姜碧薇 王 甜 周玉香* 李 斐
(1.寧夏大學農(nóng)學院,銀川 2750021;2.寧夏職業(yè)技術學院,銀川 2750021)
纖維素酶是由葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶和β-葡聚糖苷酶組成的,能夠將纖維素降解為葡萄糖的一類酶的總稱[1]。飼糧中添加纖維素酶能夠有效破解植物細胞壁,提高秸稈的降解率和營養(yǎng)成分含量[2-3],從而提高反芻動物的生長性能和屠宰性能[4-5]。益生菌是一種對宿主有益的活性微生物,適宜的添加量不僅能夠抑制宿主腸道的病原微生物增殖,還可以維持胃腸道的菌群平衡,提高動物的生產(chǎn)性能[6]。復合益生菌劑適應瘤胃的復雜性,能夠彌補單一菌劑的局限性,因此更適合于反芻動物使用。目前,復合益生菌發(fā)酵粗飼料的處理方法是秸稈飼用化與開發(fā)利用研究熱點。研究顯示釀酒酵母+枯草芽孢桿菌+乳酸菌組合具有良好的協(xié)同促進作用[7]。
蕎麥秸稈屬蓼科雙子葉植物[8],是寧夏南部及中部干旱區(qū)常見的作物秸稈,具有較高營養(yǎng)價值,可應用于反芻動物養(yǎng)殖[9]。苜蓿是牧草之王,不僅蛋白質含量高,且品質優(yōu)。對粗飼料進行加工處理是提高其飼用品質的有效方法。本試驗在課題組成員王萌[10]篩選出組合效應值較高的蕎麥秸稈和苜蓿干草適宜比例(20∶80)的基礎上,采用纖維素酶和復合益生菌(由乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等組成)混合處理寧夏地區(qū)常見的2種粗飼料蕎麥秸稈和苜蓿干草,在飼糧精粗比為30∶70的條件下,研究酶菌混合處理蕎麥秸稈和苜蓿干草對灘羊生長性能、屠宰性能、肉品質、瘤胃細菌多樣性和碳水化合物活性酶類(carbohydrate-active enzymes,CAZy)的影響,以期為秸稈飼料資源的開發(fā)利用及其在灘羊生產(chǎn)實踐中的科學應用提供理論依據(jù)。
取適量蕎麥秸稈和苜蓿干草,用粉碎機粉碎至3~5 cm備用。按照配制比例準確稱取纖維素酶(活性≥10 000 U/g;添加量為0.1%)、復合益生菌[主要成分為酵母菌(活菌數(shù)≥1.0×108CFU/g)、乳酸菌(活菌數(shù)≥1.0×107CFU/g)和枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)≥5.0×107CFU/g),添加量為2 kg/t]和麥麩(按照待處理粗飼料的1%稱取)后,加入適量的水,充分攪拌,混合均勻后采取噴淋的方式,邊噴灑邊攪拌,使水溶液與待處理粗飼料充分混合并將含水量調至70%左右,最后利用青貯裹包機直接打捆包膜密封保存30 d。蕎麥秸稈和苜蓿干草處理前后分別測定其營養(yǎng)物質含量,其中干物質含量參照GB/T 6435—2006《飼料水分的測定方法》測定,粗蛋白質(CP)含量參照GB/T 6435—2006《飼料中粗蛋白測定方法》測定,中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量參照Van Soest等[11]的方法進行測定,粗灰分含量參照GB/T 6435—2006《飼料中粗灰分的測定方法》測定,鈣(Ca)含量采用高錳酸鉀法測定,磷(P)含量采用鉬黃比色法測定。處理前后蕎麥秸稈和苜蓿干草營養(yǎng)成分含量見表1。
表1 處理前后蕎麥秸稈和苜蓿干草營養(yǎng)成分含量(干物質基礎)
飼養(yǎng)試驗于2019年7月至2019年9月在寧夏農(nóng)墾賀蘭山牛羊產(chǎn)業(yè)集團有限公司進行。選擇體重[(31.99±2.10) kg]相近、健康狀況良好、斷奶后的3月齡灘羊(公羊)20只,隨機分為2組(對照組和試驗組),每組10只。對照組飼糧以未經(jīng)處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草(二者比例為20∶80)作為粗飼料,試驗組飼糧以酶菌混合處理蕎麥秸稈和苜蓿干草(二者比例為20∶80)作為粗飼料,2組飼糧精料相同,精粗比均為30∶70。試驗飼糧參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 816—2004《肉羊飼養(yǎng)標準》和生產(chǎn)實踐配制,其組成及營養(yǎng)水平見表2。
