9株昆蟲病原線蟲共生菌菌株的分離、鑒定及其抗菌譜的篩選

張潘杰,竇振國,王浩,包浩然,張克云

(南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,江蘇 南京 210095)

昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematode,EPN),又稱昆蟲寄生線蟲。在自然狀態(tài)下,EPN侵染期幼蟲(infected juveniles,IJ)腸道內(nèi)攜帶有與其穩(wěn)定共生的細菌[1]。對于EPN來說,這種共生關(guān)系是單一的,雖然1種細菌可以與多種EPN共生,但每種EPN只能與1種細菌共生。腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的致病桿菌屬(Xenorhabdus)和發(fā)光桿菌屬(Photorhabdus)分別與斯氏線蟲科(Steinernematidae)和異小桿科(Heterorhabditida)的EPN共生[2-5]。EPN共生菌最早發(fā)現(xiàn)于20世紀60年代,晚于腸桿菌科的大部分屬,是腸桿菌科的一個特殊菌屬[6]。起初關(guān)于共生菌的種屬確定主要基于菌落形態(tài)、生理生化特征的差異[7],但僅僅依靠這類特征具有一定的局限性和不穩(wěn)定性。20世紀80年代以后,分子生物學技術(shù)逐漸被應(yīng)用于共生菌種屬確定工作中,使EPN共生菌的分類準確性更高,特異性更強[7-9]。

近年來,研究表明EPN共生菌除具有昆蟲毒性外,在體外培養(yǎng)時對植物真菌有較強的抑制能力[10-14]。與殺蟲效果受線蟲攜帶率和線蟲自身侵襲力影響不同,抗真菌效果與共生菌自身特性關(guān)聯(lián)更強,將成為EPN共生菌資源開發(fā)利用的主要研究方向。前人研究也發(fā)現(xiàn),EPN共生菌對真菌的抑菌效果受各種環(huán)境因素的影響,不同菌株的抑菌效果差異也較大[14-18]。因此,優(yōu)質(zhì)菌株資源的篩選是后期研究的基礎(chǔ)。

稻瘟病、西瓜枯萎病、黃瓜枯萎病、灰霉病與辣椒疫霉病都是長江中下游平原地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常見的病害,每次流行都會給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟帶來巨大損失[19-21]。近年來新型農(nóng)藥的開發(fā)大多將以上5種真菌病害列為防治重點,其中西瓜枯萎病與黃瓜枯萎病的病原菌尖孢鐮刀菌又因其孢子的環(huán)境耐受力強,更成為植物真菌病害防治領(lǐng)域的重點與難題。目前,抑制菌絲生長和分生孢子萌發(fā)是防治土傳鐮刀菌病害的重要手段,而且關(guān)于昆蟲病原線蟲共生細菌對以上5種病原真菌的綜合抑制作用尚未見報道。

本研究采用3種方法分離EPN共生菌,比較它們的分離效果;利用最佳分離方法分離9株EPN的共生菌;基于16S rDNA序列信息驗證9種共生菌的種屬。以稻瘟菌、尖孢鐮刀菌西瓜?；?、尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、灰葡萄孢、辣椒疫霉為供試真菌測試共生菌的抑菌譜,篩選綜合抑制效率最高的菌株。研究結(jié)果將為防治植物病原真菌的研究提供技術(shù)支撐及優(yōu)質(zhì)的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

9種EPN由加州大學河濱分校的Adler R. Dillman 博士惠贈。其中,7種為斯氏線蟲科,分別是Steinernemacarpocapsae、S.costaricense、S.glaseri、S.oregonense、S.riobrave、S.texanum、S.innexi,其共生菌株分別編號為NN1、NN2、NN4、NN6、NN7、NN8、NN20;2種為異小桿科線蟲,分別是Heterorhabditisbacteriophora和H.megidis,其共生菌株分別編號為NN11和NN13。用于培養(yǎng)和繁殖線蟲的昆蟲為市售的大蠟螟(Gallermellonella)5齡幼蟲。稻瘟病菌(Guy2)、尖孢鐮刀菌西瓜專化型(FON1)、尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(NFOC1)、灰葡萄孢菌(NBC1)和辣椒疫霉(NPC1)保存于本實驗室。

