乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵降低菜籽粕硫代葡萄糖苷的研究

朱曉峰,張楨,丁立人,李東穎,毛嘉妮,杭蘇琴

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)類國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,江蘇 南京 210095)

菜籽粕(rapeseed meal,RSM)是油菜籽榨油之后的副產(chǎn)品,其粗蛋白含量(32%～40%)較高,氨基酸組成平衡[1],碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)豐富[2],是一種極具開發(fā)價(jià)值的飼料資源。然而,由于硫代葡萄糖苷(glucosinolate,又稱硫苷,菜籽粕中含量為125～207 μmol·g-1)、粗纖維和植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在,降低了菜籽粕的營養(yǎng)價(jià)值,極大地限制了菜籽粕在畜禽飼料中的應(yīng)用[3-4]。常見的脫毒方法包括熱處理法、機(jī)械破碎法等,但這些方法脫毒效果有限,成本較高,還會(huì)造成營養(yǎng)物質(zhì)流失[5]。微生物發(fā)酵菜籽粕能有效降低其抗?fàn)I養(yǎng)因子,提高其營養(yǎng)價(jià)值,用于豬飼料能夠改善生長豬的肉品質(zhì),提高生長性能[6-7]。乳酸桿菌能產(chǎn)生乳酸,抑制病原菌生長,常用于飼料發(fā)酵[8]。據(jù)報(bào)道,植物乳桿菌發(fā)酵能夠降解豆粕中難以消化的寡糖和大豆球蛋白等抗?fàn)I養(yǎng)因子[9];唾液乳桿菌和植物乳桿菌已證明能分別降低菜籽粕和芥蘭中硫代葡萄糖苷含量[8,10];羅伊氏乳桿菌、約氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌等能提高飼料的營養(yǎng)物質(zhì)利用率[11]。由于不同菌株所分泌的硫苷降解酶不同,復(fù)合乳酸桿菌發(fā)酵對硫苷的降解比單一菌株更具優(yōu)勢[12]。因此,利用復(fù)合乳酸桿菌制劑對菜籽粕進(jìn)行發(fā)酵,能夠有效降低菜籽粕硫苷含量,提高其在畜禽飼料中的應(yīng)用潛力。

影響發(fā)酵效率的因素較多,如底物組成、發(fā)酵時(shí)間、接種量和料水比等[5]。由于菌株的特異性,不同菌株發(fā)揮作用所需條件不盡相同,傳統(tǒng)發(fā)酵條件優(yōu)化每次只涉及單個(gè)變量,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以評價(jià)一組可控的試驗(yàn)因素與觀測變量之間的關(guān)系,優(yōu)化試驗(yàn)條件,已成功應(yīng)用于發(fā)酵條件的研究[13]。

本試驗(yàn)的目的是研究復(fù)合乳酸桿菌發(fā)酵劑(羅伊氏乳桿菌L45、植物乳桿菌L47和約氏乳桿菌L63)在菜籽粕中的生長情況;通過正交試驗(yàn),優(yōu)化乳酸桿菌發(fā)酵菜籽粕的條件,評價(jià)固態(tài)發(fā)酵對菜籽粕營養(yǎng)成分及硫代葡萄糖苷含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料菜籽(Brassicanapus,甘藍(lán)型油菜籽)粕、麩皮均由江蘇海普瑞飼料有限公司提供,粉碎過380 μm篩備用。

1.1.2 試驗(yàn)菌種羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)L45 、植物乳桿菌(L.plantarum)L47和約氏乳桿菌(L.johnsonii)L63均由本課題組分離自健康豬的胃腸道。3株菌均可在體外快速生長,且具有良好的產(chǎn)酸特性以及抗逆性[14]。其中L47能夠耐受pH2.5的酸性環(huán)境和0.5%的膽鹽環(huán)境[15]。所有菌種于含20%甘油的MRS培養(yǎng)基(乳酸菌選擇性培養(yǎng)基)中-20 ℃冷凍保存。

1.2 乳酸桿菌在菜籽粕中的生長特性和對可溶性碳、氮源的利用

將3株乳酸桿菌分別在MRS培養(yǎng)基中37 ℃活化24 h,離心后將各菌株重懸于無菌水中,等比例混合,制備乳酸桿菌接種液。試驗(yàn)共分為2組:1)處理組:將30 g菜籽粕、30 mL水加入160 mL發(fā)酵瓶中,混勻后121 ℃高壓滅菌15 min,作為菜籽粕培養(yǎng)基。將乳酸桿菌接種液以0.5 mL·kg-1(108CFU·mL-1)的接種量接種至菜籽粕培養(yǎng)基中;2)對照組:以60 mL MRS培養(yǎng)基替代菜籽粕培養(yǎng)基。接種后的菜籽粕于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h,分別于0、6、12、18、24和48 h取樣并檢測產(chǎn)氣量的變化。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè) 3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后置于2～8 ℃冰盒上,檢測培養(yǎng)基上清液中乳酸桿菌活菌數(shù)、pH值和乳酸、可溶性還原糖和游離氨基氮含量。