表2 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)
參試羊在試驗前進行驅蟲和防疫,定期對圈舍進行消毒與清掃。預試期15 d,正試期60 d,每日分早晚(06:30和18:00)等量飼喂,自由飲水。
1.3.1 生長性能的測定
從正試期開始,每日準確記錄羊只的給料量與剩料量,計算干物質采食量。在試驗開始當天早晨空腹稱取參試羊的體重作為初始體重,在試驗結束當天稱取參試羊的體重作為結束體重。計算每只羊60 d的總增重、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.3.2 屠宰性能指標的測定
飼養(yǎng)試驗結束后,每組選擇5只體重接近平均體重的羊只禁食24 h、禁水2 h后屠宰,進行屠宰性能相關指標測定。
宰前活重:屠宰前禁食24 h、禁水2 h后所稱取的重量。
胴體重:屠宰放血后,剝?nèi)ッぃヮ^、蹄、內(nèi)臟后整個軀體(保留腎臟及其周圍脂肪)靜置30 min后稱取的重量。
凈肉重和骨重:胴體在溫熱情況下去除腎臟及其周圍脂肪,骨頭被精細剔除后余下的重量為凈肉重,剔除骨頭的重量為骨重。
胴體脂肪重:在溫熱情況下將胴體的脂肪與肌肉精細剔除后,稱取脂肪的重量。
尾部脂肪重:在溫熱情況下將脂肪精細剔除后,稱取尾部脂肪的重量。
屠宰率:胴體重占宰前活重的百分比。
骨肉比:胴體骨重與凈肉重的比率。
眼肌面積:測量胴體第12~13肋骨脊柱上方背最長肌的橫切面積。
GR值:用游標卡尺準確量取胴體第12~13助骨間,距背脊中線11 cm處的組織厚度。
1.3.3 肉品質及營養(yǎng)成分含量的測定
屠宰后取肩、股、背部肉樣,用嫩度測定儀(RH-N50,廣州潤湖儀器有限公司)、系水力測定儀(RH-1000,廣州潤湖儀器有限公司)進行肉品質指標測定,具體操作參考侯鵬霞[12]的測定方法。羊肉營養(yǎng)成分含量參考AOAC(1990)[13]中的方法測定。
1.3.4 瘤胃液的采集、DNA提取及建庫測序
于屠宰當天清晨空腹采集瘤胃液,每組選擇3只參試羊,采用負壓采集器,經(jīng)導管通過口腔食道,深入到瘤胃中部,采集瘤胃液約100 mL,每個瘤胃液樣品通過4層薄紗布過濾,液氮冷凍保存。將瘤胃液樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進行V3+V4區(qū)擴增并進行Illumina HiSeq平臺基因組測序。
生長性能、屠宰性能、肉品質、羊肉營養(yǎng)成分含量和瘤胃細菌多樣性數(shù)據(jù)用Excel 2007記錄并作簡單處理后,采用SAS 8.2軟件進行方差分析,利用LSD法進行多重比較,以P<0.05作為差異顯著的判斷標準,P<0.01作為差異極顯著的判斷標準。宏基因組數(shù)據(jù)基于dbCAN數(shù)據(jù)庫采用譜隱馬爾可夫模型,分析CAZy基因相似性。基于原始reads數(shù),采用DESeq2 (V1.10.1)進行差異分析,繪制CAZy基因豐度差異散點圖。
由表3可知,試驗組總增重和平均日增重極顯著高于對照組(P<0.01),分別比對照組提高了40.33%和40.32%;試驗組料重比極顯著低于對照組(P<0.01),比對照組降低了28.43%;其余各項生長性能指標試驗組與對照組之間差異不顯著(P>0.05)。上述結果說明用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,提高了灘羊的增重。
表3 酶菌混合處理蕎麥秸稈和苜蓿干草對灘羊生長性能的影響
由表4可知,試驗組與對照組之間各項屠宰性能指標均無顯著差異(P>0.05),但試驗組的胴體重、屠宰率和凈肉重分別比對照組提高了2.56%、2.23%和3.22%。上述結果說明用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,有提高灘羊胴體重、屠宰率和凈肉重的趨勢。
表4 酶菌混合處理蕎麥秸稈和苜蓿干草對灘羊屠宰性能的影響
由表5可知,試驗組與對照組羊肉各部位pH介于6.67~6.91,試驗組失水率、剪切力和滴水損失分別比對照組降低了7.25%、1.79%和15.13%,熟肉率以及肉色紅度(a*)、黃度(b*)和亮度(L*)值分別比對照組提高了5.64%、3.63%、5.12%和0.71%,但試驗組與對照組相比各項肉品質指標均無顯著差異(P>0.05)。上述結果說明用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,具有改善灘羊肉色和肉品質的趨勢。
