鴨源性H6N6禽流感病毒對(duì)小鼠致病性研究*

李程頤，林裕貴，鐘偉娟，高靈茜，張?jiān)龇?/p>

（廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，南寧 530021）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H5N1、H7N9、H5N6 持續(xù)不斷地從禽類跨越種屬屏障感染人，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1-4]。同時(shí)，H6N6亞型AIV 在歐亞大陸的野生水禽、家養(yǎng)水禽以及陸禽廣泛流行，其宿主范圍逐漸擴(kuò)大至哺乳動(dòng)物豬[5]，病毒持續(xù)進(jìn)化是否演化為感染人的潛能仍未完全清楚。本文將分離到的鴨源性H6N6亞型AIV進(jìn)行基因測(cè)序和分析病毒基因特點(diǎn)，然后將病毒感染小鼠，觀察病毒對(duì)小鼠的致病性以及具有感染小鼠能力的病毒的分子特性，評(píng)估鴨源性H6N6 亞型AIV跨種屬傳播哺乳動(dòng)物的潛能。

1 對(duì)象和方法

1.1 病毒來源 選用從水禽鴨分離到的3株H6N6亞型 AIV，包括 A/DK/KM/1135/2019（簡(jiǎn)稱KM1135）、A/DK/GY/1774/2019（簡(jiǎn)稱GY1774）、DK/GY/6952/2019（簡(jiǎn)稱GY6952）。選擇先前已證實(shí)能感染小鼠的A/CK/ZZ/346/2014（簡(jiǎn)稱ZZ346）作為小鼠感染試驗(yàn)的陽性對(duì)照毒株。4株病毒在10 d無特定病原體的雞胚分離培養(yǎng)。血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）試驗(yàn)鑒定病毒血凝素（hemagglutinin，HA）亞型，直接測(cè)序法鑒定病毒神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）亞型。

1.2 TCID50（50% tissue culture infective dose）檢測(cè)病毒毒力 首先在96孔板接種MDCK細(xì)胞，第2天在37 ℃條件下，用10 倍系列病毒濃度吸附MDCK細(xì)胞1 h，然后吸掉病毒孵育液，Hank’s液清洗細(xì)胞一遍，每孔加入含有終濃度為2 μg/mL TPCK（tosylamido-2-phenyl ethyl chloromethyl ketone）-胰酶的病毒培養(yǎng)液DMEM，37 ℃孵育72 h,最后檢測(cè)用HA試驗(yàn)檢測(cè)病毒的滴度。根據(jù)Reed和Muench方法對(duì)病毒滴度進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算病毒的TCID50/100 mL。

1.3 基因測(cè)序和分析 RNeasy 試劑盒提取病毒RNA并逆向轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)擴(kuò)增，純化產(chǎn)物，采用Illumina 的Solexa 系統(tǒng)上機(jī)測(cè)序病毒全基因，使用全球共享流感數(shù)據(jù)庫(kù)準(zhǔn)備相關(guān)病毒數(shù)據(jù)，用Bioedit進(jìn)行序列比較和同源性分析3 株H6N6 病毒8 個(gè)基因節(jié)段氨基酸位點(diǎn)的變化，重點(diǎn)分析與受體特異性相關(guān)的HA 第224、第226、第228、第186、第190、第158、第137、第156、第263和第318位氨基酸以及與病毒復(fù)制和毒力相關(guān)的PB2 第627、第271、第701位氨基酸。

1.4 動(dòng)物和動(dòng)物感染試驗(yàn) 60 只6～8 周齡的SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有動(dòng)物鼻咽拭子接種MDCK 證實(shí)沒有流感病毒，HI檢測(cè)血清流感病毒抗體陰性。本研究獲得廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守本單位對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南。為探索H6N6AIV 在小鼠體內(nèi)的復(fù)制，通過隨機(jī)數(shù)發(fā)生器將60 只BALB/c 小鼠分為5 組（n=12），實(shí)驗(yàn)組分別接種1 株H6N6 病毒，陽性對(duì)照組接種雞源H6N6 病毒，空白對(duì)照組用PBS 代替病毒液。動(dòng)物麻醉后通過滴鼻的方式接種，每只動(dòng)物接種0.2 mL 106EID 含病毒PBS 或0.2 mL PBS。接種后14 d 內(nèi)每天記錄動(dòng)物體重、體溫、疾病癥狀。接種后1 d、3 d、5 d、7 d取動(dòng)物咽拭子，標(biāo)本在雞胚和MDCK分離培養(yǎng)病毒。接種后3 d、5 d、7 d 分別用頸椎脫臼法處死每組3 只小鼠，收集氣管、肺組織，每份組織標(biāo)本分成兩份，一份研磨、離心取上清液，雞胚和MDCK分離培養(yǎng)病毒，另一份放入10%福爾馬林溶液室溫下固定24 h，用于病理學(xué)檢查和病毒蛋白的檢測(cè)。接種后14 d，眼球采血、收集血清，HI試驗(yàn)檢測(cè)恢復(fù)期血清抗體。

