羅非魚皮蛋白多肽-Fe2＋結(jié)合物的制備及性質(zhì)分析

林善婷，胡 曉，李來好，楊賢慶，陳勝軍，吳燕燕，黃 卉，榮 輝

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510300）

羅非魚（Oreochromis niloticus）因其具有生長快、病害少、肉質(zhì)鮮美、蛋白質(zhì)含量高等特點(diǎn)，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向世界各國推廣的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一。我國羅非魚資源豐富，其養(yǎng)殖產(chǎn)量和出口量穩(wěn)居世界前列[1]。然而，羅非魚加工產(chǎn)品主要以凍全魚和冷凍魚片為主，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一，精深加工水平及高值化利用率不高，且羅非魚加工過程中會(huì)產(chǎn)生約60%～70%的富含蛋白質(zhì)的加工副產(chǎn)物，如魚皮、魚鱗、魚頭、魚骨、魚肉碎屑等，其加工副產(chǎn)物大多用作飼料、肥料或直接廢棄，其優(yōu)質(zhì)的蛋白資源未得到充分開發(fā)與利用[2]。

鐵元素是人體中血紅素及大多數(shù)酶類的構(gòu)成成分，參與氧氣的運(yùn)輸及機(jī)體細(xì)胞代謝，在維持人體正常造血功能以及增強(qiáng)神經(jīng)/免疫系統(tǒng)功能中起重要作用，當(dāng)體內(nèi)缺乏鐵元素時(shí)易導(dǎo)致貧血、食欲不振、生長緩慢，尤其是孕期鐵元素缺乏的孕婦易導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)，增加母嬰死亡風(fēng)險(xiǎn)等[3]。鐵元素缺乏是世界上最常見且普遍的營養(yǎng)缺乏癥，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，幾乎一半的6～59 個(gè)月的兒童以及1/3的育齡婦女患有缺鐵性貧血癥[4]。

Fe2＋結(jié)合活性肽是指具有結(jié)合Fe2＋活性的肽類物質(zhì)，其與Fe2＋結(jié)合后形成的肽-Fe2＋結(jié)合物，在腸道中可提高并保持Fe2＋的溶解度，提高Fe2＋在腸道中的生物利用度[5]。目前，已有研究證明鷹嘴豆[6]、核桃[7]、綠豆[8]以及蛋清[9]、酪蛋白[10]、鱈魚皮[11-13]、鳀魚肌肉[14]等蛋白酶解物多肽具有Fe2＋結(jié)合活性，而對于羅非魚皮酶解物多肽（tilapia skin protein peptides，TSPP）的Fe2＋結(jié)合活性研究尚少。因此，本研究以羅非魚加工副產(chǎn)物之一的羅非魚皮為原料，制備Fe2＋結(jié)合活性肽及其肽-Fe2＋結(jié)合物，并探究其結(jié)合過程中結(jié)構(gòu)和活性的變化，為進(jìn)一步制備膳食鐵元素補(bǔ)充劑打下基礎(chǔ)，也可提高羅非魚加工副產(chǎn)物的高值化利用率，提高我國羅非魚產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益以及在國際市場上的競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚皮 廣東百維生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、酪蛋白 合肥博美生物科技有限公司；菲啰嗪 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水硫酸亞鐵（FeSO4）、乙酸鈉（CH3COONa）、冰醋酸（CH3COOH）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）（均為分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、溴化鉀（KBr）（色譜級） 美國Sigma公司；ABTS總抗氧化能力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

凱氏定氮儀 丹麥福斯分析儀器公司；水浴恒溫振蕩器 金壇市精達(dá)儀器制造廠；自動(dòng)電位滴定儀 瑞士萬通公司；SUNRISE吸光酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；熒光分光光度計(jì) 美國VARIAN公司；紫外-可見分光光度計(jì)、紅外光譜儀、高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 TSPP的制備