1.2 培養(yǎng)基的配制

NBTA(丙酮酸鈉)培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g·L-1,酵母提取物5 g·L-1,氯化鈉10 g·L-1,瓊脂15 g·L-1,溴百里酚藍(BTB)0.025 g·L-1,丙酮酸鈉1 g·L-1,氯化三苯基四氮唑0.04 g·L-1。LB(丙酮酸鈉)培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g·L-1,酵母提取物5 g·L-1,氯化鈉10 g·L-1,丙酮酸鈉1 g·L-1。NA(丙酮酸鈉)培養(yǎng)基:牛肉提取物3 g·L-1,胰蛋白胨5 g·L-1,營養(yǎng)瓊脂20 g·L-1,丙酮酸鈉1 g·L-1。搖瓶發(fā)酵(YS)培養(yǎng)基:磷酸二氫銨0.5 g·L-1,磷酸氫二鉀0.5 g·L-1,七水合硫酸鎂0.2 g·L-1,氯化鈉5 g·L-1,酵母提取物5 g·L-1。PDA培養(yǎng)基:稱取200 g新鮮馬鈴薯碎塊,加水1 000 mL煮沸30 min,濾液中加入20 g·L-1的葡萄糖,15 g·L-1的瓊脂。V8培養(yǎng)基[22]:將1 g碳酸鈣加到100 mL V8果蔬汁中,充分混合,5 000 r·min-1離心20 min,用ddH2O將上清液稀釋10倍,然后加入15 g·L-1瓊脂。所有培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH 值為7.0～7.4。

1.3 共生菌的分離

1.3.1 研磨法在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中墊入1層濾紙,加入350 μL無菌水,保持濾紙濕潤,再加入100條侵染期幼蟲(infective juveniles,IJ),放入5頭新鮮健康的大蠟螟5齡幼蟲自然侵染。2～3 d后大蠟螟被侵染致死,7～9 d直至蟲尸風干,用White trap法收集從蟲尸中釋放出的新一代IJ。取約100條IJ加入1.5 mL無菌離心管中,加入無菌水洗滌2～3次,自然沉淀后棄上清液,加入200 μL 100 mg·L-1的硫柳汞溶液浸泡10 min,瞬時離心后除去上清液,用林格氏緩沖液洗滌2次。再加入150 μL 100 mg·L-1放線菌酮溶液和150 μL 100 mg·L-1硫酸鏈霉素溶液浸泡8 min,瞬時離心后除去上清液,用林格氏緩沖液洗滌3次。最后1次洗滌后,保留約80 μL的液體。混勻后吸出線蟲懸液,加入無菌研缽中充分研磨5～10 min,將研磨液吸出并均勻滴加到NBTA平板上,用接種環(huán)進行四區(qū)劃線接種,28 ℃下避光培養(yǎng)48 h[23]。

1.3.2 血淋巴涂布法在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中墊入1層濾紙,加入350 μL無菌水,保持濾紙濕潤,再加入100條IJ。放入5頭新鮮健康的大蠟螟5齡幼蟲自然侵染,18～24 h后用鑷子夾出大蠟螟,用70%(體積分數(shù))乙醇進行體表消毒30 s,重復2次。再用無菌剪刀剪去大蠟螟的第5或第6對腹足,用移液槍吸取滲出的20 μL血淋巴液滴入NBTA平板培養(yǎng)基中,用接種環(huán)進行平行劃線接種,28 ℃下避光培養(yǎng)48 h[24]。

