圍產(chǎn)期母豬飼糧補充絲氨酸對泌乳母豬和哺乳仔豬血清生化指標(biāo)和抗氧化功能的影響

曾思靜 劉永輝 龍 靜 關(guān) 鵬 胡 鮮 王晨昱 何流琴* 李鐵軍* 鄧近平 印遇龍，4*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州 2510642；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點實驗室，長沙 2410125；3.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動物腸道功能湖南省重點實驗室，長沙 2410081；4.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 2101408)

在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中，因在妊娠、分娩、泌乳期母豬機體分解代謝增強，極易引發(fā)圍產(chǎn)期母豬氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過量活性氧自由基(ROS)，從而導(dǎo)致母豬產(chǎn)仔性能和泌乳能力下降[1]，且妊娠母豬發(fā)生氧化應(yīng)激時會限制胎盤和胎兒發(fā)育，甚至引起胎兒早產(chǎn)[2-3]，而泌乳母豬發(fā)生氧化應(yīng)激時可破壞機體能量平衡和降低產(chǎn)奶量，進而影響哺乳仔豬生長發(fā)育，降低仔豬斷奶重[4]。目前緩解圍產(chǎn)期母豬氧化應(yīng)激有多種調(diào)控策略，如穩(wěn)定環(huán)境條件、改變飼料成分、添加功能性抗氧化物質(zhì)(如植物提取物、功能性氨基酸等)[5]。研究顯示，谷氨酰胺可通過促進磷酸戊糖途徑活性，提高妊娠母豬體內(nèi)還原型輔酶Ⅱ和谷胱甘肽(GSH)含量來緩解氧化應(yīng)激[5]；母豬飼糧補充精氨酸可提高母豬血液中一氧化氮(NO)含量[6]，顯著提高肝臟抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和過氧化物的釋放[7]。

絲氨酸(Ser)作為重要的功能性氨基酸，也是甘氨酸和半胱氨酸的前體物質(zhì)，有助于體內(nèi)GSH的合成和過量ROS的清除，在緩解氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要作用[8]。前期研究表明，補充1% Ser可通過提高GSH含量，消除過量的ROS來緩解敵草快誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激[9]；同時，Ser亦可通過表觀遺傳機制調(diào)節(jié)GSH合成相關(guān)基因的表達，并激活腺苷酸活化蛋白激酶來預(yù)防高脂飼糧誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激[10]；飼糧補充0.2% Ser可通過減緩早期斷奶仔豬的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高仔豬的生長性能和腸道健康[11]。盡管如此，關(guān)于補充Ser對圍產(chǎn)期母豬抗氧化能力的影響及其抗氧化功能能否傳遞給哺乳仔豬的研究報道仍有限。因此，本試驗通過在圍產(chǎn)期母豬飼糧中補充不同水平的Ser，探討其對泌乳母豬和哺乳仔豬機體抗氧化能力的影響，旨在為改善仔豬生長發(fā)育和母豬健康狀況提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

表1 妊娠后期和泌乳期母豬基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items妊娠后期Late pregnant period泌乳期 Lactating period L-蘇氨酸 L-Thr0.050.08賴氨酸 Lys0.200.45預(yù)混料 Premix1)4.004.00合計 Total100.00100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)總能 GE/(MJ/kg)15.8214.75消化能 DE/(MJ/kg)13.8514.24鈣 Ca0.650.68總磷 TP 0.550.60有效磷 AP0.350.37粗蛋白質(zhì) CP11.9117.91賴氨酸 Lys0.831.07蛋氨酸 Met0.150.18蘇氨酸 Thr0.520.62精氨酸 Arg0.760.89組氨酸 His0.340.39異亮氨酸 Ile0.510.62亮氨酸 Leu1.131.29纈氨酸 Val0.660.76苯丙氨酸 Phe0.620.75天冬氨酸 Asp1.191.42絲氨酸 Ser0.550.66谷氨酸 Glu2.172.77甘氨酸 Gly0.640.68丙氨酸 Ala0.740.80酪氨酸 Tyr0.320.37脯氨酸 Pro0.830.99

