副溶血弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)1內(nèi)桿狀蛋白基因vscI的功能分析

廉樂(lè)樂(lè),薛嬌,李婉君,任建鸞,諸葛祥凱,湯芳,薛峰*,戴建君,2

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部動(dòng)物健康與食品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.中國(guó)藥科大學(xué),江蘇 南京 211199)

副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)屬于革蘭陰性致病菌,常在沿海地區(qū)引發(fā)食物中毒而導(dǎo)致胃腸炎和敗血癥[1]。隨著人民生活水平的提高和海產(chǎn)品消費(fèi)的增加,副溶血性弧菌已經(jīng)成為主要食源性致病菌之一[2]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion systems,T3SS)作為該菌的重要毒力因子由高度組織化的多種蛋白組成,位于1號(hào)(T3SS1)與2號(hào)(T3SS2)染色體,分別表現(xiàn)為細(xì)胞毒性與腸毒性[3]。T3SS1由vp1656至vp1702基因簇編碼,主要由結(jié)構(gòu)蛋白、效應(yīng)蛋白、輸出裝置蛋白以及伴侶蛋白組成。

在一些革蘭陰性菌中,已有相關(guān)研究報(bào)道T3SS內(nèi)桿狀蛋白的生物學(xué)功能[4-6]。腸道致病性大腸桿菌內(nèi)桿狀蛋白EscI與EcsU通過(guò)互作共同控制T3SS裝置基底座結(jié)構(gòu)(substrate),調(diào)控效應(yīng)子的分泌,同時(shí)與外膜分泌素EscC結(jié)合后增強(qiáng)其支持功能[5]。在小鼠感染模型上,表達(dá)融合有EcsI效應(yīng)蛋白的腸致病性大腸桿菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞后,通過(guò)激活核效應(yīng)蛋白(NLRC4)炎性小體可限制該菌在小鼠脾臟和肝臟中的定殖,為大腸桿菌疫苗的研制提供理論支持[7]。在鼠傷寒沙門菌中,內(nèi)桿狀蛋白PrgI通過(guò)控制基底座來(lái)調(diào)控效應(yīng)子的分泌以及胞外針狀結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度[6]。在耶爾森菌T3SS1中發(fā)現(xiàn)內(nèi)桿狀蛋白YscI與針狀蛋白YscF存在互作,參與組裝針狀結(jié)構(gòu)[4],且YscP和YscU會(huì)切換分泌系統(tǒng)的底物特異性,便于在針頭達(dá)到適當(dāng)長(zhǎng)度后即可輸出易位蛋白Yop,內(nèi)桿狀蛋白YscI在底物特異性切換中起關(guān)鍵作用[8]。對(duì)于副溶血弧菌T3SS1的研究表明,VP1656、VP1657作為輸出裝置蛋白,保證效應(yīng)蛋白正常易位至宿主細(xì)胞胞漿內(nèi)[9];VP1680、VP1683、VP1686以及VPA0450效應(yīng)蛋白作為毒力因子干擾宿主細(xì)胞正常生理活動(dòng)[10-13];VPA0451為VPA0450的伴侶蛋白[14]。然而,vscI編碼的內(nèi)桿狀蛋白VscI功能未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

研究vscI基因在菌體細(xì)胞毒性中發(fā)揮的作用,對(duì)于闡明副溶血弧菌T3SS1的致病機(jī)制很重要。本研究通過(guò)生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn),副溶血弧菌的VscI與沙門菌的EscI、耶爾森氏菌的YscI同源,故以vscI為研究對(duì)象,挖掘其在感染宿主細(xì)胞時(shí)所扮演的生物學(xué)角色,為內(nèi)桿狀蛋白VscI在T3SS1中的作用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

副溶血弧菌參考菌株RIMD2210633、tdhAS缺陷菌株P(guān)OR-1以及其他菌株和HeLa細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存(表1)。質(zhì)粒pYAK1等信息見(jiàn)表1。

表1 本研究所用菌株與質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study

乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞微管紅色熒光探針(Tubulin-Tracker Red)和GreenNucTM活細(xì)胞Caspase-3酶活性檢測(cè)試劑盒,均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司(Beyotime);DAPI細(xì)胞核熒光染料、PI染色液和蛋白提取試劑盒,均購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司;cAMP檢測(cè)試劑盒(KGE002B)購(gòu)自R&D System生物科技有限公司;CyaA抗體購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)通用(GE)公司;同源重組試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

