微塑料對大型溞攝食和抗氧化防御系統(tǒng)的影響

高嘉蔚， 趙莎莎， 李富云， 楊小滿， 張 靜， 熊安琪， 李鋒民,3*

1.中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院近海環(huán)境污染控制研究所， 山東 青島 266100

2.中國海洋大學，海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室， 山東 青島 266100

3.青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室， 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室， 山東 青島 266071

塑料由于價廉、質(zhì)輕、耐用等特性，在包裝業(yè)、建筑業(yè)、汽車制造業(yè)等多個領(lǐng)域得以廣泛生產(chǎn)和使用[1]，2019年全球塑料年產(chǎn)量達3.68×108t[2]. 隨著塑料的大量生產(chǎn)和使用，導致大量塑料垃圾因管理不善進入自然環(huán)境[3]，經(jīng)過漫長的分解最終形成微塑料(Microplastics, MPs)[4]. 微塑料是指尺寸小于5 mm的塑料碎片或顆粒，大量野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)全球范圍內(nèi)不同水域中均有微塑料污染現(xiàn)象[5-7]；同時，水體中的生物也受到了微塑料的污染，野外采集的魚類[8]、貝類[9]等生物體中也觀察到微塑料的殘留. 微塑料被水生生物攝入后不僅阻塞消化道，產(chǎn)生飽腹感[10]，還導致其攝食和行為能力下降，體內(nèi)能量儲備減少從而影響其生長，甚至導致死亡[11-12]. 由于水生生物對微塑料的攝入、累積和營養(yǎng)傳遞作用，可能導致微塑料最終通過水產(chǎn)品等方式進入人體并危害其健康[13-14]. 因此，微塑料的生態(tài)風險及其對人體健康的威脅引起了國內(nèi)外高度關(guān)注[15].

大型溞(Daphniamagna)屬于浮游甲殼類動物，常被用作水生生物毒理學研究的標準測試生物[16]，作為淡水水體中廣泛存在的浮游動物，又是魚類等養(yǎng)殖動物幼苗期的主要餌料，因此其在水生食物鏈中占重要地位. 由于部分微塑料的尺寸接近大型溞餌料生物的大小，一定尺寸和形狀的微塑料可以被大型溞攝入[12,17-18]，造成大型溞消化道堵塞、攝食率降低[18-19]，引起運動抑制，甚至導致其死亡[20]. MA等[21]研究發(fā)現(xiàn)，僅50 nm的微塑料對大型溞表現(xiàn)出顯著的生物毒性和物理損傷，而微米級塑料顆粒僅能被大型溞攝入并從體內(nèi)排出而沒有物理損傷. 而Rehse等[20]研究表明，1 μm的微塑料會導致大型溞固定化. 鞏寧等[22]則認為2、20和50 μm聚乙烯微粒均可在大型溞腸道中積累，造成大型溞的運動抑制. 微米尺寸的微塑料能否對大型溞的攝食產(chǎn)生影響仍不明確，因此不同尺寸的微塑料對大型溞攝食的影響有待進一步研究.

該研究選用3種粒徑(100 nm、5 μm、50 μm)的聚苯乙烯(Polystyrene, PS)微塑料，通過暴露和凈化試驗測定不同尺寸微塑料在大型溞體內(nèi)的積累量和停留量，探究微塑料對大型溞濾水率和攝食率的影響，分析微塑料對大型溞體內(nèi)超氧化物歧化酶(Superoxidase dismutase, SOD)和過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性以及丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量的影響，以期為進一步揭示微塑料對大型溞的毒性效應提供基礎資料，為評價微塑料的環(huán)境毒理效應和生態(tài)風險提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

微塑料購于天津倍思樂色譜開發(fā)技術(shù)中心，粒徑分別為100 nm、5 μm、50 μm，濃度均為25 g/L，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488和518 nm. 大型溞(Daphniamagna)購于青島農(nóng)業(yè)大學，用2 L的玻璃燒杯在恒溫光照培養(yǎng)箱(GXZ-500B-LED型，寧波江南儀器廠)中培養(yǎng)，光暗比為16 h∶8 h. 培養(yǎng)基為配置的標準稀釋水[23]，水溫為(20±1)℃，pH為7.8±0.2，溶解氧含量在80%以上. 每天喂食蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidsa)1次，藻細胞密度為6×105個/mL.