表2 妊娠后期和泌乳期母豬飼糧Ser補充量

1.2 樣品采集

在泌乳期第11天對空腹泌乳母豬采集耳緣靜脈血液10 mL，自然凝固后于3 000 r/min、4 ℃離心10 min，分離血清于-20 ℃凍存。母豬分娩5頭仔豬以后，采集母豬第4或者第5對乳房的初乳10 mL，于-20 ℃凍存。哺乳仔豬在21日齡采集前腔靜脈血10 mL，自然凝固后于3 000 r/min、4 ℃離心10 min，分離血清于-20 ℃凍存。仔豬21日齡頸動脈放血處死，屠宰后打開腹腔，取出空腸，用冰浴的生理鹽水洗凈外壁及內(nèi)容物，取空腸中段3 cm左右于錫箔紙中，立即放入液氮中保存。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 血清生化指標(biāo)的檢測

用羅氏C311全自動生化分析儀(德國)測定血清中總蛋白(TP)、尿素氮(UN)、葡萄糖(GLU)和鈣(Ca)含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性。測定步驟按照羅氏生化試劑盒操作說明進行。

1.3.2 初乳和血清中Ser、甘氨酸(Gly)以及半胱氨酸(Cys)含量的檢測

將0.5 mL初乳樣品置于1.5 mL離心管中，3 000 r/min、4 ℃離心5 min，準(zhǔn)確吸取上清液于另一1.5 mL離心管中，加入等體積的10%磺基水楊酸，振蕩混勻，于4 ℃靜置1 h；于10 000 r/min離心15 min后取上清液，過0.22 μm濾膜后調(diào)整至合適濃度，用L-8900型高效氨基酸自動分析儀(日立公司，日本)測定Ser、Gly以及Cys含量。血清中Ser、Gly和Cys含量的檢測方法同上。

1.3.3 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司)檢測血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性以及丙二醛(MDA)和GSH含量。檢測步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 空腸中抗氧化酶mRNA相對表達量的檢測

其實在我看來，全新航海家最大的改變，不是外形和配置，而是名字。作為由第二代林肯MKX改款而來的新車型，全新航海家也是林肯首款依照全新命名規(guī)則更名的車型，“Nautilus”在古希臘語中的含義是“水手”，而用在艦船上最著名的則是美國海軍的“鸚鵡螺”號核潛艇—世界上第一艘核潛艇。更名之后，人們更容易將航海家和MKC區(qū)別開來。

提取空腸組織中總RNA并反轉(zhuǎn)錄后，進行實時熒光定量PCR[12]。具體步驟如下：將空腸組織與Trizol(Invitrogen，美國)勻漿后，用氯仿提取其中總RNA，沉淀、洗滌后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的完整性，并核酸儀檢測濃度。使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)，按操作說明書對所提取的RNA進行除DNA和反轉(zhuǎn)錄操作，最后以所獲得的cDNA為模板，用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)按操作說明進行實時熒光定量PCR。通過Primer 6.0軟件設(shè)計引物，具體引物序列見表3。反應(yīng)結(jié)束后，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct法計算各目的基因的mRNA相對表達量。

表3 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步整理后，用SPSS 19.0軟件中的ANOVA程序作單因素方差分析，并用Duncan氏法進行多重比較，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05≤P<0.10表示有差異趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對泌乳母豬和哺乳仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，M-Ser組泌乳母豬血清TP含量顯著低于對照組、L-Ser組和H-Ser組(P<0.05)；其余生化指標(biāo)各組間均無顯著差異(P>0.05)。

表4 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對泌乳母豬血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，圍產(chǎn)期母豬飼糧補充不同水平Ser對21日齡哺乳仔豬血清ALT、AST和ALP活性以及TP、UN和GLU含量雖無顯著影響(P>0.05)，但L-Ser組和M-Ser組哺乳仔豬血清ALT活性較對照組分別提高了3.7%和7.8%，而H-Ser組則較對照組降低了7.0%；3個Ser補充組哺乳仔豬血清AST活性較對照組分別降低了23.5%、21.2%和38.1%，血清GLU含量較對照組分別降低了5.8%、2.5%和6.5%；L-Ser組和H-Ser組仔豬血清ALP活性較對照組分別降低了7.8%和12.6%，血清UN含量較對照組分別升高了28.4%和14.2%，而M-Ser組血清ALP活性較對照組卻升高了14.6%，血清UN含量較對照組降低了12.9%。

表5 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對哺乳仔豬血清生化指標(biāo)的影響

2.2 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對初乳和哺乳仔豬血清中Ser、Gly和Cys含量的影響