1.3.3 改良涂布法在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中墊入1層濾紙,加入350 μL無菌水,保持濾紙濕潤,再加入100條IJ。放入5頭新鮮健康的大蠟螟5齡幼蟲自然侵染,約48 h后可觀察到大蠟螟開始死亡,將死亡后6 h的大蠟螟用鑷子夾出,用70%乙醇進行體表消毒30 s,重復2次。用鑷子夾住大蠟螟頭部,然后用無菌剪刀在第5或第6對腹足處剪斷蟲體,用蟲體截面在NBTA培養(yǎng)基不同區(qū)域上點蘸6～8次,28 ℃避光培養(yǎng)48 h。

1.4 16S rDNA的PCR擴增與系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

挑取NBTA平板上藍綠色的初生型單菌落接種入20 mL NB培養(yǎng)基,180 r·min-1、28 ℃培養(yǎng)18 h。用苯酚、氯仿和異戊醇(V∶V∶V=1∶1∶1)的混合物提取細菌基因組DNA。用異丙醇沉淀DNA后,用TE緩沖液溶解。16S rDNA擴增的PCR引物序列為16S-Forward:5′-GGGGGATAACCACTGGAAACGG-3′;16S-Reverse:5′-CCACATCTCTACGCATCTCACC-3′。PCR程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,54 ℃ 60 s,72 ℃ 90 s,循環(huán)35次;72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物送安徽通用生物系統(tǒng)有限公司測序。將16S rDNA序列與從GenBank獲得的16株致病桿菌和5株發(fā)光桿菌的16S rDNA序列進行比較。采用MEGA 7.0軟件進行多序列同源性分析,采用鄰接法(Neighbor-joining method,NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[25]。

1.5 共生菌發(fā)酵液的制備

從分離到的共生細菌中挑取初生型單菌落(藍綠色),接種到LB液體培養(yǎng)基中,180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。取新鮮菌液以5%的接種量轉(zhuǎn)移到Y(jié)S液體培養(yǎng)基中,180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h制備種子液,將種子液以5%的接種量轉(zhuǎn)移到新的YS液體培養(yǎng)基中,180 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h完成發(fā)酵。細菌培養(yǎng)的所有過程均在28 ℃下進行[26]。

1.6 發(fā)酵液組分的分離與倍比稀釋

1.6.1 共生菌代謝物(或無菌濾液)的分離NN6與NN8發(fā)酵完成后,將發(fā)酵液在10 000 r·min-1離心30 min,吸取上清液,用針式過濾器(濾膜孔徑<0.22 μm)進行過濾除菌。所得到的濾液于10 000 r·min-1離心10 min,細胞沉淀后用上清液涂布LB平板,24 h后進行菌落計數(shù),小于102CFU·mL-1時可將上清液認定為無菌濾液。

1.6.2 共生菌細胞懸液的制備將所獲得的菌細胞沉淀物用與離心前發(fā)酵液等體積的無菌水重懸,制成菌細胞懸液。

1.6.3 共生菌代謝物(或無菌濾液)和細胞懸液的稀釋將發(fā)酵液、菌細胞懸液、無菌濾液采用倍比稀釋法稀釋至1、2、5和10倍。發(fā)酵液和菌細胞懸液濃度用D600和CFU值標定。

1.7 菌絲生長抑制效率的測定

采用平板菌絲抑制法測定發(fā)酵液、菌懸液和無菌濾液對真菌菌絲生長的抑制效率[10]。將5 mL處理液(發(fā)酵液、菌懸液或無菌濾液)分別添加到43 mL PDA或V8固體培養(yǎng)基中,以無菌YS培養(yǎng)基作為對照,加入處理液時PDA或V8培養(yǎng)基的溫度應(yīng)降至42 ℃左右并保持液態(tài)?；旌蠐u勻后制成3個完全相同的平板,從培養(yǎng)5～7 d的真菌菌落邊緣切下直徑為7.5 mm的菌餅,置于混有處理液的平板中央。25 ℃避光培養(yǎng)6 d,測量菌落直徑,計算生長抑制效率,5個生物學重復。抑制效率(C)的計算公式:C=[(b-7.5)-(a-7.5)/(b-7.5)]×100%。式中:a為處理組的菌落直徑(mm);b為對照組的菌落直徑(mm)。

