減肥條件下生物質(zhì)炭施用對(duì)水稻田土壤細(xì)菌多樣性的影響

陳重軍，凌學(xué)林，邢龍，馮健，吳羽希，范靜，孫遠(yuǎn)博，廖方新

（1.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇蘇州 215009；2.江蘇省水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇蘇州 215009；3.昆山市巴城鎮(zhèn)農(nóng)地股份專業(yè)合作聯(lián)社，江蘇蘇州 215311）

生物質(zhì)炭是一種高度芳香化難熔多孔性固態(tài)物質(zhì)，主要是由植物或動(dòng)物生物質(zhì)在300～700 ℃低溫條件下熱解炭化形成[1]，研究已證明生物質(zhì)炭施入土壤具有增加土壤碳庫儲(chǔ)量、改良土壤、提高土壤肥力、促進(jìn)作物增產(chǎn)和維持土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡等作用[2]。同時(shí)，生物質(zhì)炭的高度穩(wěn)定性、經(jīng)濟(jì)性、固碳減排和對(duì)氮磷養(yǎng)分的專性吸附與持留特性，成為改良土壤和減少氮磷流失的重要材料之一[3-4]。

施入生物質(zhì)炭會(huì)改變土壤主要功能菌的群落結(jié)構(gòu)和豐度[5]。在晚稻生長期，廢棄物施加可以促進(jìn)細(xì)菌群落多樣性的提升，生物質(zhì)炭處理組比對(duì)照組的細(xì)菌多樣性指數(shù)提高了2.55%[6]。生物質(zhì)炭含有較高含量的碳，能夠作為一些微生物生存的碳源，促進(jìn)特定微生物的生長繁殖[7]。生物質(zhì)炭施入農(nóng)田土壤后放線菌門、酸桿菌門和疣微菌門的相對(duì)豐度升高[8]。生物質(zhì)炭通過降低水稻土壤氨氮含量，改變了反硝化過程功能基因nirK和nosZ的含量，而narG基因群落結(jié)構(gòu)的變化影響了土壤N2O 排放，進(jìn)而影響整個(gè)土壤氮循環(huán)[9]。蓋霞普等[10]研究表明，生物質(zhì)炭的輸入降低了土壤中各微生物類群磷脂脂肪酸（PLFA）含量，但在各處理間差異不明顯，表明其對(duì)土壤微生物多樣性影響不顯著。施用生物質(zhì)炭和炭基肥對(duì)土壤微生物群落的影響不同，施用生物質(zhì)炭有利于細(xì)菌群落的繁殖，而施用炭基肥有利于土壤真菌/細(xì)菌比和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的提升[11]。同時(shí)，趙長江等[12]研究表明，減肥條件下配施生物質(zhì)炭可以顯著提升作物的產(chǎn)量，提高肥料利用率。然而，不同肥料減量及配施生物質(zhì)炭對(duì)水稻田非根際/根際土壤微生物多樣性的影響研究還較少，本研究旨在探索在肥料不同減量施用下，水稻秸稈生物質(zhì)炭施用對(duì)水稻田土壤細(xì)菌多樣性的影響，為生物質(zhì)炭改良水稻土微生物群落結(jié)構(gòu)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

