SP6在骨肉瘤中的表達(dá)及預(yù)后影響分析*

孫 超，海 娜，趙勁民Δ

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.再生醫(yī)學(xué)研究中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.第一臨床醫(yī)學(xué)院創(chuàng)傷手外科，南寧 530021）

關(guān)鍵字 骨肉瘤；數(shù)據(jù)挖掘；SP6；預(yù)后

骨肉瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性骨癌，在兒童和青少年中的發(fā)病率為4.4%[1]。在20 世紀(jì)70 年代之前，絕大多數(shù)骨肉瘤僅通過(guò)簡(jiǎn)單的手術(shù)切除來(lái)治療，5年生存率為10%至20%[2-3]。近代多學(xué)科多方式治療（新式輔助化療、改良手術(shù)和傳統(tǒng)輔助化療）已將5年生存率提高至約70%[3-4]。然而，在過(guò)去40年中，盡管更多的患者在臨床試驗(yàn)內(nèi)、外接受了聯(lián)合化療治療，但臨床上的生存率相較過(guò)去幾乎沒(méi)有進(jìn)一步的改善。因此，尋找敏感度和特異性更強(qiáng)的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物及生物治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。SP6屬于包含3個(gè)經(jīng)典鋅指脫氧核糖核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族（SP/XKLF Family），又被稱為KLF-14 或Epiprofin[5]?；蚨ㄎ挥谌巳旧w17q21.3-q22。目前研究發(fā)現(xiàn)SP6在核質(zhì)中通過(guò)調(diào)節(jié)RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄及一系列下游通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]。本文通過(guò)挖掘公共數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，分析SP6 在骨肉瘤疾病中的表達(dá)情況，研究SP6 在臨床病理學(xué)的特征及與骨肉瘤預(yù)后的關(guān)系，旨在尋找敏感度更高的早期指標(biāo)及探究其成為新的臨床治療靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集（1）人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（HPA，https://www.proteinatlas.org/，2021年1月27日）中以“SP6”作為關(guān)鍵詞檢索，在“Cell”的選項(xiàng)卡中提取其蛋白質(zhì)定位信息；（2）GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.proteinatlas.org/，2021 年1 月27 日）中對(duì)SP6 在各類腫瘤正常組織和癌癥組織中的表達(dá)進(jìn)行分析；（3）在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/，2021 年1 月27 日）中檢索“Osteosarcoma”，以“Series”和“Expression profiling by array”作為項(xiàng)目選擇條件，從檢索得到的數(shù)據(jù)集中挑選出一個(gè)樣本含量大于50，且具有完整隨訪時(shí)間的數(shù)據(jù)芯片，并下載相關(guān)的GSE和GPL數(shù)據(jù)，最后挑選出滿足條件的一個(gè)數(shù)據(jù)集GSE21257含完整臨床信息資料的骨肉瘤樣本47例，平臺(tái)注釋文件GPL10295。

1.2 數(shù)據(jù)篩選和處理 用R 軟件（版本3.6.3，https://www.r-project.org/）對(duì)GSE21257 進(jìn)行基因名稱注釋，注釋文件采用GPL10295；對(duì)于基因名重復(fù)的，用R 的“l(fā)imma”包求取平均值，得到一個(gè)基因芯片表達(dá)量的矩陣文件，然后用“normalizeBetweenArrays”函數(shù)對(duì)組間進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，并提取SP6的表達(dá)量。

1.3 SP6 基因在骨肉瘤中的生存情況及評(píng)估 利用R 的“survival”包繪制SP6 在骨肉瘤中生存曲線，以SP6表達(dá)量的中位數(shù)作為高表達(dá)組（n=23）和低表達(dá)組（n=24）的分界值，高、低表達(dá)組的差異顯著性用log-rank 檢驗(yàn)分析。受試者工作特征曲線（ROC曲線）具有識(shí)別SP6在骨肉瘤中的診斷價(jià)值的能力，利用R 的“survivalROC”包繪制出SP6 在骨肉瘤1年、3年和5年中的ROC曲線。

