廣州市非結(jié)核分枝桿菌流行狀況與菌種分布特征：基于2018～2019年數(shù)據(jù)

陳華，胡錦興，陳品儒，鄧政先，許柳清，梁鋒

廣州市胸科醫(yī)院內(nèi)一科，廣東廣州510095

分枝桿菌屬群中，除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)和麻風(fēng)分枝桿菌外，其余分枝桿菌統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌（NTM）［1］。NTM病的發(fā)病率和流行率在全球范圍內(nèi)不斷上升。但NTM分離率及其菌種分布因不同國家和地區(qū)而異；NTM種類眾多，目前已發(fā)現(xiàn)191 種，分為13個(gè)亞種。NTM 感染以慢性肺病最為常見，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道的可引起肺部疾病的NTM 約有40余種。呼吸道分離NTM最常見的菌種以胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌和膿腫分枝桿菌為主，NTM臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特點(diǎn)與結(jié)核分枝桿菌病極為相似，但治療方案迥異，因此，把分枝桿菌準(zhǔn)確鑒定至菌種水平是診斷和治療各種分枝桿菌病的關(guān)鍵。盡管不同國家和地區(qū)的NTM傳染率差異較大，但均呈上升趨勢(shì)［2-3］。目前我國尚未有大樣本量NTM流行病學(xué)調(diào)查資料，但歷次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國NTM感染也呈明顯上升趨勢(shì)。為進(jìn)一步了解廣州地區(qū)呼吸道NTM分離率、菌種分布及其變化趨勢(shì)，本研究對(duì)2018～2019年廣州市胸科醫(yī)院臨床分離株中的NTM菌株進(jìn)行菌種鑒定，收治患者中NTM 流行情況進(jìn)行了回顧性分析，以了解廣州市NTM的菌種分布狀況，為本地區(qū)NTM病的防治提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018～2019年廣州市胸科醫(yī)院收治的疑似肺結(jié)核患者，均由結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室收集了痰液、尿液、胸腹腔積液、腦脊液和穿刺液等標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)105 918株，對(duì)上述患者進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)（BACTEC MGIT 960和改良羅氏法）檢出陽性菌株20 271株（陽性率19.1%），8907株陽性菌采用結(jié)核菌群特異性分泌蛋白MPB64免疫膠體金法進(jìn)行菌群鑒定，對(duì)MPB64檢測(cè)陰性或陽性但懷疑NTM混合生長者，使用基因芯片法進(jìn)行菌種鑒定，共鑒定出NTM 2701株（分離率30.3%），對(duì)剔除重復(fù)后的NTM 菌株在不同年度、性別、年齡、感染類型、以及NTM不同種類菌株的分布特征進(jìn)行分析。均經(jīng)PCR-熒光探針法鑒定為NTM。分枝桿菌培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室資料,其中若同一病例有多次培養(yǎng)陽性與菌種/群鑒定結(jié)果,則以1例計(jì)算。均分離自臨床患者，同一患者的多份菌株標(biāo)本按一份算。2701株NTM來自于1711例患者，1711 例NTM 分離患者中，女性NTM 感染者（n=932）多于男性（n=779），比例為1.20∶1。20歲以下及80歲以上者少見（約3.2%），多為21～80歲患者，其中41～70歲患者占60.49%（1035/1711）。發(fā)病年齡主要集中于51～70歲。鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群患者：41～70歲占71.94%（487/677）；41～80歲占84.49%；龜膿腫患者：21～60歲占69.6%(451/648)；21～70歲占88.27%（572/648）；男、女性NTM患者的分布均為51～70歲年齡組最多，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.313，P=0.189，表1）。

表1 NTM病例各年齡段菌株分布情況Tab.1 Distribution of NTM strains in different age groups

1.2 細(xì)菌、試劑與儀器

結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv由國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（微陣列基因芯片法）、基因芯片檢測(cè)平臺(tái)及配套試劑、LuxScan-10K/B微陣列芯片激光掃描儀均購自北京博奧生物；抗原檢測(cè)試劑(膠體金法)購自杭州創(chuàng)新生物；PCR擴(kuò)增儀、高速離心機(jī)購自德國Eppendorf；分枝桿菌細(xì)胞破碎儀購自上海仁度。

1.3 菌種鑒定方法

NTM菌種鑒定方法［4］：應(yīng)用BACTEC MGIT960系統(tǒng)(美國BD)進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)；應(yīng)用杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn)的“結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒”檢測(cè)培養(yǎng)菌MPT64分泌情況進(jìn)行分群：將MPT64檢測(cè)陰性者應(yīng)用成都博奧晶芯生物科技有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA微陣列芯片法）將培養(yǎng)菌鑒定至17個(gè)種或群：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌、偶然分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、草分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、金色分枝桿菌、蘇爾加-瑪爾摩分枝桿菌、蟾分枝桿菌、土分枝桿菌、恥垢分枝桿菌。具體實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按儀器與試劑說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料為偏態(tài)分布，以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間差異的比較行χ2檢驗(yàn)，組間比較行t檢驗(yàn)或方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分布