儀器:賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司的細(xì)胞培養(yǎng)箱(培養(yǎng)條件5% CO2,37 ℃);德國(guó)卡爾·蔡司公司的熒光倒置顯微鏡(ZEISS Oxio Observer);美國(guó)BD公司的流式細(xì)胞儀;上海天能科技有限公司的曝光儀;瑞士TECAN公司的多功能酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 VscI蛋白的結(jié)構(gòu)分析vscI(NP_798070.1)ORF長(zhǎng)度345 bp,編碼VscI蛋白共115個(gè)氨基酸。為了全面研究VscI蛋白,通過(guò)BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線數(shù)據(jù)庫(kù)工具查找VscI蛋白進(jìn)化樹(shù),利用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index)檢索并預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2vscI缺失株及回補(bǔ)株的構(gòu)建vscI基因ORF總長(zhǎng)345 bp,共編碼115個(gè)氨基酸。tdhAS作為副溶血弧菌RIMD2210633重要毒力因子,其缺失株P(guān)OR-1作為T3SS1研究的基礎(chǔ)菌株[17,19]。本試驗(yàn)在POR-1基礎(chǔ)上構(gòu)建缺失株ΔvscI,方法參照文獻(xiàn)[3]。選擇基因組回補(bǔ)構(gòu)建回補(bǔ)株CΔvscI,將回補(bǔ)區(qū)域內(nèi)的CAA同義突變成CAG(用來(lái)區(qū)分野生株與回補(bǔ)株),兩者均編碼谷氨酰胺。將上述構(gòu)建DNA片段與自殺質(zhì)粒pYAK1連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌SM10λpir宿主菌,通過(guò)接合轉(zhuǎn)移最終將其轉(zhuǎn)入POR-1菌株。經(jīng)氯霉素與TCBS雙篩選后,菌株通過(guò)不斷傳代誘導(dǎo)其發(fā)生二次同源重組,蔗糖負(fù)壓篩選結(jié)合內(nèi)部/外部PCR擴(kuò)增方法對(duì)缺失株進(jìn)行篩選鑒定。在缺失菌株的基礎(chǔ)上,將構(gòu)建好的含有單核苷酸突變ORF與pYAK1載體連接,以相同的方法對(duì)vscI基因進(jìn)行基因組回補(bǔ)。所用引物已上傳NCBI的Probe數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào):BankIt2344979 NC_004603.1:c1803498—1803154 MT475884)。具體序列見(jiàn)表2。

表2 構(gòu)建vscI缺失與回補(bǔ)株的引物序列Table 2 Sequence of the primers used to construct deletion strains and complementation strains

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定過(guò)夜培養(yǎng)野生株P(guān)OR-1、缺失株ΔvscI、CΔvscI,按1∶100比例分別接入50 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床220 r·min-1培養(yǎng),每隔1 h取樣1次,測(cè)D600值。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)后使用GraphPad Prism繪制生長(zhǎng)曲線,并進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析。

1.2.4 細(xì)胞毒性測(cè)定HeLa、Caco-2和Raw264.7細(xì)胞均勻鋪于96孔板,用含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)至80%～90%。POR-1、ΔvscI以及CΔvscI等菌株用普通LB培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。用PBS洗滌細(xì)胞后與PBS洗滌后的細(xì)菌以1∶10的感染復(fù)數(shù)(MOI),在含1%血清的DMEM共培養(yǎng)3 h左右。依據(jù)LDH細(xì)胞毒性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書定量各試驗(yàn)組細(xì)胞向培養(yǎng)基釋放的LDH量。試驗(yàn)重復(fù)3次。另外,用相同MOI感染的HeLa細(xì)胞與微管紅色熒光探針(Tubulin-Tracker Red)(5% BSA、0.1% Trition X-100)共孵育1 h后,在37 ℃恒溫箱與DAPI共孵育15 min,進(jìn)行復(fù)染。將試驗(yàn)樣品用PBS洗滌3次,用蔡司Oxio倒置顯微鏡10倍放大觀察上述試驗(yàn)組的細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.5 細(xì)胞黏附率測(cè)定細(xì)胞黏附率測(cè)定的感染方法參考上述細(xì)胞毒性測(cè)定,不同的是HeLa細(xì)胞鋪于12孔板。感染3 h后用滅菌PBS輕輕洗滌3次(除去未黏附的細(xì)菌),每孔加入500 μL體積分?jǐn)?shù)為0.01% TritonX-100,室溫作用10 min。收集上述樣品,用PBS倍比稀釋,每個(gè)稀釋度3次重復(fù)。在合適的稀釋度取10 μL滴加于15 g·L-1的普通固體平板。選擇菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),再計(jì)算細(xì)菌黏附率。正常細(xì)菌作為陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算公式如下:

