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    罕見缺失型α-珠蛋白基因突變導(dǎo)致α-地中海貧血Hb H病*

    2021-05-25 02:51:50何恩怡李樹全李汶蔚
    關(guān)鍵詞:珠蛋白基因突變中度

    何恩怡,李樹全,肖 璇,李汶蔚,陳 萍△

    (1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院地中海貧血防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530021;2.廣西地中海貧血防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530021)

    α-地中海貧血是一種單基因疾病,其分子基礎(chǔ)是位于16 號(hào)染色體(16p13.3)上的α-珠蛋白基因簇異常導(dǎo)致α-珠蛋白鏈生成減少或缺如[1]。中間型α-地中海貧血的血紅蛋白H?。℉b H?。?,是一條染色體上的HBA2和HBA1基因同時(shí)缺失以及另一條染色體上的HBA2 或HBA1 基因缺失或點(diǎn)突變,分別導(dǎo)致缺失型和非缺失型Hb H病。在中國人群中,常見的缺失型α-地中海貧血基因突變主要是東南亞缺失(--SEA)、右側(cè)缺失(-α3.7)和左側(cè)缺失(-α4.2),常見的非缺失型α-地中海貧血基因突變是Hb Constant Spring(Hb CS)、Hb Quong Sze(Hb QS)和Hb Westmead(Hb WS)[2-3]。目前報(bào)道的Hb H病大多數(shù)是由于上述這些常見的基因突變導(dǎo)致的,但也有一些罕見基因突變的Hb H病應(yīng)用常規(guī)方法未能檢測(cè),在臨床上容易漏診或誤診。本研究報(bào)道一種罕見的缺失型α-地中海貧血基因突變導(dǎo)致Hb H 病的臨床和實(shí)驗(yàn)室特征,為臨床診療和遺傳咨詢提供依據(jù)和指導(dǎo)。

    1 對(duì)象和方法

    1.1 研究對(duì)象

    選取2020 年5 月至2021 年2 月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診、經(jīng)Hb 分析確診為Hb H 病的88例患者為研究對(duì)象,其中男39例,女49例。在88例病例中檢測(cè)出3 例攜帶-α27.6缺失型突變的患者。3 例均來自廣西壯族自治區(qū),中度貧血,無肝脾腫大,無輸血史。病例1為11個(gè)月大的女嬰,病例2為44歲的女性,病例3為10歲男童。

    1.2 血常規(guī)分析

    抽取外周靜脈血2 mL,乙二胺四乙酸枸櫞酸葡萄糖抗凝,采用血細(xì)胞自動(dòng)分析儀(CELLDYN1700,雅培公司,美國)檢測(cè)紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、血紅蛋白(Hb)含量、紅細(xì)胞平均容積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血細(xì)胞比容(HCT)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)。

    1.3 Hb分析

    采用高效液相色譜儀(Hb Variant Ⅱ,伯樂公司,美國)對(duì)Hb H、Hb A2、Hb F進(jìn)行定量分析。

    1.4 DNA提取

    取500 μL 全血,采用核酸自動(dòng)提取儀(Lab-Aid 820,廈門百維信生物科技有限公司)提取DNA,按照試劑盒(Lab-Aid 820 核酸提取Midi 試劑,廈門致善生物科技股份有限公司)說明書操作。取1 μL DNA 樣本用紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000/2000CC,賽默飛公司,美國)測(cè)定DNA濃度和純度。

    1.5 α-地中海貧血基因突變分析

    1.5.1 缺失型基因突變分析 采用跨越斷裂點(diǎn)PCR(Gap-PCR)檢測(cè)α-地貧常見的4 種缺失型基因突變,包括--SEA、--α3.7、--α4.2、--THAI(缺失型α-地中海貧血基因診斷試劑盒,深圳市億立方生物技術(shù)有限公司)。PCR 擴(kuò)增:取4 μL DNA 樣本加入21 μL PCR反應(yīng)液中。PCR反應(yīng)條件:50 ℃預(yù)熱5 min,96 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性45 s,64 ℃退火90 s,72 ℃延伸3 min,共35 個(gè)循環(huán);72 ℃繼續(xù)延伸10 min(Veriti96型,賽默飛科技公司,美國)。電泳:配制1.2%的瓊脂糖凝膠,取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物加入凝膠孔,同時(shí)用5 μL 的DL2000 作為DNA Marker,在5V/cm 電壓下電泳60 min,置于凝膠成像系統(tǒng)(GeldocXR+,伯樂公司,美國)上觀察、拍照。