由表6可知，M-Ser組和H-Ser組初乳Ser含量顯著高于L-Ser組(P<0.05)；M-Ser組和H-Ser組初乳Gly含量極顯著高于對照組和L-Ser組(P<0.01)；L-Ser組初乳Cys含量極顯著低于其他3組(P<0.01)。H-Ser組哺乳仔豬血清Ser含量極顯著高于其他3組(P<0.01)；L-Ser組和M-Ser組哺乳仔豬血清Gly含量顯著高于對照組(P<0.05)；L-Ser組哺乳仔豬血清Cys含量顯著高于對照組和H-Ser組(P<0.05)。

表6 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對初乳和哺乳仔豬血清中Ser、Gly和Cys含量的影響

2.3 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對泌乳母豬和哺乳仔豬血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

由表7可知，M-Ser組泌乳母豬血清MDA含量極顯著低于其他3組(P<0.01)；M-Ser組和H-Ser組泌乳母豬血清GPx活性極顯著高于對照組和L-Ser組(P<0.01)；泌乳母豬血清GSH含量各組間無顯著差異(P>0.05)。3個Ser補充組哺乳仔豬血清MDA含量極顯著低于對照組(P<0.01)；3個Ser補充組哺乳仔豬血清GPx活性與GSH含量與對照組雖無顯著差異(P>0.05)，但GPx活性分別提高了3.9%、13.6%和10.0%，GSH含量分別提高了6.9%、19.7%和21.9%。

表7 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對泌乳母豬和哺乳仔豬血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

2.4 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對哺乳仔豬空腸中抗氧化酶基因mRNA相對表達量的影響

如圖1所示，L-Ser組和M-Ser組哺乳仔豬空腸谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基(GCLM)和谷胱甘肽過氧化物酶4(GPx4)的mRNA相對表達量顯著高于對照組和H-Ser組(P<0.05)，而H-Ser組空腸GCLM和GPx4的mRNA相對表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)；雖然哺乳仔豬空腸銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化還原酶1(NQO1)的mRNA相對表達量各組間無顯著差異(P>0.05)，但3個Ser補充組的空腸CuZnSODmRNA相對表達量較對照組分別提高了72%、73%和77%，而空腸NQO1 mRNA相對表達量則較對照組分別降低了25%、34%和31%。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對泌乳母豬和哺乳仔豬血清生化指標(biāo)的影響

本團隊前期研究顯示，在圍產(chǎn)期母豬飼糧中額外補充Ser可顯著提高仔豬初生窩重、初生平均重、斷奶窩重和斷奶平均重，縮短母豬發(fā)情間隔，且補充低劑量時效果最佳[13]，這表明母源添加Ser對提高母豬繁殖性能和仔豬生長性能具有一定改善作用，其具體機制需要進一步探究。眾所周知，血清生化指標(biāo)的變化與機體的新陳代謝密切相關(guān)，可以間接地反映機體的生理健康和代謝狀況。血清ALT、AST和ALP是常用于判斷肝功能是否產(chǎn)生損傷的指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，圍產(chǎn)期母豬飼糧補充中劑量Ser(妊娠后期母豬飼糧Ser含量為0.83%，泌乳期母豬飼糧Ser含量為0.99%)可有效降低泌乳母豬血清中ALT、AST和ALP活性，在一定程度上保護了泌乳母豬肝功能和因自身代謝增強引發(fā)的應(yīng)激損傷。有研究表明，機體血清GLU含量在正常的情況下保持相對穩(wěn)定，過高或過低則反映機體代謝加強或減弱[14]。UN是機體內(nèi)源性蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，血清UN和TP含量均可反映機體蛋白質(zhì)代謝水平[15]。在本試驗中，圍產(chǎn)期母豬飼糧補充不同水平Ser均可提高泌乳母豬血清GLU和UN含量，表明Ser可有效促進母豬機體新陳代謝和提供更多的ATP，以及提高機體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成速率。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)M-Ser組泌乳母豬血清中TP含量較對照組顯著降低，但L-Ser組和H-Ser組則無顯著變化，這可能是由于適量的Ser可促進泌乳母豬碳水化合物和蛋白質(zhì)的分解代謝，以滿足其較高的泌乳需要，從而導(dǎo)致血清中TP含量的暫時性降低，具體機理仍需進一步研究。

3.2 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對初乳和哺乳仔豬血清中Ser、Gly和Cys含量的影響