1.8 分生孢子萌發(fā)抑制效率試驗[27]

采用凹玻片法測定發(fā)酵液、菌懸液和無菌濾液對鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用。從PDA平板上培養(yǎng)4 d的鐮刀菌菌落邊緣打下4個直徑7.5 mm的菌餅加入PDB培養(yǎng)基中,180 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)96 h獲得分生孢子懸液。分生孢子懸液用6層紗布過濾,再將濾液1 000 r·min-1離心5 min,棄去上清液,加入ddH2O并再次離心,最后用ddH2O將分生孢子重懸至1×106CFU·mL-1。將10 μL分生孢子懸液滴到凹玻片中心,加入10 μL處理液(發(fā)酵液、菌懸液或無菌濾液),最后加入10 μL 5 g·L-1葡萄糖溶液,充分混合。將凹玻片置于淺水培養(yǎng)皿中,25 ℃避光培養(yǎng)9 h,用10 μL無菌水和10 μL 5 g·L-1葡萄糖溶液作為對照。當對照組萌發(fā)率達到90%以上時,隨機選擇視野檢查各處理組孢子萌發(fā)情況,每一組的調(diào)查總數(shù)不少于100,分別記錄分生孢子總數(shù)和萌發(fā)數(shù)。當分生孢子芽管長度大于分生孢子短半徑即為萌發(fā)。根據(jù)公式(1)計算分生孢子萌發(fā)率(R)。根據(jù)公式(3)計算相對萌發(fā)抑制效率(I)。

R=Ng/Nt×100%

(1)

Rg=Rt/R0×100%

(2)

I=(R0-Rg)/R0×100%

(3)

式中:Ng代表已萌發(fā)的分生孢子數(shù);Nt代表調(diào)查的分生孢子總數(shù);Rg代表經(jīng)過處理校正后的分生孢子萌發(fā)率;Rt代表處理分生孢子萌發(fā)率;R0代表對照分生孢子萌發(fā)率;I代表分生孢子萌發(fā)的相對抑制效率。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)處理,用Graphpad Prism 7.0c軟件繪圖,用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種方法分離效果的比較

2.1.1 研磨法將S.caporcapsae的IJ充分研磨后的勻漿液滴加于NBTA平板,分離共生菌。結(jié)果(圖1-A)表明:本法分離效率較低,平板上分布有少量初生型單菌落和IJ殘體,平均每次可分離出8.2個單菌落,每微升線蟲勻漿液分離出0.1個單菌落,雜菌率低。

圖1 3種分離方法獲得共生菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of symbiotic bacteria obtained by three isolation methodsA. 研磨法Grinding method;B. 血淋巴涂布法Hemolymph coating method;C. 改良涂布法Modified hemolymph coating method.

2.1.2 血淋巴涂布法將被EPN侵染18 h后的大蠟螟的血淋巴液滴加于NBTA平板。結(jié)果(圖1-B)表明:本法分離效率較高,平板上初生型菌落多,平均每次可分離出67.7個單菌落,每微升血淋巴液可分離出3.4個單菌落,且雜菌率低。由于血淋巴液在體外發(fā)生黑化反應(yīng),不利于觀察和挑取單菌落。

2.1.3 改良涂布法大蠟螟被EPN侵染死亡6 h后,用其尸體截面點蘸NBTA平板。結(jié)果(圖1-C)表明:本法分離效率高,平板上初生型菌落多,平均每次可分離出124.0個單菌落,且雜菌率低,無黑化反應(yīng)發(fā)生,培養(yǎng)基上易于觀察。培養(yǎng)基中的BTB被初生型菌落吸收,平板顏色變淺。