1.2 研究方法

1.2.1微塑料在大型溞體內(nèi)的積累和停留

微塑料在數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE型，昆山舒美超聲儀器有限公司)中超聲預處理15 min (120 W)以確保微塑料顆粒在體系中更好地分散. 用超純水將3種粒徑的微塑料濃度分別稀釋到0、0.5、1.0、3.0、5.0、10、20、40 mg/L，測定不同濃度微塑料的吸光度. 擬合微塑料濃度-熒光強度的標準曲線，得出相應線性回歸方程以計算大型溞體內(nèi)微塑料含量.

暴露試驗設置5個微塑料暴露組(微塑料濃度分別為0.2、2、10、20、40 mg/L)和1個對照組(不添加微塑料)，每個處理組3個平行. 微塑料暴露組設置6個取樣時間(2、4、8、12、24、48 h)，不同取樣時間的燒杯中均放入20只健康活潑、大小相近的大型溞，每個燒杯含有80 mL微塑料溶液，取樣時燒杯中的大型溞全部取出. 整個試驗過程中燒杯封口以避免污染和水分蒸發(fā)，在封口膜上扎小孔保證氣體交換，試驗期間不喂食也不更換培養(yǎng)液. 按照上述微塑料暴露體系，大型溞在微塑料溶液中暴露8 h后取出，用超純水沖洗3次轉(zhuǎn)移到不含微塑料的培養(yǎng)基中，使大型溞排泄體內(nèi)的微塑料，期間不喂食，8 h后測定大型溞體內(nèi)的微塑料含量.

微塑料處理組的大型溞用超純水沖洗3次以去除黏附在體表的微塑料，吸干水分進行稱重，用超聲波細胞破碎儀(JY92-IIN型，寧波新芝生物科技股份有限公司)進行組織勻漿(15 min，250 W，破碎10 s暫停10 s循環(huán)進行)使其充分研磨. 在每個燒杯中加入30 mL 100 g/L KOH溶液，在數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6型，常州國華電器有限公司)中60 ℃下消解72 h以徹底消解有機質(zhì)，消解方法對微塑料熒光強度無影響[24]，整個消解過程中燒杯封口以避免污染，冷卻至室溫后用超純水定容至100 mL，測定消解溶液中微塑料的熒光強度并根據(jù)標準曲線計算微塑料在大型溞體內(nèi)的含量.

1.2.2微塑料對大型溞攝食率和濾水率的影響

攝食試驗分為3組，分別為對照組(不添加微塑料)、微塑料暴露組(100 nm、5 μm、50 μm)和無大型溞對照組，對照組的每個燒杯中分別加入20只大型溞；微塑料暴露組中3種粒徑微塑料暴露濃度均為10 mg/L，每個燒杯中分別加入20只大型溞；無大型溞對照組中3種粒徑微塑料暴露濃度均為10 mg/L，計算大型溞濾水率的校正因子需通過無大型溞對照組求得. 3個處理組的玻璃燒杯(200 mL)中分別加入160 mL蛋白核小球藻的藻液，初始密度均為6×105個/mL，每個處理組3個平行. 將大型溞置于恒溫光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，溫度為(20±1)℃，5 h暴露試驗結(jié)束后，在試驗體系中加入魯格試劑，將蛋白核小球藻固定，搖勻后取樣在顯微鏡下采用血球計數(shù)板計數(shù).