研究試驗(yàn)地位于江蘇省蘇州市昆山某農(nóng)業(yè)合作社內(nèi)，地處東經(jīng)120°53′38″、北緯31°29′18″，屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，氣候溫和濕潤，四季分明，光照充足，雨量充沛，年平均氣溫17.6 ℃，年平均降水量1 200.4 mm，年平均日照時(shí)間1 789.2 h。試驗(yàn)地是該合作社典型的水稻田，長期種植單季水稻。生物質(zhì)炭產(chǎn)自勤豐眾成生物質(zhì)新材料（南京）有限公司，采用滾筒式炭化爐，在450～500 ℃下炭化水稻秸稈1.5 h 制備而成。生物質(zhì)炭基本理化性質(zhì)：pH 值10.2，比表面積31.68 m2·g-1，電導(dǎo)率0.181 S·m-1。供試土壤的基本理化性質(zhì)：pH 值5.5，堿解氮126.5 mg·kg-1，有效磷31.93 mg·kg-1，速效鉀257.34 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)在長期種植單季水稻的種植區(qū)開展，新設(shè)試驗(yàn)小區(qū)面積為30 m2（5 m×6 m），設(shè)置4個(gè)處理：①施肥100%+不添加生物質(zhì)炭；②施肥100%+生物質(zhì)炭1%；③施肥90%+生物質(zhì)炭1%；④施肥80%+生物質(zhì)炭1%，每個(gè)處理3次重復(fù)，共計(jì)12個(gè)小區(qū)。施肥100%代表采用稻田常規(guī)施肥，施肥分為兩次：基肥復(fù)合肥每667 m2施用40 kg，在水稻種植前5 d施入；追肥尿素每667 m2施用7.5 kg，水稻種植后8 d施入。其中復(fù)合肥購自無錫市太平洋化肥有限公司，總養(yǎng)分N+P2O5+K2O≥45%，N、P2O5和K2O 的含量分別≥19%、9%和17%；尿素購自安徽昊源化工集團(tuán)有限公司，總氮≥46%，粒度范圍1.18～3.35 mm。減肥處理中，基肥和追肥均按照比例減少。生物質(zhì)炭添加量為2.25 kg·m-2（土壤質(zhì)量的1%），在水稻種植前，翻耕過程中加入生物質(zhì)炭，與初始土壤充分混合。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)開展時(shí)間為2019年6—10月，于當(dāng)季水稻種植前后對(duì)土壤進(jìn)行采樣。水稻種植前初始土壤為水稻田翻耕前土壤，水稻種植后非根際土壤和根際土為水稻收割當(dāng)日水稻田土壤。初始土壤和非根際土壤均采自0～20 cm土層，分別采集3個(gè)，混合均勻后作為土壤樣品；隨機(jī)選取水稻3 株，采用抖落法收集水稻根際土壤，將3 株水稻的根際土壤收集后混勻，作為根際土壤樣品。各處理土壤樣品標(biāo)記見表1。樣品采集后放置于帶有冰袋的保溫箱，并及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃冰箱。

表1 各處理土壤樣品標(biāo)記Table 1 Label table of soil samples for each treatment

1.4 MiSeq高通量測序分析方法

土壤樣品總DNA 的提取采用FastPrep DNA 提取試劑盒法，并采用16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)通用引物338F（5′-ACTCCTRCGGGAGGCAGCAG-3′），806R（5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，后續(xù)MiSeq文庫構(gòu)建、MiSeq測序、序列拼接及OTU分類均由上海派森諾生物科技有限公司完成[13-14]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 20.0 分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA，置信水平95%）和LSD-t檢驗(yàn)（α=0.05）。典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）是由對(duì)應(yīng)分析相互平均（CA/RA）修改而產(chǎn)生的新方法，將CA/RA和多元回歸結(jié)合，每一步計(jì)算結(jié)果都與環(huán)境因子進(jìn)行回歸，可以詳細(xì)分析研究對(duì)象與環(huán)境之間的關(guān)系，該方法能夠結(jié)合多個(gè)環(huán)境因子分析，較好地反映研究對(duì)象與環(huán)境之間的關(guān)系[15]。本研究采用CCA 對(duì)水稻田土壤微生物群落組成和環(huán)境因子（采樣位置、肥料添加、生物質(zhì)炭添加等）之間的關(guān)系進(jìn)行分析，利用國際通用標(biāo)準(zhǔn)分析軟件Canoco 4.5，將環(huán)境數(shù)據(jù)和微生物數(shù)據(jù)按lg（x+1）進(jìn)行處理后排序分析，并得到環(huán)境因子間的相關(guān)性[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 各處理土壤細(xì)菌豐度及多樣性分析

