零陵香總黃酮提取工藝優(yōu)化

唐 森， 楊舒茵， 謝濟運， 吳國勇， 張 鵬*

（1.廣西科技師范學院食品與生化工程學院，廣西來賓546199；2.廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室，廣西來賓546199；3.廣西科技師范學院實驗實訓中心，廣西來賓546199）

零陵香為報春花科植物零香草的干燥全草，又稱為靈香草、香草、排草、佩蘭等。主產(chǎn)于廣西金秀、融水等地，始載于《嘉佑本草》，味屬辛、甘（張智圓等，2013）。水煎液具有祛風解表、行氣止痛的功能，多用于頭痛鼻塞、胸悶腹脹、齒痛等癥狀（周博，2011）。由于零陵香具有香氣，以往對其化學成分的研究多集中于石油醚、乙酸乙酯、乙醚、甲醇等脂溶性部位，報道成分種類以脂肪酸、黃酮苷、三萜為主（唐雪陽等，2017；閆旭宇等，2017；樓鳳昌等，1989）。 但對于零陵香總黃酮提取工藝鮮有研究。本研究采用微波輔助提取零陵香總黃酮，以期通過響應面分析法將零陵香總黃酮提取工藝得到最大優(yōu)化，提高零陵香原料的利用率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 零陵香，購于亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司， 經(jīng)廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室鑒定為零陵香； 蘆?。ǔ儯?，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫均為分析純，西隆科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備 FW135 型中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；FA2004B 型電子分析天平，上海越平科學儀器有限公司；XH-MC-1 型祥鵠微波合成反應儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；KQ-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器， 昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水多用真空泵，鞏義市科瑞儀器有限責任公司；C-20 型玻璃儀器氣流烘干器，上海貝侖儀器設備有限公司；UV-9600型紫外/可見分光光度計，北京北分瑞利分析儀器（集團）公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線 參照王宗成等（2016）的方法，以蘆丁為標準品，采用NaNO2—Al（NO3）3—NaOH法測定蘆丁含量并繪制標準曲線，Y=11.966X-0.0096，R2=0.9993，表明線性關(guān)系良好。

1.3.2 零陵香總黃酮的提取及測定 用電子天平準確稱取1.00 g 零陵香粉末至于圓底三頸燒瓶中，加入一定體積分數(shù)的乙醇作為溶劑，用篩子塞住瓶口，浸泡30 min。 按照試驗方案調(diào)整相應的液料比、微波時間、微波功率、乙醇體積分數(shù)進行提取，待樣液冷卻至室溫后，進行真空抽濾，再移至容量瓶定容， 得到試驗待測溶液。 精密移取2 mL 供試品稀釋溶液至10 mL 具篩比色管中，加入5% NaNO20.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%Al（NO3）30.3 mL，搖 勻，靜 置6 min，加 入10%NaOH 3.0 mL，搖勻，靜置15 min。 用分光光度計在最大吸收波長（510 nm）處測定吸光度值（A）。計算零陵香黃酮得率。 將吸光度（A）代入，得到蘆丁回歸方程， 可得測定的供試品稀釋溶液的黃酮濃度（C），再計算出樣品中黃酮得率：

式中：C為稀釋后提取液中黃酮含量，mg/g；V為提取液體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；M 為植物粉末質(zhì)量，g；B 為吸取測定體積，mL。

1.3.3 黃酮提取的單因素試驗 乙醇體積分數(shù)：稱取零陵香粉末1.00 g 于三頸圓底燒瓶中，依次加入50 mL 乙醇體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%和90%的乙醇，浸泡30 min。設定微波溫度為60 ℃，微波時間為6 min，微波功率為600 W，進行微波提取零陵香總黃酮。

微波時間：稱取零陵香粉末1.00 g 于三頸圓底燒瓶中， 加入50 mL 體積分數(shù)為70%的乙醇，浸泡30 min。 設定微波溫度為60 ℃，微波時間分別為6、9、12、15、18、21 min， 微波功率為600 W，進行微波提取零陵香總黃酮。

微波功率：稱取零陵香粉末1.00 g 放入250 mL三頸圓底燒瓶中，加入50 mL 體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，浸泡30 min。 設定微波溫度為60 ℃，微波時間分別為15 min， 微波功率為300、400、500、600、700 W，進行微波提取零陵香總黃酮。

液料比：稱取1.00 g 零陵香粉末，分別加入液料比為40：1、50：1、60：1、70：1、80：1（mL/g），體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，浸泡30 min。 設定微波溫度為60 ℃，微波時間分別為15 min，微波功率為600 W，進行微波提取零陵香總黃酮。