表5 酶菌混合處理蕎麥秸稈和苜蓿干草對灘羊肉品質的影響
由表6可知,試驗組與對照組羊肉各營養(yǎng)成分含量均無顯著差異(P>0.05),但試驗組粗脂肪含量比對照組降低了9.25%,粗蛋白質含量比對照組提高了4.31%。上述結果說明用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,有降低灘羊肉脂肪含量、提高灘羊肉蛋白質含量的趨勢。
表6 酶菌混合處理蕎麥秸稈和苜蓿干草對灘羊肉營養(yǎng)成分含量的影響
2.4.1 對灘羊瘤胃細菌操作分類單元(OTU)數(shù)目的影響
對照組的3個平行樣本共獲得reads 114 683 920個,試驗組3個平行樣本共獲得reads 138 106 628個。由表7可知,對照組與試驗組覆蓋度均大于0.98,能夠準確反映灘羊瘤胃內(nèi)的細菌組成情況;試驗組OTU數(shù)目比對照組降低了3.76%,但差異不顯著(P>0.05)。上述結果說明用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,對灘羊瘤胃細菌OTU數(shù)目的影響不大。
表7 瘤胃細菌OTU數(shù)目
2.4.2 對灘羊瘤胃細菌Alpha多樣性的影響
由表8可知,試驗組的Chao指數(shù)和ACE指數(shù)極顯著低于對照組(P<0.01),Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)也低于對照組,但差異不顯著(P>0.05)。上述結果說明用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,降低了其瘤胃細菌的Chao指數(shù)和ACE指數(shù),對瘤胃細菌的Alpha多樣性有一定影響。
表8 16S rDNA檢測Alpha多樣性
2.4.3 對灘羊瘤胃細菌Beta多樣性的影響
圖1為所測樣本瘤胃微生物群落的主坐標分析(PCoA)。由圖1可知,主坐標成分1(PCo1)和主坐標成分2(PCo2)對樣本間變異的貢獻度分別為70.44%和14.45%,能夠充分解釋樣本間的變異;PCoA顯示,同組內(nèi)樣本距離較近,說明同組內(nèi)物種多樣性差異較小,對照組與試驗組之間樣本距離較遠,說明對照組與試驗組之間瘤胃細菌多樣性有所差異。
圖1 瘤胃細菌OTU數(shù)目主坐標分析
2.4.4 對灘羊瘤胃細菌優(yōu)勢群及差異物種的影響
由表9可知,在門水平上,對照組與試驗組的優(yōu)勢菌門均為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和Kiritimatiellaeota,其總量占總菌門的95%以上。其中,試驗組厚壁菌門的豐度顯著高于對照組(P<0.05),擬桿菌門和Kiritimatiellaeota的豐度極顯著低于對照組(P<0.01),變形菌門的豐度與對照組差異不顯著(P>0.05)。上述結果說明用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,降低了其瘤胃細菌內(nèi)擬桿菌門和Kiritimatiellaeota的數(shù)量,提高了厚壁菌門的數(shù)量。
表9 全樣本優(yōu)勢菌門豐度
由表10可知,在屬水平上,對照組與試驗組的優(yōu)勢菌屬為叢毛單胞菌屬(Comamonas)、普雷沃氏菌屬1(Prevotella_1)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、庫特氏菌屬(Kurthia)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、魯梅爾芽孢桿菌屬(Solibacillus)和瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)。其中,試驗組Prevotella_1、Kurthia、Christensenellaceae_R-7_group和Solibacillus的豐度極顯著高于對照組(P<0.01),Comamonas、Acinetobacter、Lysinibacillus、Rikenellaceae_RC9_gut_group和Ruminococcaceae_NK4A214_group的豐度與對照組差異不顯著(P>0.05)。上述結果說明用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,提高了其瘤胃內(nèi)Prevotella_1、Kurthia、Christensenellaceae_R-7_group和Solibacillus的數(shù)量。
