飼糧中添加枸杞多糖對(duì)斷奶大鼠生長性能、抗氧化能力、腸黏膜免疫功能以及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

尹業(yè)鑫 王 芳 余東明 王 鑫 符晨星 陳家順，2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)基因組與種質(zhì)創(chuàng)新研究中心，長沙 2410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 2410125)

隨著畜牧業(yè)集約化、規(guī)?；陌l(fā)展，為減少畜禽疾病的發(fā)生，抗生素被大批量使用。抗生素雖然能起到殺菌，提高機(jī)體免疫力、暫時(shí)降低疾病的發(fā)生率等作用，但同時(shí)也導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等問題。因此，世界各地已限制使用抗生素，在我國，2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194號(hào)公告，自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種。因此，開發(fā)健康、無污染的綠色抗生素替代物迫在眉睫。枸杞是我國傳統(tǒng)的中藥材，富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分，其中枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)具有調(diào)節(jié)免疫[1-2]、抗癌[3]、抗炎[4-5]、抗氧化[6-7]及護(hù)肝[8-10]等多種藥理學(xué)功能，具有開發(fā)成抗生素替代物的潛力，其在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用備受關(guān)注。譚連杰等[11]研究表明，在飼料中添加1 g/kg LBP可以提高卵形鯧鲹的抗氧化能力及免疫能力。Liu等[12]研究表明，在飼糧中添加4 g/kg LBP可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，提高21日齡肉雞免疫器官指數(shù)，促進(jìn)肉雞的生長性能。Long等[13]研究表明，在飼糧中添加2 g/kg LBP可以增強(qiáng)肉雞消化酶活性、抗氧化能力、免疫力，進(jìn)而提高其生長性能。目前，關(guān)于LBP對(duì)動(dòng)物腸道健康的影響至今尚未明確。鑒于此，本試驗(yàn)擬以斷奶大鼠為研究對(duì)象，通過在飼糧中添加LBP，探究其對(duì)生長性能、抗氧化能力、腸黏膜免疫功能及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以期為LBP應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)，改善動(dòng)物腸道健康、促進(jìn)動(dòng)物生長提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

LBP有效含量為60%，購自于陜西某生物制品有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取體重接近的健康雄性SD大鼠(4周齡)20只，按體重接近的原則隨機(jī)分成2組(每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只)，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對(duì)照組)和在基礎(chǔ)飼糧中添加4 g/kg LBP的試驗(yàn)飼糧(LBP組)，試驗(yàn)期為28 d?；A(chǔ)飼糧參考AIN-93G大鼠純化飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營養(yǎng)水平如表1所示。飼養(yǎng)試驗(yàn)在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)教學(xué)科研基地完成，試驗(yàn)大鼠采用單籠飼養(yǎng)，采用自由飲食、自然采光等常規(guī)飼養(yǎng)管理。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content粗脂肪 Crude fat6.00碳水化合物 Carbohydrate64.65

1.3 樣品采集

對(duì)全部大鼠依次進(jìn)行眼球摘除采血。采集的血樣靜置30 min后，4 ℃下4 000 r/min離心15 min制備血清，-80 ℃保存。采血后將大鼠處死并解剖，分離并取空腸腸段3 cm置于4%甲醛溶液中固定；取空腸黏膜，液氮暫存，之后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長性能

每只大鼠作為1個(gè)單位。試驗(yàn)第1天對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，作為初始體重；第28天進(jìn)行第2次稱重，作為終末體重。記錄每次飼喂量及最后剩料重，計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)。

1.4.2 空腸黏膜和血清中抗氧化指標(biāo)

參考湯俊等[14]的方法對(duì)組織樣品進(jìn)行前處理?？漳c黏膜和血清中總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量均采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，操作步驟參考試劑盒說明書。

1.4.3 空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)

取出4%甲醛溶液固定的腸道組織，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后[15]，利用Motic Images Advanced 3.2軟件，測(cè)量空腸黏膜隱窩深度和絨毛高度，每張切片觀察10個(gè)視野。計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.4.4 空腸黏膜細(xì)胞因子含量

空腸黏膜中白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量均采用ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司，操作步驟參考試劑盒說明書。

