陸地棉轉(zhuǎn)錄因子GhAHL4 基因的克隆及表達(dá)分析

劉萌萌，韓立軍，劉寶玲，薛金愛，李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801）

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors）通過與真核生物基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件相互作用激活或者抑制相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物生長發(fā)育。其本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì)，由4 個(gè)部分組成，包括DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、核定位信號(hào)區(qū)以及寡聚化位點(diǎn)[1]。含有AT-hook 基序的AHL（AT-Hook Motif Nuclear Localized）轉(zhuǎn)錄因子最初是在哺乳動(dòng)物非組蛋白的染色體高移動(dòng)群蛋白HMG-I/Y 中發(fā)現(xiàn)的[2]，現(xiàn)已在多種植物中的DNA 結(jié)合蛋白中鑒定到同源序列。植物AHL 蛋白家族成員含有1 個(gè)或2 個(gè)AT-hook 基序及PPC/DUF296 保守結(jié)構(gòu)域，能改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3]。其中，AT-hook 基序以精氨酸- 甘氨酸- 精氨酸- 脯氨酸（RGRP）為保守殘基[4]，是一種新的DNA 結(jié)合蛋白基序與DNA發(fā)生特異性識(shí)別[5-6]，而PPC 結(jié)構(gòu)域在AHL 蛋白的細(xì)胞核定位中發(fā)揮重要作用[7]。AHL 蛋白既可以彼此之間，也可以與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用共同調(diào)節(jié)植物新陳代謝[8]。

有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥和水稻2 個(gè)模式植物中AHL基因家族主要參與調(diào)控植物開花、根系活力及其生長發(fā)育以及下胚軸的伸長生長等形態(tài)建成過程，如擬南芥中超表達(dá)AHL27基因[9]，可抑制開花基因FT的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)FLC 的表達(dá)，進(jìn)而延遲擬南芥在長日和短日條件下的開花時(shí)間；在種子萌發(fā)過程中，AtAHL4基因表達(dá)抑制編碼TAG 脂酶和β- 氧化相關(guān)基因SDP1、DALL5、KAT5的表達(dá)，從而調(diào)控植物體內(nèi)TAG 的降解[10]；AtAHL18通過調(diào)節(jié)根尖分生組織的活動(dòng)、側(cè)根的起始和出苗來參與根系結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)[11]；AtAHL27/29基因能夠抑制光照下幼苗的下胚軸伸長[12]。此外，AHL 在植物非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。例如，水稻OsAHL1基因的過表達(dá)可顯著提高水稻的抗旱性[13]；玉米全基因組鑒定表明，ZmAHLs主要調(diào)節(jié)植物的花粉發(fā)育、干旱響應(yīng)、衰老和創(chuàng)傷響應(yīng)過程[14]。含有AT-hook motif 基序的GhAT1 蛋白，能夠特異性結(jié)合棉花FSltp4基因的啟動(dòng)子，抑制FSltp4基因的表達(dá)，從而使棉纖維的生長受到嚴(yán)重影響[15]。由此可見，不同植物的AHL 及其成員所行使的生物學(xué)功能不同，目前僅有少數(shù)AHL 蛋白被發(fā)現(xiàn)，這個(gè)家族的其他成員仍有待進(jìn)一步研究。

棉花（Gossypium hirsutum）種植規(guī)模較大，棉籽油作為棉花生產(chǎn)的副產(chǎn)品，是植物油的來源之一，同時(shí)也是制備生物柴油的天然原料。然而，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，環(huán)境脅迫通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而使得棉花的生長和產(chǎn)量受到嚴(yán)重限制[16]。為了適應(yīng)環(huán)境因素的變化，植物自身能夠形成一些機(jī)制抵御逆境脅迫。在逆境條件下，植物可感知非生物脅迫信號(hào)產(chǎn)生防御調(diào)控機(jī)制以應(yīng)對(duì)外界不良環(huán)境。