魚皮解凍洗凈，參照Zhang Yufeng等[15]的方法并稍作修改，按1∶10（g/mL）的比例加入0.05 mol/L的NaOH溶液，室溫下攪拌浸泡30 min后流水洗至中性，隨后按1∶10（g/mL）的比例加入0.05 mol/L的HCl溶液，室溫?cái)嚢杞?0 min后流水洗至中性，瀝干，魚皮打漿，漿液置于60 ℃恒溫水浴加熱5 h后，10 000 r/min離心20 min，取上清液，記下膠液的質(zhì)量，凱氏定氮法測定膠液中蛋白含量。

取一定質(zhì)量的羅非魚皮膠液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%（按膠液蛋白含量為基底）的蛋白酶，在其各自最優(yōu)的酶解條件（表1）下酶解1、2、4、6、8 h，期間保持pH值穩(wěn)定，酶解完成后沸水浴加熱15 min滅酶，冷卻后抽濾，10 000 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥即為TSPP。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Optimal enzymatic conditions for the proteases tested in this study

1.3.2 水解度及Fe2＋結(jié)合率的測定

利用凱氏定氮法測定魚皮總氮質(zhì)量M1（g），自動(dòng)電位滴定法測定酶解液中氨基態(tài)氮的質(zhì)量M2（g），水解度按式（1）計(jì)算：

Fe2＋結(jié)合率通過菲咯嗪比色法測得，參照Wu Haohao等[14]的方法并稍作修改，利用乙酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 5.0）配制5 mg/mL的樣品溶液，取700 μL樣品溶液與100 μL硫酸亞鐵溶液（0.2 mmol/L）混合于96 孔板中，37 ℃保溫2 h后，加入200 μL菲咯嗪溶液（5 mmol/L），室溫下放置10 min后，用酶標(biāo)儀讀取562 nm波長處的吸光度，將酪蛋白的胰蛋白酶酶解物及谷胱甘肽作為陽性對照[14]，F(xiàn)e2＋結(jié)合率按式（2）計(jì)算：

式中：A0為加等體積水的吸光度；A1為加樣品后的吸光度。

1.3.3 TSPP與Fe2＋結(jié)合條件的優(yōu)化

以結(jié)合時(shí)間120 min、pH 5、溫度37 ℃為基礎(chǔ)結(jié)合條件，測定不同結(jié)合時(shí)間（15、30、60、90、120、150、180、210、240 min）、pH值（4、5、6、7）、溫度（4、25、37、60 ℃）對結(jié)合率的影響。

1.3.4 TSPP與Fe2＋結(jié)合過程中熒光光譜掃描

分別將在不同條件下完成結(jié)合反應(yīng)的樣品溶液進(jìn)行熒光光譜掃描，激發(fā)波長為275 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為290～500 nm，間距為0.2 nm。

1.3.5 TSPP與TSPP-Fe2＋結(jié)合物的紫外光譜掃描

分別將乙酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 5）、0.2 mol/L的FeSO4溶液（過濾前后）、5 mg/mL的TSPP溶液、TSPP＋FeSO4溶液（過濾前后）以及5 mg/mL的TSPP-Fe2＋結(jié)合物溶液進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.6 TSPP及TSPP-Fe2＋結(jié)合物的紅外光譜掃描

分別將TSPP、TSPP-Fe2＋結(jié)合物與溴化鉀按1∶5的質(zhì)量比進(jìn)行研磨壓片，進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.7 分子質(zhì)量分布的測定

采用高效體積排阻色譜法測定肽的分子質(zhì)量分布，參照Guo Lidong等[12]方法并略作修改，流動(dòng)相為乙腈（含0.1%三氟乙酸）-水（含0.1%三氟乙酸）體積比20∶80，檢測波長為214 nm，進(jìn)樣體積20 μL（2 mg/mL），流速0.5 mL/min。不同相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)樣品（細(xì)胞色素C，Mr12 400；桿菌肽，Mr6 511.44；抑肽酶，Mr1 422.69；氧化型谷胱甘肽，Mr612.63；還原型谷胱甘肽，Mr307.3）用流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合液，0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，將制備的混合標(biāo)準(zhǔn)品樣品在色譜條件下分析，以相對保留時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，分子質(zhì)量對數(shù)（lgMr）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，相同的條件下檢測TSPP樣品，根據(jù)樣品的保留時(shí)間，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，計(jì)算樣品的分子質(zhì)量分布。

