外感風痧顆粒HPLC指紋圖譜研究

劉 云，覃潔萍，劉 雯*，周麗園

(1.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221002；2.廣西中醫(yī)藥大學 藥學院，廣西 南寧 530001)

外感風痧顆粒為國家頒布標準品種、廣西傳統(tǒng)特色優(yōu)勢壯藥，是廣西中醫(yī)藥大學百年樂制藥廠特色品種。外感風痧顆粒由蒼耳草、崗梅、狗仔花、山芝麻、藤苦參、兩面針六味藥材配方而成，具有清熱、祛風的功效，可用于咽喉腫痛、風熱感冒等癥，療效顯著[1]。藥理研究表明外感風痧顆粒具有明顯的抗菌、退熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、增強免疫功能等作用，且毒副作用低，具有很大的臨床應用潛力[2-3]。長期臨床試驗和藥理試驗證明外感風痧顆粒按臨床擬用的劑量、途徑及療程使用安全有效[4-5]。通過查閱相關文獻，對組方中各藥材的成分進行分析，發(fā)現(xiàn)蒼耳草藥材的重要活性成分為酚酸類、蒽醌和黃酮類成分[6-8]；崗梅藥材中含三萜皂苷類、木脂素類、酚酸成分[9-11]；狗仔花中含有苯丙素類、甾體類、脂肪醇類、脂肪酸類成分[12-13]；山芝麻中含有三帖類、萘醌類、山芝麻醌類成分[14-15]；藤苦參中含強心苷類、生物堿類、萜類和酚酸類成分[15-16]；兩面針含有生物堿類、木脂素類、黃酮類、三萜類和酰胺類成分[17-18]。目前已有學者對外感風痧顆粒的薄層鑒別和含量測定進行研究[19]。本課題組先后建立了HPLC同時測定外感風痧顆粒中4種組分[20]及9種組分的方法，本論文在前期研究的基礎上建立了外感風痧顆粒的高效液相色譜指紋圖譜，為完善外感風痧顆粒的質(zhì)量標準提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；UPC-Ⅱ-10T純水儀(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；KQ5200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL-16B高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；PRACTUM224-1CN萬分之一電子分析天平(塞多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 材料

新綠原酸標準品(批號6630)，綠原酸標準品(批號6361)，隱綠原酸標準品(批號3208)，均購于上海詩丹德標準技術服務有限公司，純度≥98.0%。咖啡酸標準品(批號RP190614)，異槲皮苷標準品(批號RP190404)，異綠原酸A標準品(RP180903)，異綠原酸B標準品(批號RP180514)，異綠原酸C標準品(批號RP180704)，均購于成都麥德生科技有限公司，純度≥98.0%。乙腈為色譜純，其余均為分析純。

外感風痧顆粒10個批次均產(chǎn)自廣西中醫(yī)藥大學百年樂制藥廠，批號分別為：20180101、20180402、20180403、20190302、20190303、20190401、20180304、20180401、20190301、20191001。

2 方法與結(jié)果

2.1 外感風痧顆粒供試品溶液的制備

精密稱取外感風痧顆粒粉末(20190303)約10.0 g，置具塞磨口錐形瓶中，精密量取25 mL甲醇加入具塞磨口錐形瓶中，精密稱定并記錄重量，超聲40 min，放涼，再稱定重量，并用甲醇補足減失的重量，搖勻，靜置，將上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對照品各約3 mg，置于8個2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得對照品儲備液。各取對照品儲備液適量置于同一2 mL容量瓶中，加甲醇定容至2 mL，搖勻，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：依利特Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)梯度洗脫，程序見表1；檢測波長330 nm；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密稱取外感風痧顆粒粉末(20190303)約10.0 g，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，連續(xù)進樣6次。記錄圖譜14個共有峰的保留時間和峰面積。以5號峰作為參照峰(S)，計算14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果外感風痧顆粒各色譜峰的相對保留時間RSD<1.3%，各峰相對峰面積RSD<2.3%，說明儀器精密度良好。