從圖1可以看出，各處理土壤微生物樣品OTU 數(shù)存在差異，在62 772～77 795 之間波動(dòng)，但差異不顯著（P＞0.05）。從OTU數(shù)量來看，添加生物質(zhì)炭E2、E3和E4 處理OTU 低于未添加生物質(zhì)炭的E1 處理，但在根際土壤中，添加生物質(zhì)炭后OTU 總體數(shù)量增多。本研究采用Chao、Shannon、Simpson 指數(shù)表征各處理土壤樣品的細(xì)菌群落和物種的豐富度。豐富度指數(shù)Chao 指數(shù)可以用來估算土壤微生物群落中含OTU 的數(shù)目，在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)，其數(shù)值越大代表物種總數(shù)越多[17]。從物種的豐富度來看，E2 和E4 處理非根際土壤的Chao 指數(shù)與水稻田初始土壤OS接近，未種植水稻土壤OS的Chao指數(shù)明顯高于其他非根際土處理，表明水稻種植后細(xì)菌多樣性總體上呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。但在種植后根際土壤中，Chao指數(shù)明顯高于非根際土處理以及OS，表明水稻根際為微生物生長提供了良好的生長環(huán)境。E3（肥料90%）和E4（肥料80%）處理間存在顯著差異，表明非根際土中，減施會(huì)造成細(xì)菌多樣性顯著差異；而ER2和ER1處理之間存在顯著性差異，說明肥料不減施情況下，施用生物質(zhì)炭會(huì)造成土壤微生物差異顯著。而Shannon 指數(shù)反映了基于物種數(shù)量的群落種類多樣性，其指數(shù)越大，表明土壤中群落的復(fù)雜程度越高[18]，未種植水稻土壤OS 的Shannon 指數(shù)高于其他處理。非根際土壤之間，僅E1與E4處理間存在顯著差異（P＜0.05）；而根際土壤之間，不管是生物質(zhì)炭添加還是減肥處理，差異均不顯著。Simpson 指數(shù)體現(xiàn)了優(yōu)勢物種生物量占群落生物總量的比例，該指數(shù)越大表明優(yōu)勢菌群生物量占總生物量比例越大，反之則優(yōu)勢菌群生物量占總生物量比例越小。從圖1 可以看出，Simpson 指數(shù)在各處理之間變化較小，僅在非根際土壤中，未添加生物質(zhì)炭的E1 處理與添加生物質(zhì)炭的E2、E3、E4 處理間存在顯著性差異，而根際土壤中各處理差異不顯著，表明在各土壤樣品中優(yōu)勢種群變化不大。

圖1 各土壤樣品細(xì)菌豐度變化情況Figure 1 Richness and diversity indexes of microbial communities in the soil samples

2.2 土壤細(xì)菌在門分類層面的分布規(guī)律

從圖2 可以看出，各處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性較為豐富，從門水平來看，按照豐富度排列主要存在變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠曲撓菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria）、匿桿菌門（Latescibacteria）、硝棘菌門（Nitrospinae）、浮霉菌門（Planctomycetes）等門類，這12 類菌占總細(xì)菌的81.58%～91.86%。其中變形菌門占比最高，為34.85%～47.57%，酸桿菌門次之，占10.48%～19.42%。由此可見，變形菌門與酸桿菌門在水稻土壤微生物中具有重要地位。本研究中非根際土變形菌門變化較大，E1處理中變形菌門占比最高，為47.57%，而E2 處理占比最小，為36.94%，且E1 和E2 處理間存在顯著性差異（P＜0.05）。而減施處理E3 和E4 比初始土壤OS（40.37%）略有升高，分別為42.11%和41.34%，差異不顯著（P＞0.05）。而在水稻根際土壤中，ER2 處理占比最高，為42.18%，表明生物質(zhì)炭可以促進(jìn)變形菌門在水稻根際土中的富集，而肥料減施明顯降低了變形菌門的占比，處理間僅ER2 與ER4 存在顯著性差異（P＜0.05）。酸桿菌門與變形菌門變化趨勢相反，在非根際土樣品中，E2 處理最高，為13.45%，各處理間差異不顯著（P＞0.05），而在根際土中，ER2占比最低，僅11.50%，但減肥處理ER4 占比最高，為19.42%，且ER2 和ER4 處理間差異顯著（P＜0.05）。陳慶榮等[19]研究了施用煙稈生物黑炭對(duì)紅壤性稻田根際土壤微生物的影響，同樣發(fā)現(xiàn)變形菌門和酸桿菌門占比最高，為33.96%～43.37%和18.93%～28.81%，而且發(fā)現(xiàn)施用生物黑炭后，變形菌門占比增大而酸桿菌門占比減小。王晶等[20]研究發(fā)現(xiàn)，秸稈炭化還田處理會(huì)促進(jìn)酸桿菌門等相對(duì)豐度顯著增加。排在第3 位的是綠曲撓菌門，其作用是固碳，將CO2固定為最終產(chǎn)物丙酮酸。在各處理中，E1處理與其他處理間均存在顯著性差異（P＜0.05，E3 處理除外）。而第4類檢測到較多的微生物是放線菌門，其能夠降解復(fù)雜的木質(zhì)素與纖維素，為土壤提供養(yǎng)分[21]。在非根際土中，添加生物質(zhì)炭的處理E2、E3、E4與未添加生物質(zhì)炭的E1處理間存在顯著差異，且添加生物質(zhì)炭明顯提升了放線菌門的占比，從5.32%升至10.77%～13.60%；在根際土中變化趨勢類似，添加生物質(zhì)炭會(huì)提高放線菌門在根際土中的豐度。