1.2.3微塑料對大型溞抗氧化防御系統(tǒng)的影響

將在微塑料中暴露24 h的大型溞(20只)取出，用超純水沖洗3次，用濾紙吸干水分并稱重，V(大型溞)∶V(生理鹽水)=1∶9，在冰水浴條件下超聲破碎15 min (250 W，破碎10 s暫停10 s循環(huán)進行)進行機械勻漿，勻漿液在高速冷凍離心機(HC-3018R型，安徽科大創(chuàng)新股份有限公司)中離心10 min (4 ℃，12 000 r/min)，取上清液測定SOD活性、CAT活性、MDA含量.

1.3 分析測試方法

1.3.1微塑料熒光強度的測定

利用熒光分光光度計(F-4600型，日立高新技術(shù)公司)進行熒光強度的測定，測定前用超純水進行調(diào)零. 測定模式為熒光模式，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設定為488和518 nm. 100 nm、5 μm、50 μm微塑料的線性回歸方程分別為y=1.064 3x+0.449 1(R2=0.998 3)、y=1.871 0x+0.562 5(R2=0.997 4)和y=3.484 5x-0.486 1(R2=0.990 6)，定量范圍為0～40 mg/L.

1.3.2大型溞濾水率和攝食率的計算

參照文獻[25]方法計算每只大型溞的濾水率(即大型溞在單位時間內(nèi)平均過濾的試驗溶液的體積)和攝食率(即大型溞在單位時間內(nèi)平均攝取的蛋白核小球藻細胞數(shù)量)，計算公式：

(1)

(2)

(3)

式中：F為大型溞的濾水率，mL/(只·h)；V為試驗中所用溶液的體積，mL；n為每個平行的處理組中大型溞的數(shù)量，只；C0為初始的蛋白核小球藻細胞密度，個/mL；Ct為被大型溞攝食后的蛋白核小球藻細胞密度，個/mL；t為暴露時間，h；A為校正因子；Ct′為無大型溞對照組暴露于微塑料后的蛋白核小球藻細胞密度，個/mL；I為大型溞的攝食率，個/(只·h).

1.3.3大型溞抗氧化防御系統(tǒng)的測定

采用考馬斯亮藍法測定大型溞蛋白含量，采用黃嘌呤氧化酶法和可見光法分別測定SOD和CAT活性[26]，采用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量[27].

蛋白含量計算公式：

(4)

式中：Dprot為蛋白含量，g/L；ODc為試驗組樣品的吸光度；ODb為標準品的吸光度；OD0為空白組樣品的吸光度；0.563為蛋白標準品的質(zhì)量濃度，g/L.

SOD、CAT活性和MDA含量的計算公式：

(5)

(6)

(7)

式中：ESOD為SOD活性，以每mg組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量計，U/mg；ECAT為CAT活性，以每mg組織蛋白1 s分解1 μmol H2O2的量計，U/mg；EMDA為MDA含量，以每mg組織蛋白質(zhì)中含有的MDA量計，nmol/mg；ODd為對照組樣品的吸光度.

1.4 統(tǒng)計分析方法

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，使用單因素方差分析(ANOVA)檢驗比較試驗組和對照組之間的差異，P<0.05表示顯著性差異. 使用Excel 2016軟件進行繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 微塑料在大型溞體內(nèi)的積累和停留

由圖1可見，暴露2 h后50 μm的微塑料主要黏附在大型溞體內(nèi)具有食物過濾能力的胸肢處，少量進入到腸道中，而100 nm和5 μm的微塑料能在大型溞腸道中大量積累，表明微塑料在大型溞體內(nèi)的積累部位與粒徑大小有關(guān). 由圖2可見，當微塑料濃度為10 mg/L時，暴露8 h后100 nm和5 μm微塑料在大型溞體內(nèi)的積累量分別為(6.48±0.08)和(4.37±0.15)mg/g，而50 μm的積累量僅為(0.37±0.04)mg/g. 所有濃度微塑料暴露組均發(fā)現(xiàn)，50 μm的微塑料在大型溞體內(nèi)的積累量明顯少于100 nm和5 μm的微塑料，即粒徑越小積累量越高，說明粒徑大小會導致微塑料在大型溞體內(nèi)積累量的差異. 此外，3種微塑料在大型溞體內(nèi)的積累量均在暴露后第8天達到最大值，且最大積累量隨微塑料暴露濃度的增加而增大.