表1 梯度洗脫程序

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 精密稱取外感風痧顆粒粉末(20190303)約10.0 g，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件，分別在放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后進樣分析。以5號色譜峰為參照峰(S)，計算14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果外感風痧顆粒各色譜峰的相對保留時間RSD<1.8%，各峰相對峰面積RSD<3.0%，表明該方法制得的外感風痧顆粒供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取外感風痧顆粒粉末(20190303)約10.0 g，平行6份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，以5號峰作為參照峰(S)，計算14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果外感風痧顆粒各色譜峰的相對保留時間RSD<0.1%，各峰相對峰面積RSD<2.8%，表明本實驗所建立的方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

取10批外感風痧顆粒樣品，按“2.1”項下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。將10個色譜圖分別導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(V2012)軟件，以S5號樣品的色譜圖為參照，采用中位數(shù)相關系數(shù)法，設定時間窗為0.1 min，對色譜峰進行多點校正和匹配，建立外感風痧顆粒的指紋圖譜，從中選擇了14個色譜峰作為外感風痧顆粒的共有峰，結(jié)果見圖1。選擇色譜峰形及分離度良好的5號峰作為參照峰，計算14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表2、表3。

取對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣，得到混合對照品溶液色譜圖。結(jié)合紫外光譜信息和混合對照品色譜圖并查閱相關文獻，初步指認出外感風痧顆粒指紋圖譜中8個共有峰，分別為新綠原酸(4號峰)、綠原酸(5號峰)、隱綠原酸(6號峰)、咖啡酸(7號峰)、異槲皮苷(9號峰)、異綠原酸B(10號峰)、異綠原酸A(11號峰)、異綠原酸C(12號峰)，結(jié)果見圖2、圖3。

2.6 相似度評價

將10批外感風痧顆粒的色譜分別導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(V2012)軟件進行相似度評價，結(jié)果其相似度均大于0.9，見表4。結(jié)果表明不同批號的外感風痧顆粒具有良好的相似性。

圖1 10批外感風痧顆粒HPLC疊加圖

表2 10批外感風痧顆粒14個共有峰相對保留時間

表3 10批外感風痧顆粒指紋圖譜共有峰的相對峰面積

圖2 外感風痧顆粒指紋圖譜的對照圖譜(R)

圖3 混合對照品溶液的HPLC色譜

表4 外感風痧顆粒HPLC色譜相似度評價結(jié)果

3 討論

本實驗分別考察了回流提取和超聲提取2種提取方法，考察了提取溶劑、提取時間、料液比，根據(jù)色譜圖的信息量和色譜峰峰面積，最終樣品提取方法確定為：10 g樣品加25 mL甲醇超聲40 min。

本實驗對液相條件進行了優(yōu)化，分別考察了流動相系統(tǒng)、柱溫、流速、檢測波長，以色譜信息量、色譜峰形、峰面積以及相鄰色譜峰的分離度等為指標，最終確定液相色譜條件為：乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)梯度洗脫，柱溫35 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長330 nm。

4 結(jié)論

本文建立了外感風痧顆粒HPLC指紋圖譜，提取了14個共有峰。文中指認了8個共有峰，分別為新綠原酸(4號峰)、綠原酸(5號峰)、隱綠原酸(6號峰)、咖啡酸(7號峰)、異槲皮苷(9號峰)、異綠原酸B(10號峰)、異綠原酸A(11號峰)、異綠原酸C(12號峰)。由相似度評價結(jié)果可知，10批外感風痧顆粒相似度均大于0.9，說明制備工藝合理穩(wěn)定。本實驗所建立的外感風痧顆粒HPLC指紋圖譜分析方法簡單方便、重復性好，可對外感風痧顆粒進行質(zhì)量控制，為外感風痧顆粒質(zhì)量標準的建立和完善提供了一定的科學依據(jù)。