圖2 各處理土壤樣品中4種主要細(xì)菌分類（門）的群落組成相對(duì)百分比Figure 2 Taxonomic classification of the four main bacterial communities in the soil samples at the phylum level

其他8類占比相對(duì)較低的微生物豐度見表2。肥料中主要是氮磷鉀等元素，其中氮素在土壤營養(yǎng)元素吸收和轉(zhuǎn)化中具有重要作用。本研究涉及到氮轉(zhuǎn)化功能的微生物有變形菌門、硝化螺旋菌門和浮霉菌門3 種。除了變形菌門，硝化螺旋菌門占比在1.64%～3.91%之間，不管是在土壤還是根際土壤中，硝化螺旋菌門在未添加生物質(zhì)炭的處理中較高，而添加生物質(zhì)炭降低了硝化螺旋菌門微生物的豐度。硝化螺旋菌門是一類革蘭氏陰性細(xì)菌，常在土壤中被檢測到，其中的硝化螺旋菌屬（Nitrospira）是硝化細(xì)菌，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，促進(jìn)土壤氮素的轉(zhuǎn)化[22]。也就是說，生物質(zhì)炭添加可以促進(jìn)水稻對(duì)土壤氮素的轉(zhuǎn)化和吸收。而浮霉菌門也是重要的氮轉(zhuǎn)化微生物，占比為0.15%～0.66%，自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)中厭氧氨氧化菌屬于浮霉菌門，厭氧氨氧化菌可以將氨氮和亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)?，在環(huán)境氮轉(zhuǎn)化特別是極端環(huán)境氮轉(zhuǎn)化中具有重要作用[23]。浮霉菌門微生物在E2 處理中占比最低，而在ER2處理中占比最高。

表2 各處理土壤樣品中其他細(xì)菌分類（門）的群落組成相對(duì)百分比（%）Table 2 Taxonomic classification of the others bacterial communities in the soil samples at the phylum level（%）

2.3 土壤細(xì)菌在屬和種分類層面的分布規(guī)律

從微生物屬水平來看，能夠鑒定到屬且豐度在0.5%以上的微生物共計(jì)15 種，占總細(xì)菌比例的19.49%～27.14%。本研究選取占比較高的4種微生物分析了其在各根際/非根際土壤中的占比，見圖3。其中UnclassifiedBurkholderiaceae屬占比最高，在2.51%～4.14%之間，屬于變形菌門伯克氏菌科（Burkholderiaceae），常在土壤中被檢測到[24]。UnclassifiedBurkholderiaceae屬微生物被證明與種植植物的枯死病有關(guān)。Mendes等[25]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤中的微生物伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae）、假單胞菌科（Psedudomonadaceae）和放線菌乳桿菌科（Lactobacillaceae）的相對(duì)比例增加到一定程度時(shí)，病原菌立枯絲核菌所引起的甜菜枯死病能夠得到有效控制，降低甜菜枯死病的發(fā)生。Un-classifiedBurkholderiaceae屬微生物在OS 土壤中豐度較高，占3.68%，而種植水稻后豐度總體有所下降。在非根際土壤中，添加生物質(zhì)炭促進(jìn)了該屬微生物的生長，從E1 處理的2.99%增至3.30%～4.14%，E4 處理最高，但添加生物質(zhì)炭后影響并不顯著（P＞0.05）；而在根際土壤樣品中該屬微生物豐度低于非根際土壤，但變化趨勢一致，生物質(zhì)炭添加豐度從2.51%增至2.66%～3.44%，影響也不顯著（P＞0.05）。