1.4 SP6 和臨床性狀與骨肉瘤的預(yù)后相關(guān)性分析 用R 的“survival”包對(duì)SP6 和臨床特征信息進(jìn)行單因素Cox和多因素Cox分析，挑選出P＜0.05的作為獨(dú)立預(yù)后的指標(biāo)，這些指標(biāo)能單獨(dú)作為預(yù)測(cè)骨肉瘤患者生存率的因素。SP6通過(guò)與這些因素之間的分層對(duì)比，可以展示SP6 在不同臨床性狀之間的差異。

1.5 差異分析 SP6 高表達(dá)組的23 個(gè)樣本與低表達(dá)組24個(gè)樣本之間的差異性通過(guò)R的“l(fā)imma”包分析，結(jié)果篩選以P＜0.05 和差異倍數(shù)對(duì)數(shù)的絕對(duì)值(|logFC|)大于1作為標(biāo)準(zhǔn)；使用R的“pheatmap”包對(duì)差異的結(jié)果進(jìn)行聚類分析，直觀顯示出高、低表組中差異基因表達(dá)量的差異情況。

1.6 差異基因的GO 和KEGG 功能富集分析 為更進(jìn)一步了解SP6 高、低表達(dá)組間差異基因的功能情況，利用R 的“org.Hs.eg.db”包對(duì)差異基因進(jìn)行基因名注釋，然后用“clusterProfiler”包進(jìn)行GO(http://www.geneontology.org)和 KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)代謝途徑的功能富集分析，富集過(guò)程中，只有同時(shí)滿足P值和FDR小于0.05才會(huì)被納入富集的結(jié)果，最后挑選出前10個(gè)進(jìn)行展示。

1.7 基因集富集分析（GSEA）利用GSEA 軟件v4.0.3(http://www.broadinstitute.org/gsea)對(duì)SP6高、低表達(dá)組進(jìn)行GSEA功能富集，以預(yù)測(cè)SP6在骨肉瘤中的機(jī)制功能。本研究使用了分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)（MSigDB，http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb）中免疫相關(guān)的兩個(gè)分子集IMMUNE_RESPONSE.gmt 和IMMUNE_SYSTEM_PROCESS.gmt 進(jìn)行富集分析，其中IMMUNE_RESPONSE.gmt 里面的基因是用GO：0006955 進(jìn)行注釋的，IMMUNE_SYSTEM_PROCESS.gmt 里面的基因是用GO：0002376 注釋的，當(dāng)FDR＜0.05，P值小于0.05，以及標(biāo)準(zhǔn)化富集得分（NES）的FDR低于0.25 時(shí)被認(rèn)為是該基因集存在顯著富集。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R 軟件（3.6.3）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行繪制生存曲線，生存曲線的比較采用Log-Rank 法，SP6 在1 年、3 年和5 年生存率患者中的診斷價(jià)值采用基于時(shí)間的ROC 曲線評(píng)估；生存資料采用單因素和多因素Cox回歸分析；等級(jí)資料采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP6 在多種腫瘤中的表達(dá)及定位 經(jīng)過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中的分析顯示，多種腫瘤中，SP6的表達(dá)在正常組織和腫瘤組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1；HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)中3 種正常細(xì)胞系（CACO-2、RT4 和U-2 OS）的免疫熒光圖提示SP6蛋白主要定位于核質(zhì)，其次為中心體和有絲分裂紡錘體，見(jiàn)圖2。

2.2 SP6 在骨肉瘤中的生存分析 經(jīng)過(guò)篩選，具有完整臨床信息（包括性別、腫瘤分期和轉(zhuǎn)移情況）的骨肉瘤樣本有47例，以SP6表達(dá)的中位數(shù)將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組；Kaplan-Meier 法繪制的生存曲線顯示，SP6 高表達(dá)組的生存率顯著低于低表達(dá)組，高表達(dá)組的中位生存期為2.25 年，低表達(dá)組為6.17 年，且Log-Rank 法比較兩組生存曲線，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006），見(jiàn)圖3A；1 年、3 年和5年生存率的ROC曲線下面積分別為0.844、0.776和0.746，見(jiàn)圖3B。