    1.5.2 非缺失型基因突變分析 應(yīng)用熒光PCR 熔解曲線法(FCMA)檢測(cè)α-地貧常見的3種非缺失型基因突變,包括Hb CS、Hb QS、Hb WS基因突變(非缺失型α-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒,廈門致善生物科技股份有限公司)。取n×19.8 μL PCR反應(yīng)液、n×0.2 μL酶混合液放入1.5 mL離心管中,振蕩混勻后瞬時(shí)離心,分別以每管20 μL 分裝于PCR 反應(yīng)管中,再加入5 μL DNA 樣本,混勻后放入PCR 儀。PCR 反應(yīng)程序:50 ℃UNG 酶處理2 min,95 ℃預(yù)變性10 min;降落循環(huán)程序(10 個(gè)循環(huán)),95 ℃30 s,70 ℃15 s(每個(gè)循環(huán)下降1 ℃),76 ℃20 s;PCR循環(huán)程序(50 個(gè)循環(huán)),95 ℃15 s,55 ℃15 s,76 ℃20 s。熔解曲線分析程序:95 ℃1 min,35 ℃3 min,40 ℃~85 ℃(每0.4 ℃采集通道熒光信號(hào))。

    1.5.3 α-珠蛋白基因測(cè)序 應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)未檢測(cè)出上述基因突變的樣本進(jìn)行檢測(cè)(華大基因公司),檢測(cè)結(jié)果與正常的α-珠蛋白基因序列進(jìn)行對(duì)比。

    2 結(jié)果

    2.1 血常規(guī)、血紅蛋白分析及α-地中海貧血基因突變檢測(cè)結(jié)果

    3例均表現(xiàn)為中度小細(xì)胞低色素貧血,Hb 平均值為76.8 g/L,MCV、MCH和MCHC均下降。無黃疸、肝脾腫大和輸血史。血紅蛋白分析結(jié)果顯示,3 病例均有Hb Bart’s 和Hb H,依次為Hb Bart’s 7%,Hb H 4%和Hb H 3%,見表1。

    3例病例的α-地中海貧血缺失型基因檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)有--SEA 缺失突變,未檢出其他缺失型基因突變。3例病例及對(duì)照病例的Gap-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1,3例病例的電泳結(jié)果無正常擴(kuò)增條帶。非缺失型基因檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)攜帶Hb CS、Hb QS、Hb WS基因突變。

    表1 血常規(guī)、血紅蛋白分析及基因檢測(cè)結(jié)果

    圖1 缺失型α-地中海貧血Gap-PCR檢測(cè)結(jié)果

    2.2 高通量測(cè)序結(jié)果

    高通量測(cè)序結(jié)果顯示,在3 例病例中檢測(cè)到α-珠蛋白基因簇的9 079~36 718 bp 之間缺失,缺失長度共27 640 bp(NG_000006.1:g.9079_36718del27640),包括ζ2 基因、ψζ1 基因、ψα2 基因、ψα1 基因以及α2基因,α1 基因未受影響。同時(shí),在3 例病例中均檢出--SEA缺失型突變。

    3 討論

    近年來國內(nèi)、外陸續(xù)報(bào)道一些罕見缺失型突變導(dǎo)致α+-地中海貧血,在中國人群中發(fā)現(xiàn)的有-α2.4、-α2.7、-α6.3、-α6.9、-α21.9、-α27.6等缺失型突變,國外報(bào)道的包括-α3.5、-αMAL3.5、α(α)5.3、-α7.9、-α16.6[4-6]等缺失型突變。