黏附率=黏附CFU/起始CFU×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡利用DNA螯合熒光染料碘化丙啶(PI)和Caspase-3/7綠色熒光底物檢測(cè)不同感染組細(xì)胞當(dāng)中凋亡細(xì)胞數(shù)所占比例。采用上述相同的感染方法,2.5 g·L-1胰蛋白酶消化細(xì)胞,600g離心5 min,收集細(xì)胞,用PBS洗滌3次。用Caspase-3活細(xì)胞檢測(cè)試劑盒(5 μmol·L-1)與PI(10 μmol·L-1)室溫條件下染色30 min。用FACS檢測(cè)熒光信號(hào)。以PBS處理HeLa細(xì)胞作為空白細(xì)胞對(duì)照并設(shè)為物理門,以2種染料分別單染以設(shè)立化學(xué)門,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。同一樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 腺苷酸環(huán)化酶報(bào)告載體的構(gòu)建通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶報(bào)告載體研究真核細(xì)胞內(nèi)原核細(xì)菌效應(yīng)子的易位量。VP1683和VP1686屬于副溶血弧菌T3SS1效應(yīng)蛋白。首先利用下列引物A1/A2擴(kuò)增vp1683與vp1686片段,A3/A4擴(kuò)增腺苷酸環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域(CyaA)DNA片段,用融合PCR技術(shù)將上述擴(kuò)增片段連接,同源重組試劑盒與BamHⅠ線性化pMMB207載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌SM10λpir,經(jīng)氯霉素抗性平板篩選后挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。選擇PCR鑒定陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序正確的即為成功構(gòu)建的 pMMB207-vp1683-CyaA和pMMB207-vp1686-CyaA載體。

表3 構(gòu)建腺苷酸環(huán)化酶報(bào)告載體的引物序列Table 3 Sequence of the primers used to construct adenylate cyclase reporter

1.2.8 效應(yīng)蛋白易位量的檢測(cè)含有pMMB207-vp1683-CyaA和pMMB207-vp1686-CyaA的大腸桿菌SM10λpir與POR-1、ΔvscI以及CΔvscI菌株分別以1∶1比例混合并接合轉(zhuǎn)移,將上述載體轉(zhuǎn)入副溶血弧菌;用相同方式感染HeLa細(xì)胞2～3 h后,用cAMP assay ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)生量。

為了對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行雙重驗(yàn)證,用Western blot對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)CyaA進(jìn)行定量。用含有上述過(guò)表達(dá)載體的菌株感染HeLa細(xì)胞2～3 h后按照說(shuō)明使用試劑盒(KeyGEN BioTECH)提取HeLa細(xì)胞全蛋白,5×SDS Loading Buffer收樣,沸水煮10 min,120 g·L-1SDS-PAGE分離膠分離蛋白,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF,Millipore),CyaA抗體(Santa Cruz)孵育,ECL化學(xué)發(fā)光液顯色并拍照。利用ImageJ進(jìn)行相對(duì)灰度值分析(CyaA/Loading),用GraphPad Prism繪制結(jié)果并進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺失株及回補(bǔ)株的構(gòu)建

從含有氯霉素的TCBS平板挑取單菌落,用內(nèi)部引物vscI-NF/R及外部引物vscI-1/4進(jìn)行PCR鑒定。鑒定結(jié)果(圖1)顯示:與POR-1相比,缺失株ΔvscI經(jīng)內(nèi)部引物鑒定無(wú)條帶,經(jīng)外部引物擴(kuò)增片段偏小,回補(bǔ)株CΔvscI的內(nèi)、外部引物擴(kuò)增條帶與POR-1一致。表明ΔvscI與CΔvscI均構(gòu)建成功。

圖1 vscI缺失株及回補(bǔ)株的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results of the ΔvscI and CΔvscIM. DL2000 DNA標(biāo)準(zhǔn);1.RIMD 2210633內(nèi)部引物;2. POR-1內(nèi)部引物;3. ΔvscI內(nèi)部引物;4. CΔvscI內(nèi)部引物;5、11. 陽(yáng)性對(duì)照;6、12. 陰性對(duì)照;7. RIMD 2210633外部引物;8. POR-1外部引物;9. ΔvscI外部引物;10. CΔvscI外部引物。M. DL2000 DNA marker;1. RIMD 2210633 internal primer;2. POR-1 internal primer;3. ΔvscI internal primer;4. CΔvscI internal primer;5,11. Positive control;6,12. Negative control;7. RIMD 2210633 external primer;8. POR-1 external primer;9. ΔvscI external primer;10. CΔvscI external primer.