1.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化菜籽粕發(fā)酵條件

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)對菜籽粕硫苷降解率影響較大的4個(gè)因素為:麩皮添加量、料水比、接種量和發(fā)酵時(shí)間。各因素選取3個(gè)水平(表1),利用SPSS 22.0軟件設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),優(yōu)化乳酸桿菌發(fā)酵菜籽粕的條件。利用最優(yōu)發(fā)酵條件,驗(yàn)證發(fā)酵對菜籽粕營養(yǎng)物質(zhì)的影響。試驗(yàn)共分為3組:1)發(fā)酵組:利用優(yōu)化后的條件進(jìn)行發(fā)酵;2)對照組:為了消除高壓滅菌(121 ℃,15 min)對菜籽粕的影響,以等量的無菌生理鹽水替代乳酸桿菌發(fā)酵液;3)空白組:菜籽粕原料,未經(jīng)任何處理。每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)束后檢測菜籽粕的營養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量。

表1 正交發(fā)酵試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal fermentation experiment

1.4 測定方法

1.4.1 乳酸桿菌發(fā)酵特性測定乳酸含量使用乳酸試劑盒(南京建成生物試劑公司)測定;用pH檢測儀測定pH值;參考Theodorou等[16]的方法,使用氣壓轉(zhuǎn)換器(ANKOM RFS型,上海瑞望儀器設(shè)備有限公司)測定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量,再將不同時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量進(jìn)行累加,得到累計(jì)產(chǎn)氣量(mL);稀釋涂布平板法檢測乳酸桿菌活菌數(shù)[17],結(jié)果以lg[c/(CFU·g-1)]或者lg[c/(CFU·mL-1)]表示。

1.4.2 可溶性還原糖和游離氨基氮含量的測定將1 g菜籽粕與9 mL去離子水于均質(zhì)器中混勻5 min,7 000 r·min-1離心10 min,取上清液進(jìn)行檢測。使用二硝基水楊酸法檢測可溶性還原糖含量[18]。DNS試劑配方如下:10 g 3,5-硝基水楊酸、16 g NaOH和300 g酒石酸鈉鉀溶解后定容至1 L。將3 mL DNS試劑與1 mL樣品混合后沸水加熱5 min,然后加入去離子水至25 mL,冷卻后用分光光度計(jì)測量540 nm處吸光值(A540)。參考Abernathy等[19]的方法,使用茚三酮法檢測游離氨基氮(free amino nitrogen,FAN)。

1.4.3 菜籽粕營養(yǎng)成分及抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的測定使用凱氏定氮法檢測粗蛋白含量[20];參考Ovissipour等[21]的方法檢測樣品中三氯乙酸可溶性蛋白(trichloroacetic acid soluble protein,TCA-SP)含量;粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量使用濾袋法進(jìn)行測定[22];采用氯化鈀法測定硫苷含量[23];參考Nair等[24]的方法檢測植酸含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸桿菌在菜籽粕中的發(fā)酵特性

如圖1所示:在菜籽粕和MRS培養(yǎng)基中,乳酸桿菌0～24 h的生長曲線相似,在0～12 h呈指數(shù)生長,在24 h前達(dá)到生長平臺(tái)期。在2種培養(yǎng)基中,0～24 h的乳酸含量相似,但在48 h時(shí),菜籽粕中的乳酸含量顯著高于MRS(P<0.05),這與乳酸桿菌活菌數(shù)結(jié)果一致。開始發(fā)酵時(shí),MRS中的pH值在48 h時(shí)降至4.06;而菜籽粕中pH值降低速度較為平緩,在48 h時(shí)降低至5.03,顯著高于MRS(P<0.05)。乳酸桿菌在發(fā)酵菜籽粕中的累積產(chǎn)氣量持續(xù)升高,而在MRS中無明顯產(chǎn)氣,說明乳酸桿菌在2種底物中發(fā)酵的代謝產(chǎn)物不同。

圖1 乳酸桿菌在MRS培養(yǎng)基和菜籽粕中發(fā)酵的有效活菌數(shù)、乳酸、pH值和累積產(chǎn)氣量Fig.1 Viable count of Lactobacillus,lactic acid,pH value and cumulative gas production of MRS medium and rapeseed meal(RSM)fermented by Lactobacillus*表示兩組間在同一時(shí)間點(diǎn)時(shí)具有顯著差異(P<0.05)。下同。* means significant difference between the two groups at the same time point(P<0.05). The same as follows.