1.3.8 氨基酸含量的測定

參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。

1.3.9 TSPP及TSPP-Fe2＋結(jié)合物抗氧化能力的測定

1.3.9.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照Lu Xin等[16]方法并略作修改，準(zhǔn)確吸取1.00 mL的TSPP樣品溶液（5 mg/mL）與1.00 mL的DPPH-乙醇溶液（0.15 mmol/L，用95%的乙醇溶液溶解）混勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定溶液吸光度As，空白組為1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液，加入1 mL樣液混合，在517 nm波長處測定吸光度Ab，對照組為1 mL的DPPH溶液加上1 mL 95%乙醇溶液，在517 nm波長處測定其吸光度Ac，以谷胱甘肽作陽性對照，DPPH自由基清除率按式（3）計(jì)算：

1.3.9.2 Trolox等效抗氧化能力的測定

參照試劑盒說明書測定樣品的Trolox等效抗氧化能力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用表示，結(jié)果間的差異性采用單因素方法分析（one-way ANOVA），隨后進(jìn)行Tukey多重比較，P＜0.05，差異顯著；采用Origin 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSPP的Fe2＋結(jié)合活性

由圖1可知，在5 種蛋白酶作用下，羅非魚皮蛋白水解度均隨酶解時(shí)間的延長而逐漸增大。5 種蛋白酶對羅非魚皮蛋白水解度由小到大依次為胃蛋白酶＜胰蛋白酶＜堿性蛋白酶＜中性蛋白酶＜復(fù)合蛋白酶，其中復(fù)合蛋白酶8 h的水解度最高，為26.39%。由圖2可知，羅非魚皮蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解（1～8 h）得到的TSPP其Fe2＋結(jié)合率均高于其他4 種蛋白酶的酶解物，且胰蛋白酶2 h的酶解物TSPP其Fe2＋結(jié)合率最高（（83.47±0.1）%），且顯著高于酪蛋白酶解物（46.66±0.68）%和谷胱甘肽（17.71±0.46）%（P＜0.05）。

圖1 不同蛋白酶的水解度隨時(shí)間的變化Fig. 1 Changes in degree of hydrolysis of tilapia skin protein during hydrolysis with different proteases

圖2 各酶解物TSPP的Fe2＋結(jié)合率Fig. 2 Fe2+-chelating rates of hydrolysates with different hydrolysis times

綜合Fe2＋結(jié)合能力及水解度趨勢可知，TSPP的Fe2＋結(jié)合能力不隨水解度的增加而增加，酶解時(shí)間短不能完全酶解蛋白，而酶解時(shí)間過長，生成的游離氨基酸增加，降低結(jié)合活性。不同蛋白酶具有不同的酶活力及酶切位點(diǎn)，其對蛋白的水解程度不同，進(jìn)而影響酶解物TSPP的分子質(zhì)量大小、氨基酸組成及氨基酸序列，胰蛋白酶作為肽鏈內(nèi)切酶，主要作用于肽鏈中精氨酸或賴氨酸殘基的羧基端[17]。根據(jù)圖2結(jié)果，胰蛋白酶2 h的酶解物TSPP具有最高的Fe2＋結(jié)合活性，因此選取胰蛋白酶2 h的TSPP進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

2.2 TSPP與Fe2＋結(jié)合條件的確定

TSPP與Fe2＋的配位結(jié)合反應(yīng)受pH值、溫度、時(shí)間等因素的影響。由圖3可知，當(dāng)pH值為7時(shí)，TSPP與Fe2＋的結(jié)合率極低；當(dāng)pH值小于7時(shí)，結(jié)合率在結(jié)合反應(yīng)的前90 min隨結(jié)合時(shí)間的延長而大幅度上升，且pH值為5時(shí)的結(jié)合率高于pH值為4和6的結(jié)合率；而在結(jié)合反應(yīng)的90～180 min內(nèi)，結(jié)合率無顯著性變化，即結(jié)合反應(yīng)基本完成，最佳的反應(yīng)pH值為5，時(shí)間為90 min。在一定pH值范圍內(nèi)，隨著pH值升高，TSPP與Fe2＋的結(jié)合率升高，當(dāng)pH值大于7時(shí)結(jié)合率降低，原因是在低pH值條件下，H＋易與Fe2＋競爭供電子基團(tuán)，不利于TSPP-Fe2＋結(jié)合物的生成，而在高pH值條件下，羥基易與供電子基團(tuán)爭奪Fe2＋而形成氫氧化物沉淀[18]。