2年間，共進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)105 918例，20 271例培養(yǎng)陽性，根據(jù)MPB64膠體金法、基因芯片法和測(cè)序結(jié)果，共鑒定出8907 株分枝桿菌，2018～2019 年分別占43.59%（3883/8907）、56.41%（5024/8907）；其中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群有5877株，2701株為非結(jié)核分枝桿菌，占30.3%（表2）。

表2 各年度NTM菌種具體分離情況Tab.2 Specific isolation of NTM strains in each year

2.2 病例分布

對(duì)來自1711例患者的2701株非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了菌種或復(fù)合群鑒定，種群分布達(dá)17種，2年間按分離數(shù)量排位的順位分別為：龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群41.2%（1113/2701）、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群40.5%（1093/2701）、堪薩斯分枝桿菌6.6%（179/2701）、偶然分枝菌6.3%（169/2701）、戈登分枝桿菌2.2%（60/2701）等。龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群和鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群在各年度均為主要NTM分離菌種（表3）。

2.3 主要菌種年齡分布

3種主要NTM菌種，龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群、堪薩斯分枝桿菌，年齡分布見表4。

2.4 不同性別、年齡NTM患者的分布特征

刪除重復(fù)后例數(shù)1711例NTM菌株中經(jīng)鑒定確定的菌種有17種，鳥-胞內(nèi)分枝桿菌最多，占39.5%（676/1711），龜-膿腫分枝桿菌占37.87%（648/1711），堪薩斯分枝桿菌占7.19%（123/1711），偶然分枝桿菌占8.3%（142/1711），戈登分枝桿菌各占3.27%（56/1711），其他瑪爾摩分枝桿菌9例、蟾蜍分枝桿菌6例、淺黃分枝桿菌6例、瘰疬分枝桿菌5例、土/蘇爾加/海/草/恥垢分枝桿菌各占1例，不在檢測(cè)范圍內(nèi)無法判讀的菌株32例，占1.87%（表5）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在世界范圍內(nèi)NTM肺部疾病的發(fā)病率不斷上升，我國第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，NTM在分枝桿菌分離株中占22.9%（83/363）［5］。近期文獻(xiàn)提示NTM可能具有傳染性，且其診斷的困難性、高度耐藥性和復(fù)發(fā)性都是導(dǎo)致其危害嚴(yán)重的原因［6］，且不同菌種的NTM之間也存在誤診［7］。為進(jìn)一步分析、診治和預(yù)防結(jié)核病，NTM 菌種鑒別診斷是非常有意義的。目前，世界各地對(duì)NTM 感染無強(qiáng)制報(bào)告要求，無法準(zhǔn)確掌握某個(gè)地區(qū)的具體資料和數(shù)據(jù)。但僅根據(jù)現(xiàn)有研究看，加拿大、美國、德國和中國臺(tái)灣等地區(qū)的NTM 感染患病率或致死率均在上升，盡管不同地區(qū)NTM傳染率差異較大，但均呈上升趨勢(shì)［2,8］。目前我國尚未有基于人群大樣本量的NTM流行病學(xué)調(diào)查資料，但歷次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國NTM感染也呈明顯上升趨勢(shì)。NTM感染率和流行情況有著明顯的地區(qū)差異，且與氣候環(huán)境相關(guān)，某些地區(qū)其NTM的發(fā)病率和患病率甚至超過結(jié)核病的發(fā)病率和患病率。歐美地區(qū)多以堪薩斯分枝桿菌和蟾蜍分枝桿菌為主要分離菌種，伊朗呼吸道標(biāo)本中分離出來的最常見的NTM菌種為猿猴分枝桿菌。本研究共鑒定出18種菌群，其中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群5877株，NTM有17個(gè)種群共2701株。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群仍為主要發(fā)病類型，占66.0%，NTM占30.3%。NTM的分離率與馬品云等［9］于2016年報(bào)道的24.0%相比大幅度上升，相較于杭州市NTM分離率的25.8%、中國臺(tái)灣地區(qū)NTM發(fā)病占所有分枝桿菌發(fā)病的比率的49.8%及韓國的57.8%而言，我國NTM的感染狀況與其他亞洲地區(qū)相似。我國分離出來最多的NTM 菌種為胞內(nèi)分枝桿菌［10］，在北方可達(dá)40%～60%；而南方地區(qū)除了胞內(nèi)分枝桿菌外，膿腫分枝桿菌也占較高比例，與北方相比，南方NTM菌種更具有多樣性。