1.4.5 空腸黏膜免疫球蛋白含量

空腸黏膜中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白(IgM)含量均采用ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司，操作步驟參考試劑盒說明書。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2013進(jìn)行初步處理，然后用軟件SPSS 20.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加LBP對(duì)斷奶大鼠生長性能的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，LBP組ADG提高了16.3%(P<0.05)，ADFI與F/G無顯著變化(P>0.05)。

表2 飼糧中添加LBP對(duì)斷奶大鼠生長性能的影響

2.2 飼糧中添加LBP對(duì)斷奶大鼠空腸黏膜和血清中抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，LBP組血清中T-AOC與GSH-Px活性分別提高了52.8%(P<0.05)和67.5%(P<0.05)，MDA含量降低了31.7%(P<0.05)；LBP組空腸黏膜中T-AOC提高了99.1%(P<0.05)，MDA含量降低了13.7%(P<0.05)，GSH-Px活性無顯著變化(P>0.05)。

表3 飼糧中添加LBP對(duì)斷奶大鼠空腸黏膜和血清中抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 飼糧中添加LBP對(duì)斷奶大鼠空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，LBP組空腸的絨毛高度與隱窩深度無顯著變化(P>0.05)，但V/C提升了21.4%(P<0.05)。

表4 飼糧添加LBP對(duì)斷奶大鼠空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.4 飼糧中添加LBP對(duì)斷奶大鼠空腸黏膜中細(xì)胞因子含量的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，LBP組空腸黏膜中IL-2與IL-10含量分別上升了31.6%(P<0.05)和66.0%(P<0.05)，IL-6含量無顯著變化(P>0.05)。

表5 飼糧中添加LBP對(duì)斷奶大鼠空腸黏膜中細(xì)胞因子含量的影響

2.5 飼糧中添加LBP對(duì)斷奶大鼠空腸黏膜中免疫球蛋白含量的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，LBP組空腸黏膜中IgA與IgG含量分別提升了33.7%(P<0.05)和35.1%(P<0.05)，IgM含量無顯著變化(P>0.05)。

表6 飼糧添加LBP對(duì)斷奶大鼠空腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

3 討 論

動(dòng)物生長性能是實(shí)際生產(chǎn)中關(guān)注的焦點(diǎn)之一，一般從試驗(yàn)動(dòng)物的ADG與F/G中體現(xiàn)，反映動(dòng)物生長發(fā)育情況。近年來，大量研究表明，LBP可提高斷奶仔豬[16]、肉仔雞[17]、育肥羊[18]等動(dòng)物的生長性能。本試驗(yàn)中，飼糧中添加LBP顯著提高了斷奶大鼠的ADG，表明LBP提高了斷奶大鼠的生長性能，與前人的研究結(jié)果一致，其促生長作用的原因可能是：1)LBP可改善機(jī)體腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，促進(jìn)腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收[19]；2)LBP可增加腸道抗氧化物酶的活性，清除氧自由基，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高組織抗氧化能力[20-21]；3)LBP可以提高腸道的免疫性能，促進(jìn)免疫細(xì)胞分化增殖及細(xì)胞因子的合成分泌[22]。

腸道對(duì)于維持和改善機(jī)體健康至關(guān)重要，其中，腸道的抗氧化功能與維持腸道健康息息相關(guān)。MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其含量可以反映機(jī)體的氧化水平和自由基攻擊的程度[23]。對(duì)應(yīng)的，機(jī)體內(nèi)會(huì)有抗氧化酶系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、GSH-Px等，它們互相協(xié)作使自由基在體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡，其活性可以反映機(jī)體清除自由基的能力。Wu等[24]研究表明，給小鼠進(jìn)行LBP灌喂干預(yù)后，能夠清除其體內(nèi)的氧自由基，防止脂質(zhì)過氧化，有效提高組織抗氧化能力。Yang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，LBP能抑制多形核中性粒細(xì)胞(PMN)的積累和細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)，增加腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，活化核因子(NF)-κB，引起腸道通透性和組織學(xué)變化，提高抗氧化酶活性，減少腸道氧化損傷。Ren等[26]研究發(fā)現(xiàn)，LBP可以提高腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加LBP可提高斷奶大鼠空腸黏膜與血清中T-AOC及血清GSH-Px活性，降低空腸黏膜與血清中MDA含量，能夠有效清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，提高斷奶大鼠機(jī)體的抗氧化能力。因此，LBP可能是通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶的活性，減少腸道氧化損傷，提高腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而改善動(dòng)物的生長性能。