圖3 不同pH值條件下結(jié)合率隨時(shí)間的變化Fig. 3 Changes in Fe2+-chelating rate over time under different pH conditions

圖4 不同溫度條件下結(jié)合率隨時(shí)間的變化Fig. 4 Changes in Fe2+-chelating rate over time under different temperature conditions

溫度既能夠引起TSPP構(gòu)象的改變[19]，又能夠影響配位基團(tuán)與金屬離子結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)[20]。在不同溫度條件下，TSPP的Fe2＋結(jié)合率隨著反應(yīng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化如圖4所示，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，結(jié)合率升高，當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，結(jié)合率最高，當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)，結(jié)合率降低，即升高或降低溫度均造成鳀魚TSPP-Fe2＋結(jié)合能力的下降，該結(jié)果與Wu Haohao等[14]的結(jié)果一致。

因此，綜合pH值、溫度及時(shí)間考慮，pH 5、溫度37 ℃、反應(yīng)時(shí)間90 min為最佳結(jié)合反應(yīng)條件。

2.3 TSPP與Fe2＋結(jié)合過程的熒光光譜分析

在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的研究中，內(nèi)源性熒光發(fā)射強(qiáng)度的下降是典型的肽鏈折疊后的現(xiàn)象，且當(dāng)正電基團(tuán)靠近肽鏈酪氨酸殘基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，蛋白質(zhì)內(nèi)源性熒光光譜會(huì)發(fā)生紅移[21]。圖5為激發(fā)波長為275 nm時(shí)，TSPP與Fe2＋結(jié)合反應(yīng)過程的熒光發(fā)射光譜變化（290～500 nm）。由圖5A可知，隨著TSPP與Fe2＋結(jié)合反應(yīng)的進(jìn)行，TSPP的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度逐漸下降，尤其是在結(jié)合反應(yīng)的0～90 min內(nèi)，熒光強(qiáng)度明顯降低，且光譜發(fā)生了一定的紅移；90～150 min內(nèi)，熒光強(qiáng)度下降的幅度明顯減小，說明90 min后結(jié)合反應(yīng)基本完成。由圖5B可知，當(dāng)結(jié)合反應(yīng)的pH值為5時(shí)，TSPP的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度最低，說明在此pH值條件下，TSPP結(jié)合了Fe2＋，多肽鏈發(fā)生了折疊，且TSPP的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度由小到大依次為pH 5＜pH 6＜pH 4＜pH 7。如圖5C所示，當(dāng)結(jié)合反應(yīng)的溫度為37 ℃，反應(yīng)完成后TSPP的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度最低。綜上可知，當(dāng)反應(yīng)的pH值為5、溫度為37 ℃、反應(yīng)時(shí)間為90 min時(shí)，TSPP的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度基本達(dá)到最低，即結(jié)合反應(yīng)基本完成，與2.2節(jié)結(jié)果一致，即最佳的結(jié)合條件為：pH 5、溫度37 ℃、時(shí)間90 min。

圖5 不同條件下TSPP結(jié)合Fe2＋后其熒光強(qiáng)度的變化Fig. 5 Changes in fluorescence intensity of tilapia skin protein peptides(TSPP) after chelating with Fe2+ under different conditions