2.2 共生菌16S rDNA的擴增與系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

2.2.1 共生菌菌株的分離與16S rDNA的擴增利用改良涂布法從EPN中分離到9株共生菌,用單菌落在NBTA平板上劃線培養(yǎng)純化(圖2)。提取單菌落基因組DNA后進行PCR擴增與瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示:共生菌16S rDNA擴增片段長度約為1 500 bp,連接pMD19-T質(zhì)粒后,菌落PCR擴增片段長度約為1 500 bp(圖3)。

圖2 共生菌在NBTA平板上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony growth morphology of symbiotic bacteria on NBTA plate A. X.nematophila NN1;B. X.koppenhoeferi NN2;C. X.poinarii NN4;D. X.bovienii NN6;E. X.cabaniltasii NN7;F. X.bovienii NN8;G. P.luminescens NN11;H. P.temperata NN13;I. X.bovienii NN20.

圖3 16S rDNA擴增片段的電泳檢測Fig.3 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNAA. 16S rDNA的電泳檢測 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA;B. 菌落PCR產(chǎn)物的電泳檢測 Agarose gel electrophoresis of colony PCR products. M. DL5000TM DNA marker.

2.2.2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建基于16S rDNA序列的同源性分析驗證9株共生菌的種屬,NN1為X.nematophila,與X.nematophilastrain ATCC 19061的序列相似度達99%;NN2為X.koppenhoeferi,與X.koppenhoeferistrain USNJ01的序列相似度達99%;NN4為X.poinarii,與X.poinariistrain Iran2的序列相似度達94%;NN6為X.bovienii,與X.bovieniistrain USAR01的序列相似度達99%;NN7為X.cabaniltasii,與X.cabaniltasiistrain USTX62的序列相似度達99%;NN8為X.bovienii,與X.bovieniistrain Kamchatka的序列相似度達99%;NN11為P.luminescens,與P.luminescensstrain VITICRI的序列相似度達94%;NN13為P.temperata,與P.temperatastrain SN187的序列相似度達100%;NN20為X.bovienii,與X.bovieniistrain SLK-1的序列相似度達99%。利用MEGA 7.0的鄰接法構(gòu)建的基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

2.3 共生菌對植物病原真菌菌絲生長的抑制效率

從圖5可知:9株共生菌對植物病原真菌有不同程度的抑菌作用。NN6對Guy2菌絲生長的抑制效率為93.57%,對NBC1和NPC1菌絲生長的抑制效率分別為63.81%和77.31%,對FON1和NFOC1的抑制效率為62.30%和56.12%,優(yōu)于其他測試菌株。NN8與NN6的抑制效率相似,但稍弱于NN6。其余7株共生菌的抑真菌能力較為一致,在對不同真菌的處理中各有優(yōu)勢。將共生菌對真菌的抑制效率劃定為等級范圍,從表1可知,NN6與NN8是綜合抑制效率最高的2株共生菌。

圖5 共生菌對真菌的抑制效率(左)及真菌菌落大小(右)Fig.5 Inhibition rate of symbiotic bacteria on fungi(left)and morphologic of fungal colonies(right)Cuy2. 稻瘟病菌Magnaporthe grisea;FON1. 尖孢鐮刀菌西瓜專化型Fusarium oxysporum f. sp. niveum;NFOC1. 尖孢鐮刀菌黃瓜?；虵usarium oxysporum f. sp. cucu mbrum;NBC1. 灰葡萄孢菌Botrytis cinerea;NPC1. 辣椒疫霉Phytophthora capsici.

表1 9株昆蟲病原線蟲共生菌對5種病原真菌的拮抗作用Table 1 Antagonistic effects of 9 EPN symbiotic strains against 5 pathogenic fungi

2.4 NN6和NN8發(fā)酵液、菌懸液和無菌濾液的稀釋液對真菌的抑制效率

根據(jù)NN6和NN8發(fā)酵液的吸光值測定結(jié)果與其稀釋平板涂布法統(tǒng)計結(jié)果,得出稀釋倍數(shù)與D600、CFU值的對應(yīng)關(guān)系。發(fā)酵原液的D600值為0.820,菌體數(shù)量為2.7×107CFU·mL-1;2倍稀釋液的D600值為0.435,菌體數(shù)量為1.45×107CFU·mL-1;5倍稀釋液的D600值為0.153,菌體數(shù)量為5.13×106CFU·mL-1;10倍稀釋液的D600值為0.058,菌體數(shù)量為1.97×106CFU·mL-1。