1.4 響應面法優(yōu)化試驗設計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果， 分別選取相應的單因素： 乙醇體積分數(shù)（A）、微波時間（B）、微波溫度（C）和液料比（D）為自變量（X），零陵香總黃酮含量為響應值（Y），再由Box-Behnken 的原理，設計4 因素3 水平的中心響應面試驗，其中心點為最佳工藝條件，以此得到提取零陵香總黃酮的最優(yōu)得率， 試驗的響應面因素與水平見表1。

表1 響應面因素水平設計

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對零陵香總黃酮得率的影響由圖1 可見，隨著乙醇體積分數(shù)的提高，黃酮類化合物的得率不斷升高。 乙醇體積分數(shù)為60% ～70%時，趨勢最陡，黃酮得率變化最快。 但乙醇體積分數(shù)超過70%以后，黃酮得率逐漸平緩且呈下降趨勢。 這是由于高濃度的乙醇造成了蛋白質(zhì)的下降，使黃酮無法浸出，得率下降。另一方面，當乙醇體積分數(shù)提高時，溶液的顏色加深，零陵香樣品里的色素也因此被提取出來（楊帆等，2018）。綜合考慮零陵香總黃酮得率、能量資源消耗等因素，以乙醇體積分數(shù)為70%的溶液作零陵香總黃酮的最佳提取條件。

圖1 乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響

2.1.2 微波時間對零陵香總黃酮得率的影響 由圖2 可知，零陵香總黃酮得率在微波時間為15 min時達最大值。 提取時間小于15 min 時，黃酮得率隨時間的延長呈上升趨勢，物質(zhì)的熱運動加快，使零陵香總黃酮能夠更容易被提取出來。 但微波時間超過15 min 后，黃酮得率逐漸下降。 黃酮在高溫條件下易發(fā)生氧化，提取時間過長，使黃酮得率反而降低；加熱時間過短時，溫度較低，不利于黃酮的提取（艾薇等，2018）。綜合考慮零陵香總黃酮得率和能量資源消耗等因素，以微波時間為15 min作零陵香總黃酮的最佳提取條件。

圖2 微波時間對黃酮得率的影響

2.1.3 微波功率對零陵香總黃酮得率的影響 由圖3 可知，微波功率為600 W 時，零陵香總黃酮得率達最大值。 微波功率為300～600 W 時，黃酮得率隨著微波功率的加大而升高，600 W 以后呈現(xiàn)下降趨勢。 微波功率是微波能量的直接體現(xiàn)，在合適的微波功率范圍內(nèi)， 微波功率越大破壁效果越好。過大的微波功率雖然在初期有利于零陵香總黃酮的溶出，但是隨后會產(chǎn)生局部過熱現(xiàn)象，破壞黃酮的結(jié)構(gòu)。 故選擇600 W 的微波功率為最佳條件。

圖3 微波功率對黃酮得率的影響

2.1.4 液料比對零陵香總黃酮得率的影響 由圖4 可知，料液比為40 ～ 60 mL/g 時，黃酮得率隨著液料比的增大而增大，60 mL/g 時黃酮得率最高。液料比小， 零陵香總黃酮在乙醇溶劑中的傳質(zhì)速率慢，得率小；綜合考慮得率和能源消耗等因素，選擇60 mL/g 為最佳液料比。

圖4 液料比對黃酮得率的影響

2.2 響應面法優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 試驗設計與結(jié)果 結(jié)合單因素試驗得到的數(shù)據(jù)，確定乙醇體積分數(shù)（A）、微波時間（B）、微波功率（C）和液料比（D）4 個因素，以零陵香總黃酮得率（Y）為指標，設計5 個中心點，即A、B、C、D四個因素的水平均為“0”的重復試驗，具體設計如表2。 在Design expert 軟件進行回歸分析，計算得零陵香總黃酮得率（Y）對乙醇體積分數(shù)（A）、微波時間（B）、微波功率（C）和液料比（D）的二元多項回歸方程：Y=18.25+0.50A+0.095B+0.16C+0.10D+0.42AB +0.18AC +0.027AD -0.047BC -0.18AC -0.027AD-0.65A2-0.33B2-0.4C2-0.095D2。

由表3 分析結(jié)果可知，R2=0.9720， 表明響應值總黃酮得率的實際值與預測值之間的擬合度較高， 可以用來預測和優(yōu)化零陵香總黃酮提取的工藝條件， 試驗方法可信度較大。 而試驗模型的P值＜0.0001，表明該模型回歸有極顯著差異；且失擬值P=0.0741（即P ＞0.05），差異不顯著，建立模型數(shù)據(jù)成立。