注： 白色箭頭所指位置為腸道，紅色箭頭所指位置為胸肢.

注： 不同小寫字母表示處理組間的顯著性差異，P<0.05，下同.

大型溞暴露于不同濃度的微塑料8 h后轉(zhuǎn)入不含微塑料的培養(yǎng)基中凈化8 h，大型溞體內(nèi)微塑料的停留量如圖2所示. 由圖2可見：100 nm和5 μm微塑料暴露組中，微塑料的停留量均隨微塑料濃度的增加而增加；而50 μm微塑料暴露組中，微塑料的停留量不隨微塑料濃度變化而變化. 相同濃度的微塑料暴露組中，小粒徑的停留量高于大粒徑，如微塑料濃度為2 mg/L時，100 nm和5 μm微塑料在大型溞體內(nèi)的停留量分別為(0.48±0.04)和(0.25±0.06)mg/g，而50 μm微塑料的停留量為(0.09±0.005)mg/g.

2.2 微塑料對大型溞攝食率和濾水率的影響

由圖3可見，除100 nm微塑料暴露組對大型溞的攝食率沒有顯著影響外，其他暴露組中大型溞的濾水率和攝食率均顯著低于對照組(無微塑料). 暴露于3種粒徑的微塑料后，大型溞的濾水率較對照組平均降低了50.7%±9.5%，攝食率平均降低了39.2%±10.7%，說明微塑料的暴露降低了大型溞的濾水率和攝食率. 100 nm微塑料暴露組中大型溞的濾水率和攝食率較對照組分別降低了39.8%±2.4%和26.9%±1.8%，5 μm微塑料暴露組中分別降低了57.8%±2.7%和45.9%±2.9%，50 μm微塑料暴露組中大型溞的濾水率和攝食率與5 μm微塑料暴露組相近. 大粒徑(5和50 μm)的微塑料對大型溞濾水率和攝食率的抑制作用要強于小粒徑(100 nm)的微塑料，說明較大粒徑的微塑料對大型溞攝食能力的影響更嚴重.

2.3 微塑料對大型溞抗氧化防御系統(tǒng)的影響

圖3 微塑料對大型溞濾水率和攝食率的影響

注：*代表微塑料暴露組與對照組(微塑料濃度為0)有顯著性差異，P<0.05，下同.

微塑料對大型溞體內(nèi)SOD、CAT活性的影響如圖4所示. 由圖4可見，高濃度(10、20、40 mg/L)100 nm和5 μm的微塑料暴露組對大型溞體內(nèi)SOD活性有顯著促進作用，而各濃度50 μm微塑料暴露組大型溞體內(nèi)的SOD活性水平均無顯著差異，表明微塑料粒徑越小對大型溞抗氧化防御系統(tǒng)的影響越大，越容易誘導大型溞體內(nèi)細胞氧化脅迫. 3種粒徑微塑料的CAT活性均有顯著變化，對于100 nm微塑料暴露組，當微塑料濃度為0.2 mg/L時，就對大型溞體內(nèi)CAT活性〔(5.26±0.16)U/mg〕具有顯著的促進作用，而5和50 μm微塑料濃度大于2 mg/L時會顯著促進CAT活性.

100 nm和5 μm微塑料暴露組中微塑料對大型溞體內(nèi)SOD、CAT活性的影響均呈低濃度促進高濃度抑制的特征，SOD和CAT活性均隨微塑料濃度的增加呈先升后降的趨勢. 對于100 nm微塑料暴露組，當微塑料濃度增至10 mg/L時，大型溞體內(nèi)SOD、CAT活性均達到最大值〔(237.44±18.90)和(13.91±0.48)U/mg〕，隨后逐漸降低. 低濃度微塑料可以誘導酶活性的升高，而當微塑料濃度過高時會造成細胞損傷進而抑制SOD、CAT的活性. 與SOD活性相比，不同濃度的微塑料均能夠誘導CAT活性的升高，較低微塑料濃度(0.2 mg/L)下CAT活性已有顯著變化，說明CAT活性抗氧化響應較快.