表10 全樣本優(yōu)勢菌屬豐度
本試驗中,對照組3個平行樣本共獲得基因5 569 976個,試驗組3個平行樣共獲得基因5 921 304個。與CAZy數(shù)據(jù)庫對比可得各樣品CAZy注釋圖(圖2)。由圖2可知,在A層級中,試驗組與對照組CAZy的基因數(shù)量由高到低排序均為糖苷水解酶(GH)>糖基轉移酶(GT)>碳水化合物結合模塊(CBM)>糖類酯解酶(CE)>多糖裂解酶(PL)>輔助氧化還原酶(AA)。該結果表明,用酶菌混合處理蕎麥秸稈和苜蓿干草作為粗飼料飼喂灘羊,其瘤胃內(nèi)降解植物纖維素的CAZy主要是GH、GT和CBM。在B層級中,豐度排名前5的見表11。由表11可知,試驗組與對照組CAZy較高豐度家族基因reads數(shù)目排名一致,且均無顯著差異(P>0.05)?;贒ESeq2差異分析,繪制基因散點圖(圖3),圖中紅色表示豐度顯著上調的基因(P<0.05),綠色表示豐度顯著下調的基因(P<0.05),灰色表示豐度無顯著變化基因(P>0.05)。由圖3可知,用酶菌混合處理后的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,可引起灘羊瘤胃部分基因豐度上調或下調。由表12可知,與對照組相比,試驗組豐度上調的有CBM83、CBM60等12個基因(P<0.05),豐度下調的有AA1、GH126和AA12共3個基因(P<0.05)。
表12 對照組與試驗組CAZy豐度DEseq2差異分析表
AA:輔助氧化還原酶 auxiliary oxidoreductase;GH:糖苷水解酶 glycoside hydrolase;GT:糖基轉移酶glycosyltransferase;PL:多糖裂解酶 polysaceharide lyase;CE:糖類酯解酶 carbohydrate esterase;CBM:碳水化合物結合模塊carbohydrate binding module。
表11 CAZy較高豐度家族基因reads數(shù)目(B層級)
圖3 對照組與試驗組CAZy豐度的DESeq2差異分析圖
用纖維素酶處理粗飼料后飼喂反芻動物,能夠有效地提高反芻動物的生長性能。張芹等[14]研究發(fā)現(xiàn),外源酶促進了反芻動物對飼料的消化和利用,提高了日增重和產(chǎn)奶量,這與本試驗結果一致。益生菌發(fā)酵飼料對于羔羊補飼和成年羊育肥的作用效果十分顯著[15]。有研究學者給羔羊飼喂布氏乳桿菌11A44發(fā)酵的野豌豆飼料,結果表明,羔羊的日增重為184 g,顯著高于對照組,生張性能得到了明顯的改善[16],這與本試驗結果一致。本試驗用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,顯著提高了灘羊的總增重、平均日增重,降低了料重比,說明該處理方法促進了灘羊對飼糧中營養(yǎng)物質的吸收,提高了灘羊的生長性能。
屠宰性能可以反映出動物的生長情況。屠宰率、凈肉重和胴體重等指標與動物產(chǎn)肉力的好壞直接相關,并影響經(jīng)濟效益。本試驗中,試驗組與對照組的各項屠宰性能指標差異均不顯著,但試驗組胴體重、屠宰率和凈肉重與對照組相比均有上升趨勢,這與Kim等[17]的試驗報道相似。Zobell等[18]報道,纖維素酶制劑對育肥牛的眼肌面積無顯著影響,這與本試驗結果一致。
羊肉pH決定了肉品質的優(yōu)劣。本試驗中對照組與試驗組羊肉pH介于6.67~6.91,均屬于正常范圍。熟肉率與烹煮損失有密切關系,數(shù)值越高則烹煮損失越小。試驗組的熟肉率比對照組有所增加,說明用酶菌混合處理蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,有改善灘羊肉品質的作用。有報道稱,芽孢桿菌可以提高育肥豬的胴體品質[19],本試驗結果與此一致。試驗組的肉色與對照組相比有提高的趨勢,說明酶菌混合處理蕎麥秸稈和苜蓿干草能夠改善灘羊的肉色。