2.3 SP6 與臨床性狀聯(lián)系 單因素Cox 和多因素Cox 回歸分析顯示SP6 的表達(dá)、骨肉瘤臨床分期和腫瘤是否轉(zhuǎn)移為3個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子，見(jiàn)表1。為進(jìn)一步探討SP6 與臨床性狀的相關(guān)性，將SP6 的表達(dá)在腫瘤分期4個(gè)亞組和轉(zhuǎn)移的3個(gè)亞組中進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期與SP6的表達(dá)相關(guān)性較低，只有1期和2 期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012），見(jiàn)圖4A；而在轉(zhuǎn)移的亞組中，發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)移組的SP6 表達(dá)量與轉(zhuǎn)移組和后發(fā)轉(zhuǎn)移組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且SP6 在腫瘤轉(zhuǎn)移中表達(dá)增高，見(jiàn)圖4B。

圖1 SP6在各種腫瘤中正常組織和腫瘤組織的表達(dá)情況

圖2 CACO-2、RT4和U-2 OS細(xì)胞系SP6蛋白免疫熒光染色及SP6蛋白主要分布示意圖（HPA數(shù)據(jù)庫(kù)）

圖3 SP6高、低表達(dá)組在骨肉瘤中的總體生存率及其1年、3年和5年生存率ROC曲線

表1 SP6和臨床特征值在骨肉瘤中的預(yù)后情況

圖4 SP6在各個(gè)亞組中的表達(dá)情況

2.4 SP6 高、低表達(dá)組差異分析及功能富集 為探索高、低表達(dá)組在生物學(xué)功能上的差異，篩選出|log-FC|＞1 和P＜0.05 的差異基因，并進(jìn)行GO 和KEGG富集分析。最終通過(guò)差異分析共找到88 個(gè)滿足條件的差異基因，GO的富集結(jié)果顯示，這些基因主要富集于MHCⅡ類抗原的加工和呈遞、外源抗原的呈遞和細(xì)胞對(duì)干擾素γ 的反應(yīng)等生物功能（BP）上，其次富集于MHCⅡ類蛋白復(fù)合物、高爾基體相關(guān)囊泡膜、網(wǎng)格蛋白包被的內(nèi)吞囊泡膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)等細(xì)胞成分（CC）上，此外還富集到了分子功能（MF），如：MHCⅡ類受體活性、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、肽抗原結(jié)合等（圖5A）；KEGG 通路分析顯示，差異基因主要富集在抗原處理及呈遞、吞噬體、Th1和Th2細(xì)胞分化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等通路上（圖5B）。

2.5 GSEA 高、低組差異基因的功能富集為探究SP6 高、低表達(dá)組在整體數(shù)據(jù)集中的富集情況與差異基因的富集結(jié)果是否一致，選取兩個(gè)免疫相關(guān)的分子集進(jìn)行GSEA 分析，結(jié)果顯示GO富集和KEGG差異分析結(jié)果具有一致性，低表達(dá)組在IMMUNE_RESPONSE.gmt 和IMMUNE_SYSTEM_PROCESS.gmt的兩個(gè)分子集中且明顯富集，表明SP6 可能通過(guò)免疫反應(yīng)參與骨肉瘤的發(fā)展，見(jiàn)圖6。