暴露24 h后，3種粒徑的微塑料均能誘導大型溞體內(nèi)MDA含量升高(見圖5)，說明微塑料暴露會引起大型溞產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應，造成氧化損傷. MDA水平隨微塑料暴露濃度的增加而升高，存在明顯的劑量-效應關(guān)系. 在高濃度(10～40 mg/L)微塑料暴露組中，3種粒徑的微塑料誘導大型溞體內(nèi)MDA含量均顯著增加，而低濃度(0～2 mg/L)微塑料暴露組中促進效果不顯著.

圖5 不同粒徑微塑料對大型溞MDA含量的影響

3 討論

3.1 微塑料對大型溞攝食的影響

由于微塑料的尺寸在大型溞攝食的適口范圍內(nèi)，所以很容易被大型溞攝入[12,28]. 該研究發(fā)現(xiàn)，粒徑的大小會影響微塑料在大型溞體內(nèi)的積累部位，100 nm和5 μm的微塑料接近大型溞餌料的大小，因此能在大型溞腸道中大量積累，而尺寸較大的50 μm微塑料則被胸肢上的濾器攔住，因此主要黏附在胸肢處. 在斑馬魚的研究中也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，0.07和5 μm的微塑料可以在斑馬魚的肝臟中積累，而20 μm的微塑料只能在鰓和腸道中積累[11]. 微塑料在大型溞體內(nèi)的積累量與粒徑也明顯相關(guān)，粒徑越小積累量越高. 一方面是因為在相同濃度下，粒徑越小的微塑料數(shù)量越多，增加了被大型溞攝入的機會，導致積累量更高；另一方面可能是由不同尺寸微塑料在水中的空間分布差異導致的，有研究[20]表明100 μm的聚乙烯顆粒容易漂浮在水表面，而1 μm的顆粒懸浮在水中，懸浮在水中的微塑料可能容易被大型溞攝入，導致積累量較高. 此外，微塑料在大型溞體內(nèi)的積累量還受濃度的影響，Canniff等[29]研究表明，隨微塑料暴露濃度的增加，大型溞對微塑料的攝入量增大，與筆者研究結(jié)果一致，大型溞對3種微塑料的最大積累量隨微塑料暴露濃度的增加而增大.

經(jīng)過8 h的凈化試驗發(fā)現(xiàn)，微塑料可以在大型溞體內(nèi)停留，在藤壺[13]和輪蟲[30]等動物中均發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象. 由于100 nm和5 μm的微塑料通過腸道才能排出體外，而50 μm的微塑料主要黏附在胸肢處，在凈化過程中胸肢上的剛毛清除了附著在濾器上的不能利用的大顆粒，因此50 μm的微塑料停留量不隨暴露濃度變化而變化. 同一濃度微塑料暴露組中，小粒徑的停留量高于大粒徑，一方面是因為大粒徑的微塑料積累量較低；另一方面，與小粒徑相比，大粒徑微塑料能更快地被大型溞排出體外[31].