由響應面分析結(jié)果中二次回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗可知，一次項A（F=173.58）、二次項A2（F=158.37）、B2（F=41.30）、C2（F=61.06）和交互項AB（F=40.26）對試驗結(jié)果有極顯著性影響。 一次項B、C、D 和交互項AC、BD、CD 有顯著性影響。綜合以上因素分析， 表明考察因素對零陵香總黃酮的得率存在交互綜合影響作用。 比較F 值大小可反映出各因素對指標的影響規(guī)律， 一次項影響零陵香總黃酮得率的主次因素為：A＞C＞D＞B，即乙醇體積分數(shù)＞微波功率＞液料比＞微波時間；交互項影響零陵香總黃酮得率的主次因素為：AB＞CD＞BD＞AC＞BC＞AD； 二次項影響零陵香總黃酮得率的主次因素為：A2＞C2＞B2＞D2， 即乙醇體積分數(shù)＞微波功率＞微波時間＞液料比。

表2 響應面試驗設計與結(jié)果

2.2.2 等高線圖和響應面分析 運用Design-Expert8.0.6 軟件對零陵香總黃酮得率響應值分析作圖， 得到由響應值A(chǔ)、B、C、D 四個因素所構(gòu)成的三維空間圖及其三維空間在二維平面上的等高線圖。響應面坡度相對平緩，表明可以忍受處理條件的變異， 等高線圖中同一橢圓形區(qū)域內(nèi)表示得率相同，中心越高，越向邊緣擴散越低，且橢圓曲線排列越緊密表明該因素對總黃酮得率影響越大。 同時，等高線越接近圓形，說明兩因素交互作用越弱，越接近橢圓形，交互作用越顯著。 分析結(jié)果見圖5 ～ 10。

表3 響應面方差分析結(jié)果

由圖5 可知，乙醇體積分數(shù)和微波時間的3D響應面圖坡度較為陡峭， 表明響應值對這兩種工藝條件的改變較為敏感， 等高線圖中的等高線接近橢圓形， 說明乙醇體積分數(shù)和微波時間交互作用對零陵香總黃酮得率的作用效果更強。

圖6 中3D 響應面圖坡度相較于圖5 更為平緩，等高線圖也更接近圓形。表明在提取零陵香總黃酮的試驗中， 乙醇體積分數(shù)和微波功率的交互作用比乙醇體積分數(shù)和微波時間交互作用的顯著性更弱。

在圖7 的三維響應面圖中， 清晰的看到當乙醇體積分數(shù)固定時， 黃酮含量的趨勢呈直線型遞增，數(shù)值變化較??；當液料比固定時，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，黃酮得率變化較大且出現(xiàn)最大值。其等高線圖接近圓形， 因此乙醇體積分數(shù)和液料比的作用效果不顯著。

圖5 總黃酮得率隨乙醇體積分數(shù)和微波時間變化的響應面與等高線圖

結(jié)合圖8 的兩個圖可直觀地看出， 隨著微波功率的加大和微波時間的延長， 黃酮得率都呈現(xiàn)遞增趨勢，但兩個因素的交互作用，使黃酮得率先增大后減小，響應面的坡度較為平緩，黃酮得率變化不大。 另這兩個因素的等高線圖趨近于圓形，所以微波時間和微波功率的交互作用對零陵香總黃酮得率的影響不顯著。

從圖9 可知， 液料比和微波時間的交互作用影響，黃酮得率先增大后減小，等高線圖呈現(xiàn)橢圓狀，表明液料比和微波時間的作用效果顯著。

圖6 總黃酮得率隨乙醇體積分數(shù)和微波功率變化的響應面與等高線圖

從圖10 中的三維響應面圖可以看出，微波功率的黃酮含量變化大于液料比； 其等高線圖呈橢圓形，說明微波功率和液料比的交互作用顯著，且微波功率的顯著性大于液料比。

2.3 最佳條件的預測以及驗證試驗 運用計算機軟件分析，預測出的最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)74.52%， 微波時間17.39 min， 微波功率588.66 W，液料比68.41 mL/g，黃酮含量為18.51 mg/g，即黃酮得率為1.851%。 綜合考慮試驗結(jié)果、儀器條件和經(jīng)濟成本， 確定零陵香總黃酮最佳提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)75%， 微波時間17 min，微波功率600 W，液料比68 mL/g。 通過3 次平行驗證試驗， 提取得到的零陵香黃酮含量為18.29 mg/g，即黃酮得率為1.829%。與預測值相差1.18%。 實際值與預測值非常接近，說明采用響應面方法得到的回歸模型，結(jié)果真實可信。

圖7 總黃酮得率隨乙醇體積分數(shù)和液料比變化的響應面與等高線圖

圖8 總黃酮得率隨微波功率和微波時間變化的響應面與等高線圖

圖9 總黃酮得率隨微波時間和液料比變化的響應面與等高線圖

圖10 總黃酮得率隨微波功率和液料比變化的響應面與等高線圖

3 結(jié)論

本試驗最終優(yōu)化得到零陵香總黃酮提取的最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)75%，微波時間17 min，微波功率600 W，液料比68 mL/g。 并且所得到的工藝條件參數(shù)可行性強，重復性好。