    上述突變中包含了α2-珠蛋白基因缺失,但未影響α1-珠蛋白基因并導(dǎo)致Hb H病的突變有-αMAL3.5(NG_000006.1:g.32745_36301del3557)、-α6.9(NG-000006.1:g.29785-36746 del6962bp)、-α21.9(NG_000006.1:g.14373_36299del21927)及-α27.6(NG_000006.1:g.9079_36718del27640)等缺失。2015 年Abdul 等[7]首次在馬來西亞華裔發(fā)現(xiàn)-αMAL3.5缺失突變,之后Zhao等[5]在廣東省一個(gè)家系中也發(fā)現(xiàn)了該突變,其復(fù)合--SEA缺失突變時(shí)導(dǎo)致Hb H病。報(bào)道的5 例Hb H 病患者中,有1 例表現(xiàn)為輕度貧血(Hb 96 g/L,MCV 51.3 fL,MCH 15.2 pg),其余均為中度貧血(Hb 79~81.2 g/L,MCV 53.2~60.6 fL,MCH 13.4~19.8 pg)。其雜合子無貧血,僅MCV、MCH 接近正常值下限。2019 年,Zhuang 等[8]報(bào)道了福建省一個(gè)家系的-α6.9缺失突變,復(fù)合--SEA缺失突變時(shí)導(dǎo)致Hb H 病,表現(xiàn)為輕度小細(xì)胞低色素貧血(Hb 111 g/L,MCV 65.8 fL,MCH 21 pg),無黃疸及肝脾腫大。2013 年,Long 等[9-10]和Pang 等[11]在廣西省欽州市發(fā)現(xiàn)-α21.9缺失突變的存在。復(fù)合--SEA缺失突變時(shí)導(dǎo)致Hb H病,有中度小細(xì)胞低色素貧血(患者1:Hb 77 g/L,MCV 49.5 fL,MCH 15.4 pg;患者2:Hb 71 g/L,MCV 44.3 fL,MCH 12.9 pg),無黃疸;其雜合子僅各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)接近正常值下限(Hb 126 g/L,MCV 84.3 fL,MCH 26.2 pg);復(fù)合-α2.4缺失突變和Hb CS 時(shí),表現(xiàn)為輕度貧血(患者1:Hb 113 g/L,MCV 67.1 fL,MCH 21.6 pg;患者2:Hb 103 g/L,MCV 74.6 fL,MCH 24.3 pg)。

    關(guān)于-α27.6缺失型突變,已有的病例均在福建省內(nèi)發(fā)現(xiàn)。Wei 等[12]首次發(fā)現(xiàn)由-α27.6缺失突變復(fù)合--SEA的Hb H 病,-α27.6缺失范圍在α-珠蛋白基因簇上的9079~36718bp 之間,并插入了6 個(gè)核苷酸(AATCCC)。缺失包括ζ2 基因、ψζ1 基因、ψα2 基因、ψα1 基因以及α2 基因,α1 基因未受影響。該患兒為中度貧血(Hb 79 g/L,MCV 54.1 fL,MCH 13.7 pg),Hb 分析顯示:Hb A21.7%,Hb F 1.9%。之后Wang等[13]報(bào)道了1例由-α27.6/--SEA導(dǎo)致的Hb H病,患者為中度貧血(Hb 83 g/L,MCV 53.2 fL,MCH 13.4 pg),92%的RBC 中發(fā)現(xiàn)了Hb H 包涵體。2018 年,Huang 等[14]報(bào)道了3 例-α27.6缺失突變復(fù)合--SEA的Hb H 病,3 例均表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素貧血,未檢測(cè)到Hb H。其中先證者1 為輕度貧血(Hb 96 g/L,MCV 51.3 fL,MCH 15.2 pg),Hb分析顯示Hb A21.5%;先證者2 為中度貧血(Hb 81.2 g/L,MCV 53.2 fL,MCH 19.8 pg),Hb 分析顯示Hb A21.6%;先證者3為中度貧血(Hb 78 g/L,MCV 60.6 fL,MCH 16.7 pg),Hb分析顯示Hb A21.5%。上述患者均無黃疸、肝脾腫大,無輸血史。上述5 例-α27.6/--SEA基因型的Hb H 病大多數(shù)為中度貧血,Hb 分析顯示Hb A2降低,但未檢出Hb H或Hb Bart’s。

    本研究檢測(cè)到3 例-α27.6缺失突變復(fù)合--SEA缺失突變的Hb H 病,均有中度貧血,與上述報(bào)道相似。但上述5 個(gè)病例中有1 例為輕度貧血,因而該類型基因突變與Hb H 病臨床貧血的輕重程度的關(guān)系有待更多的病例分析。

    本文病例均在Hb 分析中檢測(cè)出Hb Bart’s 和Hb H。Hb Bart’s 為7%,Hb H 3%~4%,符合Hb H病的Hb分析特征。Hb H病的基因突變導(dǎo)致α-珠蛋白肽鏈生成減少,多余的β-珠蛋白肽鏈聚合成四聚體(Hb H)及γ-珠蛋白肽鏈聚合成γ 四聚體(Hb Bart’s),因而在Hb 分析中可檢測(cè)到Hb H(0.8%~40%),及少量的Hb Bart’s。本類型Hb H 病檢出的難度較大,較容易漏診或誤診。

    本文首次在廣西地區(qū)發(fā)現(xiàn)-α27.6缺失突變導(dǎo)致的α-地中海貧血Hb H 病,有中度貧血,Hb 分析有Hb Bart’s 和Hb H。-α27.6缺失突變較為罕見,臨床上容易漏診。本文研究為α-地中海貧血的遺傳咨詢和臨床診療提供了依據(jù)和指導(dǎo)。

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