2.2 VscI蛋白的進(jìn)化分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

BLAST分析結(jié)果顯示:VscI與加勒比?；【?Vibriocaribbeanicus)的TS33內(nèi)桿狀組分(the inner rod subunit)來(lái)自同一祖先,屬于YscI/HrpB家族。Phyre2預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示為α螺旋,這種二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,對(duì)于一些蛋白質(zhì)的整體構(gòu)象起支撐作用(圖2)。

圖2 VscI的進(jìn)化樹(shù)分析(A)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(B)Fig.2 Phylogenetic tree construction(A)and secondary prediction(B)of VscI

2.3 各菌株的生長(zhǎng)曲線

從圖3可見(jiàn):野生株、回補(bǔ)株、缺失株間的生長(zhǎng)情況并無(wú)顯著差異(P>0.05),表明vscI基因的缺失對(duì)副溶血弧菌的生長(zhǎng)并無(wú)影響。

圖3 不同菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of different strains

2.4 vscI對(duì)T3SS1介導(dǎo)細(xì)胞毒性黏附存在的影響

菌株P(guān)OR-1、ΔvscI與CΔvscI分別感染HeLa細(xì)胞,結(jié)果顯示:野生株P(guān)OR-1與回補(bǔ)株CΔvscI感染組細(xì)胞圓形化,細(xì)胞骨架受損,熒光染色聚集胞核周邊;而缺失株ΔvscI感染組細(xì)胞基本保持正常形態(tài),胞內(nèi)黑色顆粒均勻分布,骨架呈放射狀分布,細(xì)胞核形態(tài)正常,核邊緣光滑整齊(圖4)。表明vscI缺失降低了菌株對(duì)HeLa細(xì)胞的損傷。

圖4 不同菌株感染下HeLa細(xì)胞的形態(tài)(左)和細(xì)胞微管蛋白熒光染色(紅色)及細(xì)胞核染色(藍(lán)色)(右)觀察Fig.4 Cell morphological changes(left)infected by different strains,cells stained for Tubulin-Track(red)and cells stained with DAPI(blue)(right)

細(xì)胞毒性結(jié)果顯示:POR-1與ΔvscI存在極顯著差異(P<0.001),ΔvscILDH檢出量下降了60%(圖5-A)。黏附結(jié)果顯示:POR-1與ΔvscI黏附率存在極顯著差異(P<0.001),ΔvscI的黏附率下降了85%(圖5-B)。回補(bǔ)株的細(xì)胞毒性與黏附性均得到恢復(fù)。

圖5 不同菌株感染對(duì)細(xì)胞毒性(A)和黏附率(B)的影響Fig.5 Effects of cytotoxicity(A)and adhesion rate(B)in HeLa cells infected by different strains

2.5 vscI對(duì)T3SS1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡存在的影響

Caspase-3染色熒光檢測(cè)結(jié)果顯示:缺失株試驗(yàn)組與POR-1試驗(yàn)組相比,Casepase-3的熒光從89.3%顯著下降至8.9%,回補(bǔ)株從8.9%升高至72.1%(圖6-A)。缺失株試驗(yàn)組PI染色結(jié)果顯示:紅色熒光細(xì)胞數(shù)量從97.2%顯著下降至1.7%,回補(bǔ)株從1.7%升高至75.4%(圖6-B),表明vscI的缺失降低副溶血弧菌對(duì)HeLa細(xì)胞的損傷,直接或間接參與細(xì)胞凋亡。

圖6 Caspase-3染色(A)和PI染色(B)檢測(cè)不同菌株感染對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Detection of apoptosis caused by different strains using Caspase-3 staining(A)and PI staining(B)