9株共生菌發(fā)酵液對5種真菌的拮抗作用測試結(jié)果均高于45%,NN6和NN8的綜合抑制效率最高。為了進一步比較這2株共生菌的生防潛力,將NN6和NN8發(fā)酵液離心過濾,獲得菌懸液和無菌濾液,5倍稀釋液的菌體數(shù)量接近微生物菌劑的常用濃度(5.0×106CFU·mL-1)。

2.4.1 對真菌菌絲生長的抑制效率從圖6可知:NN6和NN8發(fā)酵液、菌懸液和無菌濾液在5倍稀釋后對5種真菌的菌絲生長均有抑制作用。在對Guy2、FON1、NFOC1和NBC1的抑菌試驗中,NN6發(fā)酵液的抑制效率分別為23.25%、16.70%、26.80%和27.50%,NN8發(fā)酵液的抑制效率分別為22.30%、16.15%、23.00%和 23.00%,對同一真菌NN6與NN8發(fā)酵液的抑制效率均無顯著性差異。而在NPC1的抑菌測試中,NN6發(fā)酵液的抑制效率為51.99%,顯著高于NN8(45.46%)。在無菌濾液的抑菌效果對比發(fā)現(xiàn),NN8對NFOC1的抑制效率為18.80%,顯著高于NN6的5.90%,其他處理組無顯著性差異。NN6菌懸液對5種真菌的抑制效率為9.70%～29.87%,NN8菌懸液對5種真菌的抑制效率為10.80%～31.82%。

圖6 菌株NN6和NN8對植物病原真菌菌絲生長的抑制效率Fig.6 Inhibition rate of NN6 and NN8 on mycelium growth of plant pathogenic fungi1、4分別代表NN6和NN8無菌濾液的5倍稀釋液;2、5分別代表NN6和NN8菌懸液的5倍稀釋液;3、6分別代表NN6和NN8發(fā)酵液的5倍稀釋液。1,4 represent 5-fold dilution of sterile filtrate of NN6 and NN8,respectively;2,5 represent 5-fold dilution of bacterial cell suspension of NN6 and NN8,respectively;3,6 represent 5-fold dilution of fermentation broth of NN6 and NN8,respectively.

2.4.2 對鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的相對抑制效率圖7結(jié)果顯示:共生菌的發(fā)酵液和無菌濾液對FON1分生孢子萌發(fā)均有抑制作用(圖7-A),其中NN8發(fā)酵液的抑制效率為82.58%,與NN6發(fā)酵液的抑制效率(83.14%)無顯著差異,而NN8無菌濾液的抑制效率達72.15%,顯著高于NN6無菌濾液(46.69%)。5倍稀釋后,發(fā)酵液與無菌濾液的抑制效果仍然存在,而菌懸液始終無抑制作用。在對NFOC1的抑制試驗中,NN8發(fā)酵液的抑制效率為88.16%,顯著高于NN6發(fā)酵液(81.79%),無菌濾液的抑制效率高于60%,但無顯著差異(圖7-C)。此外,NN8的菌懸液對分生孢子的萌發(fā)也表現(xiàn)出一定的抑制作用,抑制效率達19.19%。

圖7 菌株NN6和NN8對鐮刀菌屬真菌分生孢子萌發(fā)的相對抑制效率Fig.7 Relative inhibition rate of NN6 and NN8 on conidia germination of Fusarium spp.左邊表示抑制效率;右邊表示萌發(fā)狀態(tài)。NN6-5×、NN8-5×分別代表NN6和NN8發(fā)酵液各組分的5倍稀釋液;NN6-1×、NN8-1×分別代表NN6和NN8發(fā)酵液的各組分。The left figures indicate the antifungal efficiency;The right figures indicate the germination status. NN6-5×,NN8-5× represent 5-fold dilution of NN6 and NN8,respectively. NN6-1×,NN8-1× represent 1-fold dilution of NN6 and NN8,respectively.