Rist等[17]研究表明，暴露在聚苯乙烯微球(粒徑0.1 μm，濃度為1.5×106個/mL)中的大型溞其攝食率比對照組降低了20.5%. 筆者研究結(jié)果略高于上述數(shù)值，在暴露5 h時，100 nm微塑料暴露組中大型溞攝食率比對照組(無微塑料)降低了26.9%±1.8%，可能是因為Rist等[17]研究暴露時間為24 h，隨著暴露時間的增加，大型溞會將體內(nèi)的微塑料逐漸排出，攝食能力不斷恢復，達到相對穩(wěn)定的狀態(tài). 對于濾食性動物大型溞，其適口餌料的大小一般在20 μm 以下，50 μm的微塑料超過其適口范圍，因此在過濾食物過程中被胸肢上的濾器攔住，黏附在胸肢處，造成食物過濾器損傷，影響大型溞正常攝食，進而降低其濾水率和攝食率. 5 μm的微塑料接近蛋白核小球藻的尺寸，更容易干擾大型溞的攝食選擇，被大型溞攝入后在消化道內(nèi)積累，導致大型溞消化道堵塞、食欲降低[12]，因此對濾水率和攝食率的影響較為明顯.

3.2 微塑料對大型溞抗氧化防御系統(tǒng)的影響

微塑料暴露導致大型溞體內(nèi)SOD和CAT活性水平均顯著提高，SOD活性和CAT活性是對細胞中超氧化物自由基和過量過氧化氫的生化反應，表明微塑料可誘導細胞激活抗氧化防御系統(tǒng)以對抗氧化應激. 由于微塑料在大型溞體內(nèi)的積累和停留導致正常攝食受阻，攝食率降低會引起氧化應激酶的變化[32]，因此SOD和CAT活性升高. 該研究結(jié)果顯示，微塑料粒徑越小對大型溞抗氧化防御系統(tǒng)的影響越大，其中100 nm的微塑料在各濃度下對大型溞體內(nèi)CAT活性均有顯著的促進作用. 與微米級的微塑料相比，納米塑料的尺寸更小，更有可能轉(zhuǎn)移至大型溞的組織和細胞，對大型溞的氧化損傷更大[33]. HUANG等[34]研究發(fā)現(xiàn)，生物體在輕度逆境中SOD和CAT活性會相應升高，而當生物體處于嚴重逆境中時SOD和CAT活性反而會下降. YU等[35]在中華絨螯蟹的研究中也發(fā)現(xiàn)，暴露于低濃度(40和400 μg/L)聚苯乙烯微塑料的中華絨螯蟹體內(nèi)SOD活性增加，但隨著濃度的增大，SOD活性水平隨之降低. 筆者研究也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，隨著微塑料濃度的增加，大型溞SOD活性和CAT活性均呈先升后降的趨勢.

MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，間接反映細胞的損傷程度. 有研究[36]報道，微塑料的存在會誘導魚類出現(xiàn)氧化損傷，增加魚類體內(nèi)的MDA含量. 該研究中微塑料誘導大型溞產(chǎn)生氧化應激，破壞了細胞內(nèi)的氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡，引起細胞內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，導致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加，造成氧化損傷[27]；同時，微塑料暴露組的MDA含量顯示出明顯的劑量依賴性增加，而且微塑料達到一定濃度時才會顯著影響MDA水平，可能是因為隨著微塑料濃度的升高，大型溞體內(nèi)ROS含量不斷增高，超出了抗氧化酶SOD和CAT的清除能力，進一步加劇脂質(zhì)過氧化程度. 抗氧化防御系統(tǒng)的破壞，會抑制大型溞的攝食行為[32]，大型溞攝食能力下降導致體內(nèi)能量儲備減少從而影響其生長和存活.

4 結(jié)論

a) 微塑料在大型溞體內(nèi)的積累部位與粒徑大小有關(guān)；微塑料粒徑越小、暴露濃度越高，微塑料在大型溞體內(nèi)的積累量和停留量越高. 微塑料暴露顯著降低了大型溞的濾水率和攝食率，與對照組相比分別降低了50.7%±9.5%和39.2%±10.7%，5 μm和50 μm的微塑料對大型溞濾水率和攝食率的抑制作用強于100 nm的微塑料.

b) 微塑料暴露導致大型溞體內(nèi)SOD和CAT活性均升高，表現(xiàn)為低濃度促進高濃度抑制的特征；微塑料暴露還會誘導大型溞體內(nèi)MDA含量升高，對大型溞造成氧化損傷.