2.6 vscI對(duì)T3SS1效應(yīng)蛋白易位的影響

cAMP試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示,與含有過(guò)表達(dá)載體的POR-1感染細(xì)胞組相比,ΔvscI感染HeLa細(xì)胞內(nèi)cAMP含量顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)(圖7-A)。同時(shí),CyaA抗體檢測(cè)顯示,缺失菌株感染細(xì)胞內(nèi)的CyaA量顯著下降,并在回補(bǔ)菌株中恢復(fù)(圖7-B),灰度分析結(jié)果顯示存在顯著差異(P<0.001或P<0.05)。表明vscI缺失減少了T3SS1效應(yīng)蛋白的易位量。

圖7 vscI對(duì)T3SS1效應(yīng)蛋白易位的影響Fig.7 The effect of vscI on the translocation of the T3SS1 effector proteinELISA試劑盒檢測(cè)HeLa細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生量(A),Western-blot 檢測(cè)HeLa細(xì)胞內(nèi)CyaA產(chǎn)生量(B)和灰度值分析(C)。Intracellular cAMP levels were quantified by ELISA(A);The whole cell lysis CyaA protein of the above groups was quantified by Western blot analysis(B),and Grayscale analysis(C).

3 討論

T3SS1各結(jié)構(gòu)組分間相互協(xié)調(diào)配合有序才能將效應(yīng)子注入宿主胞質(zhì)內(nèi),發(fā)揮生物學(xué)功能[20]。本試驗(yàn)以T3SS1編碼簇中vscI基因?yàn)檠芯繉?duì)象,發(fā)現(xiàn)vscI缺失減弱菌體對(duì)宿主細(xì)胞的感染,引起細(xì)胞形態(tài)變化、損傷以及凋亡等,進(jìn)一步佐證T3SS1結(jié)構(gòu)完整的重要性。黏附是細(xì)菌感染宿主的第一步,與致病性存在緊密聯(lián)系[21]。已有文獻(xiàn)報(bào)道副溶血弧菌黏附相關(guān)因子主要包括黏附因子、血凝素、烯醇酶和T6SS2[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,副溶血弧菌T3SS1結(jié)構(gòu)蛋白基因vscI能夠增加菌體的黏附,說(shuō)明T3SS1與菌體黏附也相關(guān)。但此處僅分析了黏附性狀表型,對(duì)于T3SS1調(diào)控菌體黏附的機(jī)制仍需深入研究。

T3SS1主要通過(guò)效應(yīng)子發(fā)揮細(xì)胞毒性,例如效應(yīng)蛋白VPA0450屬于5-磷酸肌醇酶,通過(guò)水解磷脂酰肌醇的4,5-磷酸二酯鍵,來(lái)破壞宿主細(xì)胞膜內(nèi)表面的細(xì)胞骨架結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致細(xì)胞骨架與膜間的連接受損,最終膜穩(wěn)態(tài)被破壞[13]。VP1686通過(guò)NF-κB抑制作用誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生非依賴性Toll樣受體細(xì)胞凋亡[23]。另外有研究發(fā)現(xiàn)沙門菌等革蘭陰性菌T3SS1內(nèi)桿狀結(jié)構(gòu)蛋白有助于支持注射裝置的基底座結(jié)構(gòu),調(diào)控效應(yīng)蛋白分泌[5,8]。本研究中Phyre2結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,vscI基因編碼T3SS1內(nèi)桿狀蛋白VscI的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋構(gòu)成,該二級(jí)結(jié)構(gòu)有助于穩(wěn)定輸出裝置[24]。Sory等[25]最早用腺苷酸環(huán)化酶報(bào)告載體系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)耶爾森菌真核效應(yīng)子易位,隨后用于副溶血弧菌中[9]。報(bào)告載體腺苷酸環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域可催化真核胞質(zhì)內(nèi)ATP環(huán)化成cAMP。本研究利用該系統(tǒng)檢測(cè)vscI缺失對(duì)T3SS1已知效應(yīng)蛋白易位量的影響,結(jié)果顯示vscI缺失導(dǎo)致VP1683與VP1686在HeLa細(xì)胞內(nèi)易位量顯著下降,表明副溶血弧菌T3SS1vscI基因?qū)τ赥3SS1效應(yīng)蛋白易位是必需的。由此推測(cè),vscI基因缺失導(dǎo)致T3SS1分泌裝置的基底座結(jié)構(gòu)無(wú)法正常組裝,效應(yīng)蛋白易位受阻,菌體對(duì)細(xì)胞感染能力下降。

綜上,本研究證實(shí)副溶血弧菌內(nèi)桿狀蛋白基因vscI與該菌的細(xì)胞黏附能力和毒力密切相關(guān),且對(duì)于T3SS1效應(yīng)子的易位是必需的。