圖5 SP6高低組差異基因的功能富集分析

圖6 分子集在免疫通路上的GSEA富集情況

3 討論

骨肉瘤作為骨科常見(jiàn)腫瘤，其造成患者死亡的主要原因是由于其高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性[7]，其轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜多樣，可由多種原因共同影響，其中癌細(xì)胞的增殖能力尤為重要[8]。SP6主要定位于核質(zhì)，經(jīng)由調(diào)節(jié)來(lái)自RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄及一系列下游通路，對(duì)于細(xì)胞的增殖起到重要作用。多項(xiàng)研究表明，SP6 基因在胃癌[9]、乳腺癌[10]及前列腺癌[11]中有高表達(dá)，且已作為免疫識(shí)別或治療位點(diǎn)。目前SP6基因尚未見(jiàn)有在骨肉瘤中的報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)網(wǎng)絡(luò)公開(kāi)的大量測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SP6基因與骨肉瘤的預(yù)后密切相關(guān)。提示SP6基因有成為骨肉瘤早期識(shí)別和影響判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物的潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)，SP6 對(duì)骨肉瘤患者的生存率具有明顯的影響，高表達(dá)組的生存率明顯低于低表達(dá)組且高表達(dá)組的中位生存期為2.25年，顯著低于低表達(dá)組的6.17年（P=0.006）。ROC曲線則顯示SP6的表達(dá)量在患者1年、3年和5年生存率上有很高的診斷價(jià)值。這說(shuō)明SP6的表達(dá)量與骨肉瘤患者的生存率可能存在負(fù)相關(guān)。

在獨(dú)立預(yù)后分析中，SP6的表達(dá)量、腫瘤分期和腫瘤轉(zhuǎn)移對(duì)于骨肉瘤的預(yù)后是3 個(gè)獨(dú)立因素，提示SP6 在骨肉瘤的預(yù)后分析中有重要的研究意義；在臨床亞組和SP6 的相關(guān)性分析中，發(fā)現(xiàn)SP6 與腫瘤分期相關(guān)性低，而在未轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移和后發(fā)轉(zhuǎn)移的亞組研究中，未轉(zhuǎn)移組中的SP6 表達(dá)量在轉(zhuǎn)移組和后發(fā)轉(zhuǎn)移組中有明顯差異（P＜0.05），提示SP6在骨肉瘤的轉(zhuǎn)移中可能起到一定的促進(jìn)作用。差異基因的功能富集結(jié)果顯示SP6高低表達(dá)組在免疫反應(yīng)過(guò)程中存在顯著差異，提示SP6 可能通過(guò)參與各類免疫反應(yīng)來(lái)影響骨肉瘤的發(fā)展，且GSEA 的結(jié)果顯示出了與GO 和KEGG 富集結(jié)果的一致性，免疫反應(yīng)通路都顯著富集到了SP6 低表達(dá)組上，說(shuō)明SP6 低表組免疫反應(yīng)強(qiáng)于高表達(dá)組（P＜0.05）。有研究顯示，骨肉瘤細(xì)胞控制免疫滲透細(xì)胞的招募和分化，建立有利于腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的微環(huán)境[12]，有研究表明，T 細(xì)胞在骨肉瘤組織周邊浸潤(rùn)的比例明顯高于其他肉瘤類型，且浸潤(rùn)程度與患者的生存率呈現(xiàn)出正相關(guān)趨勢(shì)[13]。Mazzocco等[14]證明了野生型SP6小鼠對(duì)腫瘤的免疫能力相比起基因修飾后的SP6/B7小鼠降低，Sartoris等[15]也證明經(jīng)B7-1編輯后的SP6小鼠對(duì)腫瘤的免疫力有所增強(qiáng)。而SP6在小鼠的骨肉瘤模型中可以誘導(dǎo)抑制性T 細(xì)胞（Ts）的產(chǎn)生[16]，從而降低免疫反應(yīng)的進(jìn)展，這可能是SP6 高表達(dá)組免疫反應(yīng)低于低表達(dá)組的原因之一。因此，SP6 在骨肉瘤的免疫進(jìn)程中的具有十分重要的意義。

綜上所述，SP6 在骨肉瘤的早期識(shí)別和預(yù)后中顯示出明顯的診斷意義，但需要更加深入的研究來(lái)展現(xiàn)SP6 表達(dá)對(duì)細(xì)胞功能的影響，并揭示其中的分子相互作用方式和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，以期尋找到敏感度、特異度更高的早期診斷指標(biāo)以及新的臨床療效更好的治療靶點(diǎn)。