腸道黏膜的免疫系統(tǒng)可以防止細(xì)菌或者病毒等微生物入侵影響腸道健康，是機(jī)體的第1道防線。而腸道黏膜的免疫功能主要是免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子在發(fā)揮作用。其中，IL-2具有刺激B淋巴細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子等功能[27]；IL-6能夠使效應(yīng)B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖，活化CTL并可以參與炎癥反應(yīng)[28]；IL-10可促進(jìn)B細(xì)胞分化增殖。細(xì)胞免疫和體液免疫主要通過T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞來發(fā)揮作用的。淋巴細(xì)胞增殖對(duì)免疫應(yīng)答至關(guān)重要[29]。Tan等[30]研究表明，枸杞提取物可降低飼喂高脂飼料石斑魚肝臟中白細(xì)胞介素-8(IL-8)含量，提高IL-10含量，增加肝臟抗氧化酶活性及其基因表達(dá)，抑制肝臟炎癥反應(yīng)和凋亡，改善其生長性能。此外，促炎細(xì)胞因子為合成免疫效應(yīng)分子會(huì)促進(jìn)分解代謝[31]，因此，其分泌對(duì)機(jī)體是不利的。Li[32]研究表明，LBP可以增加大鼠血清中IL-2與白細(xì)胞介素-12(IL-12)含量。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在飼糧中添加LBP可顯著提高斷奶大鼠空腸黏膜中IL-2與IL-10的含量，但是對(duì)IL-6含量無顯著影響，這與Liu等[12]的研究結(jié)果一致。由以上論述推斷，LBP可能是通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)來刺激免疫細(xì)胞的增殖分化，提高機(jī)體免疫力，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物的生長性能。

免疫球蛋白指具有抗體活性的動(dòng)物蛋白，可以分為IgG、IgA、IgM、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)等5類，能夠增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用，減弱細(xì)菌毒素的毒性，激活補(bǔ)體，對(duì)病毒等微生物具有抗體活性，能夠抑制它們繁殖，進(jìn)而減少其附著在腸道黏膜上[33-35]。Li等[36]研究表明，在飼糧中添加蒼術(shù)多糖可提高斷奶仔豬血清中IgG和IgM含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼糧中添加LBP可顯著提高斷奶大鼠空腸黏膜中IgA與IgG含量，這與前人的研究結(jié)果[37]一致。由此可見，LBP可以通過調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫球蛋白的含量，增強(qiáng)抗體活性，減弱細(xì)菌毒素的毒性來增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，進(jìn)而改善動(dòng)物的生長性能。

在腸道物理屏障功能中腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)扮演著重要角色，并且影響腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收[38-39]，而其完整性主要是由絨毛高度、隱窩深度及V/C等指標(biāo)體現(xiàn)的。王園等[40]研究表明，在斷奶大鼠飼糧中添加發(fā)酵麩皮多糖后可以提高其空腸絨毛高度和V/C。本試驗(yàn)探討了LBP對(duì)斷奶大鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，在飼糧中添加LBP可提高斷奶大鼠空腸絨毛高度與V/C，降低其隱窩深度。由此可見，在飼糧中添加LBP在一定程度上可以改善斷奶大鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，增強(qiáng)其腸道物理屏障功能，進(jìn)而達(dá)到提高生長性能的效果。

4 結(jié) 論

飼糧中添加4 g/kg LBP可顯著提高斷奶大鼠的ADG，空腸黏膜與血清中T-AOC及血清中GSH-Px活性，以及空腸黏膜中IL-2、IL-10、IgA與IgG的含量，并可顯著提高空腸V/C。由此可見，飼糧中添加LBP可以提高斷奶大鼠的抗氧化能力及腸黏膜免疫功能，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高生長性能。