而從UnclassifiedSubgroup6、UnclassifiedBacterium126 來看，根際土壤處理豐度高于非根際土壤，與UnclassifiedBurkholderiaceae屬變化趨勢相反（圖3）。從非根際土壤來看，兩者豐度均隨著生物質(zhì)炭添加而增加，在E2處理中最高，分別為2.22%和2.06%，且肥料減量后豐度下降，但影響不顯著（P＞0.05）；而根際土中ER2處理豐度均最低，隨著肥料減施，豐度升高，施用80%肥料的ER4 處理與施肥100%的ER2 處理間差異顯著（P＜0.05）。而從Geobacter屬來看，水稻種植處理明顯提升了Geobacter屬的豐度，且在非根際土壤中，生物質(zhì)炭處理提升了該屬微生物豐度，從2.34%升至2.83%～3.78%，肥料減施提升了Geobacter屬的豐度，但各處理間差異不顯著（P＞0.05）；從根際土來看，ER2 處理占比最高，為2.17%，肥料減施降低了Geobacter屬在根際土中的豐度。李堅(jiān)等[26]研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)電生物質(zhì)炭作為導(dǎo)電通道，可以促進(jìn)Geobacter與其他菌共培養(yǎng)體系互營產(chǎn)甲烷，從而促進(jìn)Geobacter屬的豐度。

圖3 各處理土壤樣品中主要細(xì)菌分類（屬）的群落組成相對(duì)百分比Figure 3 Taxonomic classification of the main bacterial communities in the soil samples at the genus level

2.4 環(huán)境條件與微生物群落之間的相關(guān)性

典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）常用于評(píng)估環(huán)境條件對(duì)土壤及根際土壤中微生物群落動(dòng)態(tài)的影響。CCA 的結(jié)果揭示了環(huán)境參數(shù)與土壤微生物群落之間的相關(guān)性，如圖4 所示。從門的水平來看，變形菌門（Proteobacteria）與肥料添加呈正相關(guān)，而與生物質(zhì)炭添加、采樣位置呈負(fù)相關(guān)，酸桿菌門（Acidobacteria）與肥料添加呈負(fù)相關(guān)，與采樣位置呈正相關(guān)，但與生物質(zhì)炭添加的相關(guān)性不明顯，這與陳慶榮等[19]的研究一致。水稻秸稈生物質(zhì)炭pH 達(dá)10.2，施入農(nóng)田會(huì)提升土壤pH值，而研究發(fā)現(xiàn)土壤中酸桿菌門的豐度與土壤pH 呈顯著負(fù)相關(guān)[27]，也就是說加入生物質(zhì)炭會(huì)降低土壤中酸桿菌門的豐度；也有研究表明，加入生物質(zhì)炭使紅壤剖面酸桿菌門豐度與pH值的相關(guān)性不明顯[28]。

圖4 不同環(huán)境參數(shù)與菌群的典范對(duì)應(yīng)分析結(jié)果Figure 4 Canonical correspondence analysis of different environmental parameters and bacterial community

從屬的水平看，UnclassifiedBurkholderiaceae與生物質(zhì)炭添加呈正相關(guān)，而與采樣位置呈負(fù)相關(guān)，與肥料添加相關(guān)性不顯著。UnclassifiedSubgroup6、UnclassifiedBacterium126 與肥料添加呈負(fù)相關(guān)，與采樣位置呈正相關(guān)，而與生物質(zhì)炭添加相關(guān)性不顯著。研究發(fā)現(xiàn)Subgroup6相對(duì)豐度與養(yǎng)分有效性呈顯著正相關(guān)，而與土壤某些（與酸度有關(guān)）化學(xué)性質(zhì)呈負(fù)相關(guān)[29]。本研究水稻秸稈添加改變了土壤酸度，但Subgroup6與生物質(zhì)炭添加相關(guān)性不顯著，具體原因還有待進(jìn)一步分析。

3 結(jié)論

（1）減肥施用條件下生物質(zhì)炭添加對(duì)水稻非根際和根際土壤細(xì)菌多樣性造成影響，與非根際土相比，水稻根際細(xì)菌多樣性更加豐富。

（2）水稻土壤微生物中變形菌門和酸桿菌門占主導(dǎo)，分別為34.85%～47.57%和10.48%～19.42%。生物質(zhì)炭添加降低了變形菌門在非根際土的豐度，而促進(jìn)其在根際土中富集，而肥料減施對(duì)變形菌門豐度的影響則相反；酸桿菌門變化趨勢與變形菌門相反。UnclassifiedBurkholderiaceae，UnclassifiedSubgroup6、UnclassifiedBacterium126 等菌屬在水稻田土壤占比較高。

（3）典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）結(jié)果表明，水稻田土壤微生物細(xì)菌多樣性與采樣位置、肥料添加、生物質(zhì)炭添加等環(huán)境因素存在一定的相關(guān)性。