為進(jìn)一步解析棉花抵御非生物脅迫的AHL 表達(dá)模式，本研究以冀豐1271 棉花品種為材料，克隆陸地棉GhAHL4基因，采用生物信息學(xué)工具分析其編碼蛋白理化性質(zhì)，用RT-qPCR 分析該基因在鹽脅迫處理下的表達(dá)模式，旨在為深入解析棉花GhAHL4基因的生物學(xué)功能提供科學(xué)參考，并為培育抗非生物脅迫能力強(qiáng)的棉花新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

陸地棉冀豐1271 種子、大腸桿菌DH5α 菌株、pMD18-T 載體均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所提供。供試陸地棉材料于2020 年春種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站試驗(yàn)田。

1.2 陸地棉AHL4 基因克隆

根據(jù)已報(bào)道的擬南芥AtAHL4基因的蛋白序列，利用BlastP 搜索棉花基因組數(shù)據(jù)庫CottonFGD（https://cottonfgd.org/），篩選棉花AHL4候選同源基因，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和各種脅迫處理表達(dá)譜數(shù)據(jù)，最終鑒定獲得在非生物脅迫中上調(diào)表達(dá)的GhAHL4基因，并下載其基因序列。

使用Plant Total RNA Kit 提取棉花葉片的總RNA，使用ABM 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒5×All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，克隆陸地棉GhAHL4基因。以棉花葉片cDNA 為模板，采用天根公司的高保真酶Pfu DNA Polymerase 進(jìn)行PCR 反應(yīng)。20 μL 反應(yīng)體系：10×Pfu Buffer 2 μL、dNTP Mix（2.5 mmol/L）1.6 μL、Pfu DNAPolymerase0.5 μL、上下游引物（表1）各0.5 μL、cDNA 模板2 μL、RNase-free H2O 12.9 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，割膠回收目的條帶，然后連接到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆后送上海生工有限公司測(cè)序。

表1 引物序列

1.3 陸地棉GhAHL4 基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)ProParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析陸地棉GhAHL4 編碼氨基酸的數(shù)目、蛋白的分子質(zhì)量以及理論等電點(diǎn)、脂肪系數(shù)及穩(wěn)定性等理化性質(zhì)；利用TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 3.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）對(duì)氨基酸序列進(jìn)行跨膜及信號(hào)肽分析；用在線分析工具LocTree 3（https://rostlab.org/services/loctree3/） 預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。采用SPOMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）在線分析軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）對(duì)GhAHL4 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模分析；運(yùn)用在線分析軟件Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游長度為2 000 bp 啟動(dòng)子的序列進(jìn)行分析，并對(duì)順式作用元件在GSDS 2.0 進(jìn)行可視化體現(xiàn)；利用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)GSDS 分析GhAHL4 基因外顯子、內(nèi)含子數(shù)量，繪制基因結(jié)構(gòu)圖；用ClustalX 和GeneDOC 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并分析其保守結(jié)構(gòu)域；基于鄰接法（neighbor-joining，NJ）采用MEGA 7.0 構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 陸地棉GhAHL4 基因表達(dá)分析

利用CottonFGD（https://cottonfgd.org/）下載陸地棉GhAHL4 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過構(gòu)建Heatmap 圖綜合分析該基因的表達(dá)情況。

冀豐1271 號(hào)種子脫絨后直接播種于滅菌蛭石中，待幼苗長至2 片真葉時(shí)，選取長勢(shì)一致的幼苗，將根部的蛭石經(jīng)流水沖洗干凈，快速置于吸水紙上吸干，將棉苗的根部浸入200 mmol/L NaCl 溶液中，置于（25±2）℃培養(yǎng)箱，連續(xù)光照條件下生長，分別于0、1、3、6、12、24、48、72 h 采集真葉葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以棉花histone 基因作為內(nèi)參，使用TaKaRa 公司的TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)總體系為10 μL：TB Green Premix Ex Taq II 5 μL、上下游引物（表1）各0.4 μL、cDNA 模板0.8 μL、RNasefree H2O 3.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃5 min；95 ℃5 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因的相對(duì)表達(dá)量分析[17]。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉GhAHL4 基因的克隆及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