1.5 病理學(xué)檢查和病毒蛋白抗原檢測(cè) 取上述麻醉安樂處死小鼠的呼吸道組織，組織固定、脫水、包埋，連續(xù)切片，切片厚度為4 μm。切片常規(guī)蘇木精－伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。免疫組化法檢測(cè)病毒蛋白抗原如前所述，高溫高壓抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗抗流感病毒核蛋白（NP）的小鼠單克隆抗體（1∶2 500），4 ℃冰箱孵育過夜，然后滴加二抗（1∶50）山羊抗鼠IgG特異性生物素復(fù)合物，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。

2 結(jié)果

2.1 基因測(cè)序和分析結(jié)果 3株病毒株HA連接位點(diǎn)為單堿性氨基酸連接點(diǎn)PQIETG/GL，屬于低致病性模式。3 株病毒株HA 的主要的受體結(jié)合位點(diǎn)224、226、228、190、137 位點(diǎn)未發(fā)生突變，仍具有與禽源受體結(jié)合的特性。3 株病毒的NA 頸區(qū)未見突變或氨基酸缺失，具水禽源性病毒的特點(diǎn)。PB1-F2關(guān)鍵位點(diǎn)66以及PA關(guān)鍵位點(diǎn)38的氨基酸未發(fā)生變化，仍表現(xiàn)出在禽類動(dòng)物復(fù)制、流行的性狀，見表1、表2。

表1 3株鴨源H6N6病毒的HA氨基酸序列

表2 3株鴨源H6N6病毒的NA、PB2、PB1-F2氨基酸序列

2.2 H6N6 亞型AIV 接種BALB/c 小鼠后病毒分離培養(yǎng)和血清抗體檢測(cè)結(jié)果 H6N6 亞型AIV 接種BALB/c 小鼠后，小鼠活動(dòng)減少、飲食減退、被毛較粗亂，體溫正常，未出現(xiàn)疾病癥狀和體重下降。在咽拭子標(biāo)本當(dāng)中，接種KM1135病毒株后，有3只（3/12）小鼠雞胚病毒分離培養(yǎng)陽性，接種GY1774毒株后有1 只小鼠陽性（1/12），接種GY6952 毒株后，所有的小鼠均未分離到病毒。在小鼠鼻甲、氣管、肺研磨液中，KM1135 病毒株接種的小鼠雞胚病毒分離培養(yǎng)陽性，以鼻甲、肺組織最為明顯；GY1774 接種的小鼠中，3只小鼠病毒分離陽性，其它動(dòng)物病毒分離陰性；GY6952 僅有1 只小鼠病毒分離陽性，其它動(dòng)物病毒分離陰性；MDCK 細(xì)胞分離結(jié)果為KM1135病毒株感染的小鼠鼻甲、氣管、肺研磨液分離培養(yǎng)病毒陽性，而GY1774 和GY6952 陰性。因此，鴨源性H6N6病毒能在小鼠復(fù)制，但不同的毒株其復(fù)制能力有差異。接種病毒后第14 天，采集BALB/c 小鼠血液樣本，HI 試驗(yàn)檢測(cè)血清中流感病毒抗體滴度，結(jié)果顯示3 株病毒恢復(fù)期血清樣本抗體陽性，見表3。

2.3 H6N6 亞型AIV 接種BALB/c 小鼠后病理變化和病毒抗原分布 H6N6 病毒接種BALB/c 小鼠后第3、第5、第7 天分別安樂處死3 只小鼠，接種GY1774 和GY6952 的小鼠未觀察到明顯的大體病變，而在接種KM1135后5 d，左肺出現(xiàn)一個(gè)1 cm2×1 cm2的輕微充血灶。顯微鏡下觀察組織切片，發(fā)現(xiàn)KM1135 和GY1774 感染小鼠的鼻甲、氣管分別出現(xiàn)不同程度的氣管黏膜充血、水腫，黏膜上皮損傷、壞死，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。而GY6952 感染小鼠的鼻甲、氣管未見明顯的病變。3株病毒接種的小鼠，小鼠肺組織顯示，同程度小血管擴(kuò)張充血、紅細(xì)胞滲出，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁和小葉間隔變寬等病理變化。

表3 H6N6病毒接種BALB/c后14 d血清抗體滴度

免疫組化檢測(cè)組織切片病毒NP蛋白，KM1135毒株感染的細(xì)胞較GY1774 和GY6952 多（圖1）。KM1135 毒株接種小鼠后3 d、5 d、7 d，大部分的小鼠的鼻甲、氣管支氣管以及肺組織流感病毒NP 蛋白陽性；GY1774接種的小鼠中，有1只鼻甲，另1只在氣管、支氣管中也能檢測(cè)出的病毒NP蛋白陽性，但在肺泡組織中未見NP 蛋白抗原表達(dá)。而GY6952 接種小鼠的鼻甲、氣管支氣管和肺組織均未檢測(cè)出NP蛋白。

