子致密沉積物（electron-dense deposits，ED）結(jié)構(gòu)清晰度以及沉積部位；②比較特征性超微結(jié)構(gòu)保存的完整性，如狼瘡性腎炎患者腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞基質(zhì)中的管網(wǎng)狀包涵體（tubuloreticular inclusions，Ti）和淀粉樣變腎病患者系膜基質(zhì)上的纖維絲；③用ImageJ測量基底膜平均厚度，并統(tǒng)計分析不同石蠟轉(zhuǎn)制電鏡樣品方法基底膜厚度的改變情況。每例患者常規(guī)電鏡所得標本的基底膜平均厚度與同一患者石蠟轉(zhuǎn)制標本的平均基底膜厚度的差值，除以該患者常規(guī)電鏡基底膜平均厚度用以反映石蠟轉(zhuǎn)制電鏡樣品后平均基底膜厚度的改變情況。

基底膜平均厚度測量方法：每個樣品的腎小球部位隨機選取15～20個毛細血管，每個毛細血管隨機選5個位置（應(yīng)均勻分布在毛細血管上，并避開ED的位置）測量基底膜厚度，并取其平均值作為被測毛細血管的平均基底膜厚度。將15～20個毛細血管測量的平均值作為該樣本的基底膜平均厚度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以M（P25，P75）表示。由于2種石蠟轉(zhuǎn)制法組內(nèi)均有個別數(shù)據(jù)缺失（僅見腎髓質(zhì)組織），同時考慮數(shù)據(jù)略有偏態(tài)，因此對3組相關(guān)數(shù)據(jù)采用Friedman秩和檢驗進行分析。針對組間多項兩兩比較，SPSS軟件通過Bonferroni校正法調(diào)整顯著性值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種石蠟轉(zhuǎn)制方法保存腎小球特征超微結(jié)構(gòu)的比較 幾種常見腎臟病類型的超微結(jié)構(gòu)顯示，快速脫蠟固定法和水化法對組織超微結(jié)構(gòu)的保存遠不如TEM組，表現(xiàn)在部分血管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)成分丟失以及足突形態(tài)改變，但在ED的保存方面，兩種石蠟轉(zhuǎn)制方法與常規(guī)電鏡法相差不大（見圖2A）。此外，為了更好地評價這兩種石蠟轉(zhuǎn)制電鏡樣品方法在臨床上的應(yīng)用價值，我們比較了兩種轉(zhuǎn)制方法在特殊超微結(jié)構(gòu)保存方面與常規(guī)電鏡法的差異，結(jié)果顯示這兩種方法在Ti的結(jié)構(gòu)保存方面稍顯欠缺（見圖2B）；此外水化法處理的樣品淀粉樣纖維絲結(jié)構(gòu)有不同程度的流失，快速脫蠟固定法對纖維絲的保存效果更接近常規(guī)電鏡法的效果（見圖2C）。由于腎小球毛細血管基底膜厚度及形態(tài)的改變是某些種類腎病的診斷依據(jù)，如薄基底膜腎病，但在實際應(yīng)用中我們發(fā)現(xiàn)石蠟轉(zhuǎn)制電鏡的標本都出現(xiàn)了不同程度的基底膜厚度變薄的情況（見圖2D）。

2.2 兩種石蠟轉(zhuǎn)制方法對基底膜厚度的影響比較 測量每個樣品的平均基底膜厚度，用Friedman檢驗對3組數(shù)據(jù)進行比較，3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.001）；快速脫蠟固定法和水化法與常規(guī)電鏡法比，基底膜厚度均顯著減少（P=0.043和P＜0.001）；快速脫蠟固定法與水化法比，基底膜厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.210）。見表1。

3 討論

腎活檢病理診斷過程中，電鏡診斷是非常重要的一個環(huán)節(jié)，但是有時由于取材失誤、標本不滿意（未取到腎小球結(jié)構(gòu)）等原因，需要用4%中性甲醛固定-石蠟包埋的標本轉(zhuǎn)制電鏡樣品[12-13]。本研究中，我們提出了一種經(jīng)過改進的以EPON 812為包埋介質(zhì)的快速轉(zhuǎn)制方法，并通過比較研究，以評價該方法在常規(guī)電鏡標本缺失的情況下在腎臟病臨床診斷應(yīng)用中的價值。

由于電子致密沉積物在腎臟病理診斷中具有非常重要的作用，因此我們首先對比了兩種轉(zhuǎn)制法在保存ED結(jié)構(gòu)方面的差異。與常規(guī)電鏡相比，兩種石蠟轉(zhuǎn)制方法均能使ED結(jié)構(gòu)得以較好保存，說明兩種轉(zhuǎn)制方法在臨床診斷中均有使用價值?？紤]到某些種類腎臟病的超微病理診斷除了辨別ED的沉積部位和形態(tài)外，還需要借由一些特征性的超微結(jié)構(gòu)加以確診，例如，部分狼瘡性腎炎患者的腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞基質(zhì)上的管網(wǎng)狀包涵體[12]，淀粉樣變腎病患者節(jié)段性系膜基質(zhì)上直徑8～10 nm的纖維絲等[13]，因此，我們對狼瘡性腎炎患者和淀粉樣變腎病患者的上述特征性結(jié)構(gòu)進行了對比。兩種轉(zhuǎn)制方法雖然能夠保留上述兩種特征性結(jié)構(gòu)，但其結(jié)構(gòu)完

整性破壞較大，尤其是水化法轉(zhuǎn)制的標本，淀粉樣纖維絲結(jié)構(gòu)有所損失，其原因可能由于水化法處理步驟比較多，脫蠟、水化及脫水3個步驟均涉及到有機溶劑處理，對樣品的成分抽提較快速脫蠟固定法更嚴重。不僅如此，從樣品制備時間比較，水化法耗時更久（33 h），而本研究中的快速脫蠟固定法，由于直接在二甲苯中邊脫蠟邊固定，不需要水化及脫水步驟，大大節(jié)約了樣品制備時間（18 h），在滿足樣品診斷需求的前提下，提高工作效率，縮短患者等待報告的時間。此外，通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)制方法均存在基底膜變薄的假象，提示這兩種轉(zhuǎn)制方法均不適用于需要通過測基底膜厚度進行診斷的腎病類型（如薄基底膜腎病、早期的糖尿病腎病等）[14-15]。

圖2 兩種石蠟標本轉(zhuǎn)制電鏡樣品方法與常規(guī)電鏡結(jié)果比較

表1 不同制樣方法樣品的基底膜厚度比較[每組n=11，M（P 25，P 75），nm]

綜上所述，本研究比較了兩種石蠟轉(zhuǎn)制電鏡樣品的方法，其中快速脫蠟固定法無需經(jīng)過逐級的水化、漂洗、后固定及脫水等繁瑣的步驟，可有效縮短制樣時間，且鋨酸后固定與脫蠟同步進行，使得組織結(jié)構(gòu)得到較好保存，減少人為操作對組織成分的洗脫、抽提作用。因此，在常規(guī)腎活檢組織電鏡標本無法滿足檢測的情況下，快速脫蠟固定法不失為一種更好的替代方法。