根據(jù)已報(bào)道的擬南芥AtAHL4基因的蛋白序列，利用BlastP 搜索棉花基因組數(shù)據(jù)庫CottonFGD，篩選棉花AHL4同源基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在A亞組、D 亞組均有拷貝，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和各種脅迫處理表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)只有D 亞組GhAHL4差異表達(dá)顯著，最終鑒定獲得在非生物脅迫中上調(diào)表達(dá)的GhAHL4基因。以冀豐1271 陸地棉葉片的cDNA為模板，克隆到GhAHL4基因cDNA 全長為984 bp（圖1），與基因組所注釋的該基因編碼序列存在部分堿基差異，但蛋白序列一致。

理化性質(zhì)分析表明，GhAHL4基因編碼327 個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為9.44，分子質(zhì)量約33.74 ku，不穩(wěn)定系數(shù)為50.1，脂肪系數(shù)為68.56，親水性系數(shù)為-0.353，據(jù)此推測(cè)，GhAHL4 蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)[18-19]。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其定位于細(xì)胞核中，預(yù)測(cè)可信度為84，無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，屬于一種非分泌型蛋白。

2.2 陸地棉GhAHL4 基因的結(jié)構(gòu)分析

采用SOPMA 在線預(yù)測(cè)GhAHL4 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示（圖2），GhAHL4 蛋白結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲（Random coil）和延伸鏈（Extended strand）為主，分別占68.20%和23.85%。通過在線軟件SWISS-MODEL對(duì)GhAHL4 蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析與同源建模，以2dt4.1.A[8]蛋白（a plant-and prokaryote-conserved（PPC）protein inPyrococcus horikoshii）為模板，該蛋白與棉花GhAHL4 蛋白氨基酸序列相似性為29%，包含3 個(gè)GOL 配體（圖3）。

利用GSDS 2.0 在線檢測(cè)GhAHL4基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該基因含有5 個(gè)外顯子、4 個(gè)內(nèi)含子（圖4）。

為探究該基因是否可能受逆境脅迫調(diào)控，進(jìn)一步分析GhAHL4基因上游啟動(dòng)子序列，結(jié)果顯示（圖5），GhAHL4基因啟動(dòng)子含有多個(gè)參與植物響應(yīng)非生物脅迫的順式作用元件，響應(yīng)脫落酸脅迫的ABRE 元件、響應(yīng)光反應(yīng)的G-box 及低溫響應(yīng)元件LTR。

2.3 陸地棉GhAHL4 蛋白的序列比對(duì)和進(jìn)化分析

多序列比對(duì)顯示，GhAHL4 蛋白與木槿HsAHL4（KAE8694315.1）、榴蓮DzAHL4（XP_022719610.1）、蓖麻RcAHL4（XP_002509630.1）、大豆GmAHL4（XP_003525779.1） 的同源蛋白的序列相似性分別為86.54%、84.89%、75.45%和73.09%（圖6）。為了明確陸地棉GhAHL4 與其他植物AHL 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系，利用MEGA 7.0 軟件對(duì)GhAHL4 和其他植物AHL 蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)化分析結(jié)果表明（圖7），GhAHL4 除與亞洲棉GaAHL蛋白外，與木槿HsAHL4（KAE8694315.1）的親緣關(guān)系最近。

2.4 GhAHL4 在不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

陸地棉GhAHL4在不同組織及不同脅迫中的表達(dá)情況如圖8 所示，該基因在根中表達(dá)量最低，在雄蕊中高表達(dá)；冷脅迫及干旱脅迫處理3 h 時(shí)GhAHL4基因表達(dá)量最高，之后隨著脅迫時(shí)間的延長表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，而在鹽脅迫條件下該基因的表達(dá)量在12 h 內(nèi)持續(xù)升高。