圖1 免疫組化檢測(cè)H6N6病毒接種BALB/c小鼠后病毒NP蛋白

3 討論

H6亞型AIV在野生水禽和家禽廣泛流行，其宿主范圍已擴(kuò)大到哺乳動(dòng)物豬，已成為家禽、家畜地方性傳染病。分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)2016—2019 年H6N6 亞型AIV 已在家禽（鴨、雞、鵝）中流行，其中在鴨分離率最高，而家禽鴨在AIV 跨種屬屏障傳播起重要作用[6]。流感病毒HA 蛋白頭部的受體結(jié)合位點(diǎn)可特異性地識(shí)別與結(jié)合禽型SAα-2,3Gal受體和（或）人型SAα-2,6Gal受體，但不同AIV亞型受體結(jié)合特異性轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制并不完全相同。在H6病毒中，H6N1病毒的HA一些位點(diǎn)突變，如S137N、E190V、G228S突變?cè)谑共《精@得人型受體結(jié)合能力過程中起到關(guān)鍵作用[7-8]。本研究3 株H6N6 病毒的HA 受體結(jié)合位點(diǎn)137、190、228 位點(diǎn)未發(fā)生突變，仍具有與禽源受體結(jié)合的特性。NA的突變或缺失可能有利于病毒適應(yīng)新的宿主環(huán)境，從而突破宿主種間屏障[9]，Li 等[10]最近報(bào)道一些H6N6亞型AIV出現(xiàn)NA莖區(qū)氨基酸缺失，但本文所選的3 株鴨源病毒的NA 頸區(qū)未見突變或氨基酸缺失。PB2的T271K、E627K、D701N能提高多聚酶活性，有助于增強(qiáng)病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性和傳播力，但在本實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道[5,11]中均未觀察到H6N6病毒的PB2 這些位點(diǎn)替換。上述基因測(cè)序分析提示，鴨源H6N6病毒仍屬于AIV的基因特點(diǎn)，特別是其HA與AIVSAα-2,3Gal受體結(jié)合。

家鴨易于接觸流感病毒“基因庫(kù)”—野生水禽，病毒在其體內(nèi)適應(yīng)后可將病毒傳播給陸禽或哺乳動(dòng)物，因此，家鴨在流感病毒生態(tài)系統(tǒng)中起非常重要作用。那么，鴨源H6N6 病毒是否在哺乳動(dòng)物復(fù)制、感染？本研究選擇上述鴨源H6N6 亞型AIV 接種BALB/c 小鼠。結(jié)果顯示，3 株鴨源H6N6 流感病毒可感染小鼠，其中，KM1135 病毒株最為典型。KM1135 病毒株接種小鼠后其呼吸道鼻甲、氣管和肺組織分離病毒陽性，組織病理檢查顯示小鼠氣管黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落，肺組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，呼吸道鼻甲、氣管至肺泡組織細(xì)胞內(nèi)病毒NP 蛋白陽性，第14 天小鼠血清樣本抗體陽性，表明病毒能在小鼠體內(nèi)有效復(fù)制并引起感染。GY1774病毒株接種小鼠后，少數(shù)小鼠呼吸道組織研磨液病毒分離培養(yǎng)陽性，病理學(xué)顯示小鼠氣管上皮細(xì)胞壞死脫落，但是肺組織未見明顯病理改變，2 只小鼠鼻甲或氣管、細(xì)支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)病毒NP蛋白陽性，而肺組織NP 蛋白分布陰性。本研究結(jié)果表明，一些鴨源H6N6病毒可以直接跨種屬感染小鼠，與Wu等[12]報(bào)道的一些H6N6病毒無需適應(yīng)即可在小鼠有效復(fù)制的結(jié)果一致。因此，鴨源H6N6AIV 無需適應(yīng)可以直接跨種屬屏障感染哺乳動(dòng)物，甚至可能感染人。

2013 年5 月20 日，臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)全球首例人感染H6N1 禽流感病例[13]，人感染H6N1 患者病例的出現(xiàn)，表明人群中的流感病毒的不可預(yù)測(cè)性和新發(fā)病毒的潛在威脅。研究表明，引起世界性大流行的流感病毒由AIV基因片段和人(或)豬基因片段重配演變而來[14]，但重配病毒中的AIV 不一定是高致病性AIV。而且，低致病性病毒感染引起的輕度癥狀容易被忽視，使病毒傳播、適應(yīng)性改變和重配的機(jī)會(huì)增加。目前，防控流感大流行主要集中在引起人類嚴(yán)重疾病和死亡的AIVH5N1和H7N9亞型。然而，由于不可預(yù)知性和現(xiàn)有相關(guān)知識(shí)的缺陷，無法預(yù)測(cè)哪類亞型的流感病毒會(huì)導(dǎo)致下一次流感大流行，H6N6 亞型雖屬低致病性病毒，但其在禽類廣泛流行，有反復(fù)感染豬并發(fā)生變異進(jìn)而演變成傳播人的新型流感病毒的潛能。因此，本研究證實(shí)，鴨源H6N6亞型流感病毒無需適應(yīng)可跨種屬間屏障直接感染小鼠。提示必須持續(xù)、密切監(jiān)測(cè)家禽H6N6 病毒的進(jìn)化演變，以防其傳播給人。