肌肉的常規(guī)營養(yǎng)成分含量可以直觀反映肉品質。有研究報道,灘羊肉的水分含量為77%左右[20],這與本試驗結果一致。肌肉中的脂肪可以有效改善灘羊肉的風味并滿足人們對肉質口感的要求,但羊肉脂肪含量過高則會使人體攝入過多的膽固醇,提高心血管的發(fā)病概率。本試驗中試驗組與對照組羊肉的粗脂肪含量均在正常范圍內(nèi),但試驗組粗脂肪含量低于對照組,說明用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,有降低灘羊肉粗脂肪含量的趨勢,有助于減少人體膽固醇的攝入量。據(jù)王思飛[21]報道,7月齡灘羊的羊肉中粗蛋白質含量為16.05%,低于本試驗結果,分析原因可能與參試羊年齡有關,本試驗選擇的羊只為3月齡斷奶羔羊,其生長以肌肉生長為主。
16S rDNA高通量測序技術可用作分析不同菌種中序列的多樣性和鑒定菌種的類別[22],是不用分離培養(yǎng)微生物而進行鑒定的一種方法,被廣泛利用。Kong等[23]研究了不同粗飼料對奶牛瘤胃細菌多樣性及結構的影響,結果發(fā)現(xiàn),厚壁菌門和擬桿菌門占整個細菌門水平的比例較大,這與本試驗結果一致。在門水平上,厚壁菌門是反芻動物瘤胃纖維降解菌中十分重要的菌群;在屬水平上,普雷沃氏菌屬是瘤胃數(shù)量最多的一類細菌[24],能夠促進瘤胃纖維物質的降解,是瘤胃中的優(yōu)勢菌群[25],這與本試驗結果一致。試驗組厚壁菌門的豐度顯著高于對照組,Prevotella_1的豐度顯著高于對照組,說明用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,提高了灘羊瘤胃內(nèi)部分纖維降解菌的數(shù)量,促進了灘羊瘤胃對粗飼料的消化和吸收;此外,試驗組的Chao指數(shù)和ACE指數(shù)極顯著低于對照組,用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,對灘羊瘤胃細菌多樣性也產(chǎn)生了一定影響。
CAZy數(shù)據(jù)庫是專門研究CAZy的數(shù)據(jù)庫。反芻動物可通過瘤胃內(nèi)的部分微生物分泌的降解酶對其進行降解并為機體供能。因此,許多學者通過研究瘤胃液的木質纖維素降解機制挖掘未知的CAZy[26]。CAZy共分為6大功能類,其中GH、CE和PL能夠協(xié)同作用降解木質纖維素物質[27-28]。本試驗結果表明,對照組與試驗組GH家族基因豐度均最高,其次是GT和CBM,PL和CE豐度較低,這與胡丹丹[29]的研究結果一致。Lynd等[30]研究表明,CBM是纖維素酶的重要組成部分,同時具有催化作用,能促進酶與纖維物質結合,從而促進纖維物質的降解。目前CBM包含84個家族成員。有研究通過CAZy預測功能表明,CBM6是纖維素降解酶,能夠促進纖維素的降解[31],本試驗中,CBM6基因豐度較高,說明該處理方式提高了灘羊瘤胃內(nèi)部分纖維降解酶的活性,提示灘羊對纖維素降解作用較好。CBM50具有與細胞壁降解的相關基因[32],且從CAZy數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)與擬桿菌門有關。本試驗中,試驗組擬桿菌門的豐度顯著低于對照組,但CBM50基因reads數(shù)目與對照組無顯著差異,分析原因可能是灘羊瘤胃內(nèi)其他細菌數(shù)量也與CBM50基因有關。試驗組部分基因的豐度與對照組相比有顯著上調或下調情況,但這些基因都不是豐度較高的基因,這可能與灘羊飼喂酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草有關,但具體作用機理有待進一步研究。
① 用酶菌混合處理后的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,可以提高灘羊的平均日增重,降低料重比,提高灘羊的生長性能。
② 用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,有提高灘羊胴體重、屠宰率和凈肉重的趨勢,同時有改善灘羊肉色和肉品質的趨勢。
③ 用酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊,提高了灘羊瘤胃內(nèi)部分纖維降解菌和部分碳水化合物功能酶的基因數(shù)量,促進了灘羊瘤胃對粗飼料的消化和吸收,并對灘羊瘤胃細菌多樣性產(chǎn)生了一定影響。
④ 本試驗條件下,酶菌混合處理的蕎麥秸稈和苜蓿干草飼喂灘羊效果較佳,有利于灘羊瘤胃分解纖維素的優(yōu)勢菌群的形成,益于灘羊養(yǎng)殖,可推廣使用。