為進(jìn)一步分析GhAHL4基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式，用200 mmol/L NaCl 脅迫處理2 片真葉的棉花幼苗，探究脅迫處理0、1、3、6、12、24、48、72 h時(shí)的GhAHL4差異表達(dá)，結(jié)果顯示，處理0～3 h 棉花GhAHL4基因的表達(dá)量沒有發(fā)生顯著變化；在處理6～48 h 時(shí)間內(nèi)，其表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，48 h 時(shí)表達(dá)量最高，約為CK 的6 倍，且二者間差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；處理48 h 后，表達(dá)量開始下調(diào)（圖9）。表明棉花GhAHL4基因參與棉花幼苗對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答。

3 結(jié)論與討論

AHL 蛋白作為一類DNA 結(jié)合蛋白，在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。目前，在花生[20]、番茄[21]以及模式植物擬南芥[22-23]和水稻[24]中有關(guān)AHL 蛋白的研究較為深入。棉花作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，有關(guān)其AHL蛋白功能研究鮮見報(bào)道。本研究克隆了陸地棉GhAHL4基因，含有5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子，而大豆GmAHL4基因卻不含內(nèi)含子[25]，由此可見，不同AHL基因的結(jié)構(gòu)存在很大的差異。編碼蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，這與前人研究AHL 蛋白大多定位于細(xì)胞核的結(jié)果基本一致[15]，且包含3 個(gè)GOL 配體（三羥基糖醇，作為碳水化合物和脂質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物），可能參與脂肪酸生物合成。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，陸地棉GhAHL4蛋白存在AT-hook 結(jié)構(gòu)域的保守殘基KKKRGRP，這與擬南芥AtAHLs 蛋白結(jié)構(gòu)一致[4]，可能通過與下游靶基因的DNA 結(jié)合從而參與其表達(dá)調(diào)控。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，GhAHL4 蛋白與同科的亞洲棉及木槿聚為一支，因?yàn)殛懙孛夼c亞洲棉及木槿同為錦葵科植物，這也與經(jīng)典植物分類的結(jié)論一致。

GhAHL4基因上游啟動(dòng)子包含了與光響應(yīng)有關(guān)的元件G-box、赤霉素應(yīng)答元件GAREAT、脫落酸應(yīng)答相關(guān)元件ABRE 等，以及低溫響應(yīng)元件LTR，這與毛果楊PtrAHL6、PtrAHL18、PtrAHL24啟動(dòng)子中含有脫落酸響應(yīng)及低溫響應(yīng)等順式作用元件結(jié)構(gòu)相似[26]。不同脅迫下基因表達(dá)模式進(jìn)一步表明，GhAHL4可能參與逆境環(huán)境脅迫應(yīng)答。RT-qPCR結(jié)果顯示，NaCl 脅迫下GhAHL4基因表達(dá)量上調(diào)，這與丁麗雪等[21]在番茄中發(fā)現(xiàn)的部分AHL基因受鹽脅迫誘導(dǎo)結(jié)果相似，而OsAHL1的過表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)鹽脅迫的耐受性[13]。表達(dá)量在48 h 內(nèi)持續(xù)升高預(yù)示著該基因參與棉花幼苗鹽脅迫應(yīng)答，基因過表達(dá)可能增強(qiáng)了棉花對(duì)逆境的適應(yīng)性，因此可作為棉花抗逆機(jī)制研究和棉花抗逆遺傳改良的候選目的基因。但GhAHL4基因具體如何介導(dǎo)棉花抵御鹽脅迫等逆境應(yīng)答的調(diào)控網(wǎng)路還有待進(jìn)一步論證。

本研究以擬南芥AtAHL4 蛋白序列為參考序列，鑒定得到了棉花GhAHL4基因，通過生物信息學(xué)技術(shù)分析了基因結(jié)構(gòu)和編碼蛋白結(jié)構(gòu)及理化特性，通過RT-qPCR 基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，GhAHL4基因的表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo)，結(jié)果為進(jìn)一步闡明棉花GhAHL4基因的生物學(xué)功能以及基因工程育種研究奠定了基礎(chǔ)。