研究表明，Ser在代謝途徑中與同型半胱氨酸結(jié)合生成Cys，也可在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)作用下生成Gly[16-17]。本研究結(jié)果表明，在圍產(chǎn)期母豬飼糧中額外補充Ser可以提高初乳和哺乳仔豬血清中Ser和Gly含量，進而可能導(dǎo)致母豬泌乳量提高，從而促進仔豬蛋白質(zhì)合成，改善仔豬生長性能。同時，本團隊已有研究結(jié)果也表明，母源添加Ser可顯著影響母乳和哺乳仔豬血清中有關(guān)核苷酸代謝、鞘脂和磷脂代謝以及GSH和?；撬岽x的代謝產(chǎn)物的改變，這些功能性物質(zhì)對母豬繁殖性能和哺乳仔豬生長性能具有有效的改善作用[13]。L-Ser和M-Ser組仔豬血清中Ser含量與對照組無顯著差異，但L-Ser組血清Cys含量和M-Ser組血清Gly含量顯著高于對照組，這可能是由于大部分的Ser已經(jīng)轉(zhuǎn)化為了Cys和Gly，參與了GSH的合成[16-17]，提高哺乳仔豬抗氧化的能力。

3.3 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對泌乳母豬和哺乳仔豬血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

本團隊前期研究表明，Ser可為同型半胱氨酸甲基化提供一碳單元，促進GSH合成和維持蛋氨酸循環(huán)，進而緩解氧化應(yīng)激[9]。MDA是一種脂質(zhì)過氧化損傷的標(biāo)志物，而GSH是細(xì)胞合成的最重要的低分子抗氧化劑[18]，可清除體內(nèi)多余的自由基[19]，GPx是哺乳動物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，可清除過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，保護機體免受氧化損傷[20]。在本試驗中，在圍產(chǎn)期母豬飼糧中補充中劑量Ser可顯著降低泌乳母豬血清中MDA含量，而補充低劑量和高劑量的Ser，對泌乳母豬血清中MDA含量無顯著影響。這表明飼糧中補充中劑量Ser可緩解泌乳母豬體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而補充低劑量和高劑量Ser對泌乳母豬體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響不顯著，這可能是由于Ser不足或過量均會對母豬圍產(chǎn)期氧化應(yīng)激產(chǎn)生影響，具體原因有待進一步研究。本試驗結(jié)果還顯示，在圍產(chǎn)期母豬飼糧中補充中劑量Ser可顯著提高泌乳母豬血清中GSH含量與GPx活性，這與我們前期研究得出的Ser可通過支持GSH合成和激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號通路來緩解氧化應(yīng)激的研究結(jié)果[12]一致。

3.4 圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser對哺乳仔豬空腸中抗氧化酶基因表達的影響

研究顯示，妊娠母豬飼糧添加甲基供體蛋氨酸可提高初生仔豬血液和肝臟抗氧化酶表達和活性[21]，提示在妊娠期和泌乳期對母豬進行營養(yǎng)調(diào)控，抗氧化物質(zhì)可通過胎盤或乳汁傳遞給仔豬，從而增強仔豬的抗氧化能力，改善其生長性能[22]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，給母鼠飼喂缺乏Ser飼糧后，其所產(chǎn)斷奶小鼠更易遭受氧化應(yīng)激的損害，說明母源Ser對維持?jǐn)嗄套哟目寡趸δ苁种匾猍23]。在本試驗中，圍產(chǎn)期母豬飼糧補充Ser可有效提高21日齡哺乳仔豬血清中GPx活性及GSH含量和降低血清中MDA含量，同時可顯著提高哺乳仔豬空腸中GCLM和GPx4基因的mRNA相對表達量，且CuZnSOD基因的mRNA相對表達量也有一定提高，而GPx4、GCLM和CuZnSOD基因表達量的提高說明ROS和過氧化物分解速度加快，還原性GSH合成速度提高，機體抗氧化能力增強[24]。這就進一步證實，母源補充Ser可能通過胎盤或母乳傳遞抗體或抗氧化相關(guān)物質(zhì)，進而提高哺乳仔豬的抗氧化能力，促進其生長發(fā)育。

4 結(jié) 論

圍產(chǎn)期母豬飼糧補充適量Ser，使得妊娠后期飼糧Ser含量為0.83%、泌乳期飼糧Ser含量為0.99%時，可有效提高泌乳母豬血清抗氧化酶活性，從而緩解圍產(chǎn)期母豬的應(yīng)激損傷，并可能通過乳汁將抗氧化物質(zhì)傳遞給哺乳仔豬，提高哺乳仔豬的抗氧化能力。

致謝：

感謝中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所公共技術(shù)服務(wù)中心實驗室所提供的試驗支持，以及湖南龍華農(nóng)牧發(fā)展有限公司為本試驗提供的試驗動物及場所。