3 討論

本研究采用3種方法從9種EPN中分離出共生菌,研磨法是比較傳統(tǒng)的分離方法,但由于線蟲IJ時期一般滯育不取食,體外包裹著體鞘,對不良環(huán)境的耐受能力強[28-29],增加了完全磨碎IJ的難度。本研究結(jié)果表明,研磨法分離到的單菌落數(shù)量較少,為了使體表消毒徹底,要從線蟲的卵開始消毒,操作步驟多、繁瑣,耗時。血淋巴涂布法是在線蟲侵染大蠟螟18 h后,于無菌條件下采集大蠟螟的血淋巴液,并劃線接種于NBTA平板。這種方法操作步驟少,不需要太多試劑與器材,但血淋巴液暴露在空氣中會發(fā)生黑化反應(yīng)[30],影響后續(xù)的觀察與單菌落的選擇。本研究在此基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化,增加EPN的侵染時間,待昆蟲被致死后直接從蟲尸中分離共生菌,周期的增長也讓昆蟲體內(nèi)的共生菌大量繁殖并成為優(yōu)勢菌群。結(jié)果表明,該方法高效可行,污染風險低,可為其他昆蟲病原線蟲共生菌的高效分離提供參考。

利用16S rDNA序列信息構(gòu)建9株EPN共生菌的系統(tǒng)進化樹,確定這些共生菌的種屬,共生關(guān)系與前人報道的一致[31-32]?？拐婢囼灲Y(jié)果表明,9株共生菌對5種植物病原菌均有不同的抑菌能力,其中NN6和NN8綜合抑制能力最強。相比YL001和YL002菌株對于稻瘟菌的抑制效率都有顯著優(yōu)勢,相比YL001對尖孢鐮刀菌黃瓜?；偷囊种菩室哺遊33]。Isaacson等[34]研究結(jié)果表明Xenorhabdussp. RIO對灰葡萄孢有較強抑制能力,但對尖孢鐮刀菌無抑制效果。馬麗麗等[35]篩選出的共生菌能抑制番茄葉霉病菌,但不抑制尖孢鐮刀菌。能高效抑制本研究所測試的5種真菌的共生菌并不多見,因此NN6和NN8具有良好的研究價值。

本研究中,NN6和NN8發(fā)酵液、菌細胞懸液和無菌濾液對5種真菌的菌絲生長均有抑制作用,其中無菌濾液的抑菌效果與X.bovieniiSN52、SN269等菌株相似[36]。YL002菌株發(fā)酵液的抑制效率也顯著高于其無菌濾液[10],這表明無菌濾液不是共生菌發(fā)酵液抑制效率的全部來源,但致病桿菌屬和發(fā)光桿菌屬細菌都未被報道具有類似于黏細菌屬的捕食器[37],所以研究菌細胞發(fā)揮抑菌作用的途徑或許需要對細菌表面微觀結(jié)構(gòu)進行進一步的解析。因鐮刀菌孢子可以在植物病殘體上或土壤中越冬[38],其引發(fā)的病害一直難以根除,而NN6和NN8的發(fā)酵液與無菌濾液對鐮刀菌孢子的萌發(fā)抑制均表現(xiàn)出良好效果,對FON1和NFOC1分生孢子的相對抑制效率超過70%,其中NN8對NFOC1的孢子萌發(fā)抑制效果顯著好于NN6。

綜上所述,本研究分離得到的9株共生菌在鐮刀菌等多種植物病原菌的生物防治中具有良好的應(yīng)用前景和開發(fā)價值,X.bovieniiNN6對稻瘟菌、灰葡萄孢和辣椒疫霉的抑制效果最好,而X.bovieniiNN8對尖孢鐮刀菌的生物防治效果最好。