2.2 乳酸桿菌對菜籽粕中碳源和氮源的利用

在0～18 h時(shí),可溶性還原糖含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而降低(圖2-A),而游離氨基氮(FAN)含量則在12 h后才開始下降(圖2-B),說明乳酸桿菌在MRS中發(fā)酵時(shí)優(yōu)先利用碳源,再利用氮源;與MRS培養(yǎng)基相比,菜籽粕培養(yǎng)基中初始可溶性還原糖和游離氨基氮含量較低(P<0.05),雖然菜籽粕中可溶性還原糖含量在發(fā)酵時(shí)顯著降低(P<0.05),但降低幅度較小;與24 h相比,2種培養(yǎng)基中游離氨基氮含量在48 h均出現(xiàn)略微升高。

圖2 乳酸桿菌在MRS培養(yǎng)基和菜籽粕發(fā)酵的可溶性還原糖(A)和游離氨基氮(B)含量Fig.2 Content of soluble reducing sugar and free amino nitrogen(B)in MRS medium and RSM fermented by Lactobacillus

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化乳酸桿菌發(fā)酵菜籽粕的條件

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示,根據(jù)極差分析(R值)結(jié)果,影響硫苷降解率4個(gè)因素的主次順序依次是:接種量、發(fā)酵時(shí)間、料水比和麩皮添加量。正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表3所示,除麩皮添加量外,其余 3個(gè)因素對硫苷降解率的影響均顯著(P<0.05)。結(jié)合極差分析結(jié)果,乳酸桿菌發(fā)酵菜籽粕的最優(yōu)條件為A1B1C2D1,即麩皮添加量(A)0,料水比(B)1∶1.1,接種量(C)70 mL·kg-1,發(fā)酵時(shí)間(D)60 h。為了節(jié)約時(shí)間成本,選擇48 h為最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。

表2 正交發(fā)酵試驗(yàn)因素(水平)和試驗(yàn)分組及硫苷降解率結(jié)果Table 2 Groups of orthogonal experimental and degradation of glucosinolate(Gls)

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA(analysis of variance)of orthogonal experiment

2.4 最優(yōu)條件發(fā)酵對菜籽粕營養(yǎng)成分及抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響

如表4所示:在最優(yōu)發(fā)酵條件下,與空白組(菜籽粕原料)相比,對照組中粗蛋白含量顯著升高,硫苷和植酸含量顯著降低(P<0.05),說明除發(fā)酵外,高壓滅菌等處理會(huì)對菜籽粕化學(xué)成分造成一定的影響;與空白組相比,發(fā)酵組粗纖維含量顯著下降(P<0.05),但3組之間的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量差異不顯著(P>0.05);與對照組相比,發(fā)酵對菜籽粕粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均無顯著影響(P>0.05)。此外,發(fā)酵分別將硫苷和植酸含量由107.44 μmol·g-1和29.18 mg·g-1降低至60.78 μmol·g-1和26.44 mg·g-1;發(fā)酵組的乳酸桿菌活菌數(shù)和乳酸含量顯著升高,pH值顯著降低(P<0.05)。

表4 乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵前、后菜籽粕化學(xué)成分分析Table 4 Chemical analysis of rapeseed meal before and after solid-state fermentation by Lactobacillus