本研究NTM種群分布達(dá)17種，以龜-膿腫復(fù)合群分枝桿菌、胞內(nèi)和鳥分枝桿菌為主，是主要的致病菌，與筆者既往的研究結(jié)果相同［11-12］。NTM在不同國家或同一國家不同地區(qū)發(fā)病率和主要菌種都有差異，不同地區(qū)NTM流行菌種存在的差異與當(dāng)?shù)氐臍夂蛞蛩?、地理位置及患者個(gè)人的工作生活條件等有密切關(guān)系。近期文獻(xiàn)報(bào)道我國上海地區(qū)堪薩斯分枝桿菌的分離率較高［13］，從2008 年（55.2%）至2012 年（35.3%）均高居NTM 首位，近年來略有下降趨勢(shì)（23.88%）［14］；而2017年北京NTM病的流行病學(xué)研究結(jié)果顯示胞內(nèi)分枝桿菌的分離率高居第1位［10］；廣州地區(qū)連續(xù)多年以龜-膿腫分枝桿菌和鳥胞分枝桿菌復(fù)合群分離率最高，這均說明菌種的分布具有一定的地區(qū)特點(diǎn)。從本研究NTM的易感者看，廣州城區(qū)NTM易感人群為45歲以上，峰值在51～70歲，女性略占多數(shù)，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果［15］相同，但與其他地區(qū)報(bào)道NTM肺病男性多于女性有所不同［16］。

表3 NTM病例與性別、年齡、菌種分離率的關(guān)系Tab.3 Relationship between NTM cases and sex,age and rate of strain isolation

表4 主要NTM菌種各年齡段分布情況Tab.4 Distribution of main NTM bacteria by age

表5 不同性別、年齡NTM患者的分布特征Tab.5 Distribution characteristics of patients by sex,age NTM sex

本研究1711例NTM分離患者中，NTM分離率女性高于男性，性別比例為1.20:1，中位年齡分布：龜-膿腫48（30，61）歲與鳥-胞內(nèi)分枝桿菌60（50，67）歲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.799，P=0.000），均以女性患者占優(yōu)勢(shì)（分別為1:1.27、1:1.39）。因此中老年女性患者是廣州地區(qū)常見NTM菌種感染的易感人群。2015年有學(xué)者報(bào)道，將禽分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌、馬賽分枝桿菌、外來分枝桿菌等8種作為常見的NTM，分析表明這些可以鑒定到種的占臨床分離株的90.9%［17］。本研究顯示，呼吸道分離的4 種常見NTM 標(biāo)本占91.97%（2484/2701），分別為龜膿腫1093株（40.5%）、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌1078株（39.9%）、堪薩斯175株（6.5%）、偶發(fā)158株（5.9%），提示呼吸道特別是肺部NTM感染是目前主要的感染類型，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［1,18］。本研究鑒定出的NTM中包含了數(shù)量前4位的菌種分別為鳥-胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌，與相關(guān)研究結(jié)果一致［14,18-19］，與同處于華南地區(qū)的深圳市的結(jié)果相類似［20］。龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群好發(fā)年齡為21～30歲及51～70歲，鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群好發(fā)年齡為51～70歲，堪薩斯分枝桿菌發(fā)病年齡可分布于各年齡段，無特征性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=79.831，P=0.000）。龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群與鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群與NTM總體好發(fā)于中老年人一致；龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群除好發(fā)于中老年人，可能在21～30歲并不少見。因此，臨床上對(duì)疑似NTM患者應(yīng)盡早進(jìn)行菌種鑒定，以避免患者接受不恰當(dāng)?shù)呐R床治療。與廣州地區(qū)分離菌種存在較大差異主要有波蘭、匈牙利及克羅地亞，這些地區(qū)最常見的NTM分別是堪薩斯分枝桿菌、蟾分枝桿菌及戈登分枝桿菌［21］；這表明NTM菌種分布具有明顯的地域差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，32例48株NTM菌株未能鑒定出菌種類型，是由于目前臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)的商業(yè)化試劑盒主要有DNA芯片技術(shù)和基因探針技術(shù)，但僅能鑒定出常見的17種分枝桿菌菌種類型。因此有必要把菌種鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)--測(cè)序技術(shù)更多應(yīng)用于臨床，盡可能提高臨床診斷具體菌種的能力。

綜上所述，雖然各地市優(yōu)勢(shì)菌群和NTM的易感人群有一定差異，但是2018～2019年廣州地區(qū)NTM菌種分布達(dá)17個(gè)種，以龜膿腫分枝桿菌和鳥-胞內(nèi)分枝桿菌最多。廣州市NTM分離率高于全國平均水平，NTM患病率的居高不下和種類越來越多應(yīng)引起足夠的關(guān)注。感染人群多為中老年人，為更好地控制結(jié)核與NTM 感染。臨床醫(yī)生應(yīng)提高警惕，需要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)非結(jié)核分枝桿菌分離株流行病學(xué)的重視。