3 討論

3.1 乳酸桿菌在菜籽粕中的生長特性及對可溶性碳、氮源的利用

3.2 影響乳酸桿菌發(fā)酵菜籽粕的條件

麩皮能夠疏松發(fā)酵培養(yǎng)基,減少底物成團(tuán)[27]。Shi等[5]指出,菜籽餅中添加30%的麩皮促進(jìn)了黑曲霉菌的硫苷降解率,而本試驗(yàn)中麩皮添加量對硫苷降解率無顯著促進(jìn)作用,這可能是黑曲霉菌和乳酸桿菌對底物利用的優(yōu)先性以及分泌硫苷降解酶能力不同所致。Roland等[28]報(bào)道,麩皮中約20%的碳水化合物具有可溶性,而乳酸桿菌更傾向于利用可溶性碳源,這可能導(dǎo)致乳酸桿菌對麩皮優(yōu)先利用,使其對菜籽粕硫苷降解減少。培養(yǎng)基中的料水比是影響固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一,本試驗(yàn)結(jié)果表明,料水比在1∶1.1時(shí)硫苷降解率最高,進(jìn)一步升高料水比導(dǎo)致硫苷降解率下降,其原因可能是基質(zhì)中水分的降低使養(yǎng)分溶解度降低,從而影響細(xì)菌的生長;而料水比降低也會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)間的孔隙縮小,從而降低氣體和熱量的傳遞[29]。接種量是決定發(fā)酵過程中微生物生長的重要因素,本試驗(yàn)結(jié)果顯示,最適接種量為7%,此時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中初始有效活菌數(shù)約為70 mL·kg-1,當(dāng)有效活菌數(shù)不足時(shí),會(huì)使微生物生長的滯后期延長[30],而過高的活菌數(shù)會(huì)導(dǎo)致菌體聚集成團(tuán),從而影響細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的利用及微生物酶的釋放[31]。發(fā)酵時(shí)間與微生物的生長階段密切相關(guān)。研究表明,使用黑曲霉菌發(fā)酵菜籽粕48 h,硫苷降解率最高[5]。本試驗(yàn)中,乳酸桿菌發(fā)酵菜籽粕48 h將硫苷由107.44 μmol·g-1降低至60.78 μmol·g-1,這與乳酸桿菌能夠在短時(shí)間內(nèi)(18～24 h)進(jìn)入平臺(tái)期,且在48 h時(shí)還能夠保持一定的活性有關(guān)。經(jīng)過正交試驗(yàn)優(yōu)化以上條件,硫苷降解率達(dá)到了43.43%,優(yōu)于正交試驗(yàn)各組中最高水平(41.43%)。

3.3 最優(yōu)條件發(fā)酵菜籽粕對其營養(yǎng)成分的影響

有研究表明,生長豬最多能耐受日糧中2.0～2.5 μmol·g-1的硫苷[32],說明硫苷限制了菜籽粕在豬日糧中的添加量。硫苷的主要結(jié)構(gòu)包含1個(gè)葡萄糖分子和1個(gè)含硫基團(tuán)[33],乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵降低了菜籽粕中硫苷含量,其含量的降低可能是微生物酶對硫苷中葡萄糖的利用引起的。Palop等[34]報(bào)道稱,LactobacillusagilisR16能夠降解硫苷產(chǎn)生葡萄糖,進(jìn)一步將其發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。本試驗(yàn)中,乳酸桿菌發(fā)酵使菜籽粕的硫苷含量降低43.43%。這與前人的研究結(jié)果相似,Weng等[27]使用Candidatropicalis發(fā)酵菜籽粕48 h,硫苷含量降低52.61%。Tang等[35]發(fā)現(xiàn),乳酸桿菌還能產(chǎn)生植酸酶,降解植酸中的磷酸,最終形成肌醇。本試驗(yàn)中,與未發(fā)酵組相比,乳酸桿菌發(fā)酵菜籽粕中的植酸降低了9.39%。飼料中的植酸(Myo-inositol hexakisphosphate,肌醇六磷酸)是一種礦物質(zhì)吸收抑制劑,它能夠與帶正電的二價(jià)陽離子包括鐵、鋅、鈣等結(jié)合,形成穩(wěn)定的植酸復(fù)合物,從而抑制腸道對礦物質(zhì)的吸收[36],說明植酸的降低能夠改善菜籽粕中礦物質(zhì)的利用率。

與未發(fā)酵組相比,乳酸桿菌發(fā)酵菜籽粕的粗蛋白含量提高了6.41%,三氯乙酸可溶蛋白含量提高78.45%。粗蛋白含量的提高可能與乳酸桿菌對菜籽粕中其他營養(yǎng)物質(zhì)利用有關(guān),導(dǎo)致氮元素相對含量升高。Shi等[5]研究表明,粗蛋白的增加與發(fā)酵基質(zhì)中碳水化合物的減少密切相關(guān)。乳酸桿菌具有分泌蛋白水解酶的能力[37-38],可將大分子蛋白質(zhì)水解為小分子肽和氨基酸。三氯乙酸可溶蛋白主要由小肽和游離氨基酸組成,其含量增加可能是由于乳酸桿菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶將大分子蛋白降解所致,這有利于動(dòng)物對菜籽粕蛋白的利用,說明乳酸桿菌發(fā)酵改善了菜籽粕蛋白品質(zhì)。發(fā)酵對菜籽粕中纖維(粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維)的降解均無顯著作用,這可能是由于本試驗(yàn)所用菌株分泌纖維降解酶的能力有限。

綜上,3株混合乳酸桿菌可利用菜籽粕生長,具有發(fā)酵潛力;通過正交試驗(yàn),優(yōu)化了乳酸桿菌發(fā)酵菜籽粕的條件:麩皮添加量0%,料水比1∶1.1,接種量70 mL·kg-1,發(fā)酵時(shí)間48 h;在最優(yōu)條件下,乳酸桿菌能顯著降低菜籽粕中硫苷含量,改善其營養(yǎng)價(jià)值,但對纖維的降解能力有限。