金屬離子在蛋白質(zhì)和多肽鏈的折疊過程中起重要作用，特別在肽鏈較短時(shí)，金屬離子可輔助TSPP在水溶液中形成熱力學(xué)穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)[22]。Reddi等[23]研究也表明，TSPP與金屬離子的結(jié)合能可為TSPP的折疊提供能量輔助。肽鏈中含有的芳香族氨基酸如Phe、Trp和Tyr，可產(chǎn)生內(nèi)源性熒光，TSPP與Fe2＋發(fā)生結(jié)合反應(yīng)后，肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，熒光強(qiáng)度的降低可反映出肽-鐵結(jié)合物在形成過程中發(fā)生了肽的折疊[24]。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)e2＋與肽鏈的結(jié)合引起了肽鏈折疊，形成TSPP-Fe2＋結(jié)合物，此結(jié)果與李博等[25]的研究結(jié)果一致。

2.4 TSPP及TSPP-Fe2＋結(jié)合物的紫外光譜分析

在TSPP與金屬離子的結(jié)合反應(yīng)中，TSPP作為配位體，結(jié)合金屬離子后，相應(yīng)原子的價(jià)電子發(fā)生不同程度的躍遷，導(dǎo)致其紫外光吸收性能發(fā)生改變，由此證明TSPP與金屬離子之間發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)[26]。由圖6可知，F(xiàn)e2＋的乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）在230～350 nm波長處形成特征性的寬吸收帶，該溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，其紫外吸收光譜與乙酸鈉緩沖液的光譜基本一致，特征性吸收帶消失，說明Fe2＋在乙酸鈉緩沖液中水解形成了鐵氫氧化物沉淀。緩沖液＋TSPP＋Fe2＋的反應(yīng)溶液在250～280 nm波長處形成特征性的吸收帶，且反應(yīng)溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾前后，其紫外吸收帶基本一致，說明Fe2＋在含有TSPP的緩沖液中不水解形成鐵氫氧化物沉淀，此外，TSPP-Fe2＋結(jié)合物的紫外吸收帶與TSPP的相似，但出現(xiàn)紅移，說明TSPP介入了FeSO4在緩沖液中的水解過程，TSPP結(jié)合Fe2＋后，減少了溶液中鐵氫氧化物膠體粒子的形成，而形成新物質(zhì)TSPP-Fe2＋結(jié)合物，該結(jié)果與Wu Haohao等[27]研究結(jié)果相似。Yuan Biao等[28]研究也發(fā)現(xiàn)，灰樹花蛋白結(jié)合Fe2＋前后，其紫外最大吸收峰從194 nm移至192 nm，灰樹花-Fe2＋的最大吸收波長向短波方向移動(dòng)，這可能是由于Fe2＋的結(jié)合過程中羰基氧原子的變化所致。

圖6 TSPP及TSPP-Fe2＋結(jié)合物的紫外光譜Fig. 6 UV absorption spectra of TSPP and TSPP-Fe2+ complex

2.5 TSPP及TSPP-Fe2＋結(jié)合物的紅外光譜分析

紅外光譜中基團(tuán)特征性吸收峰的改變可反映出金屬離子與肽鏈中有機(jī)配位體的相互作用，且肽鏈中氨基、羰基、羧基的特征性吸收峰分別在3 300～3 600、1 600～1 700、1 400～1 500 cm-1左右[29]。由圖7可知，TSPP與Fe2＋結(jié)合后，在特征區(qū)，氨基的伸縮振動(dòng)吸收峰從3 317.56 cm-1移動(dòng)至3 315.63 cm-1；酰胺I帶即羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰從1 653.00 cm-1移動(dòng)至1 656.85 cm-1；羧基反對稱伸縮振動(dòng)吸收峰從1 533.41 cm-1移動(dòng)到1 537.27 cm-1，其對稱伸縮振動(dòng)峰從1 436.97 cm-1移動(dòng)到1 440.83 cm-1，且吸收峰的強(qiáng)度均有所增加。由于結(jié)合前后，肽鏈結(jié)構(gòu)構(gòu)型的改變，引起了紅外吸收峰的移動(dòng)變化，說明肽鏈中的氨基、羰基及羧基參與了Fe2＋的結(jié)合，進(jìn)而形成了TSPP-Fe2＋結(jié)合物。Huang Guangrong等[30]通過紅外光譜發(fā)現(xiàn)蝦加工副產(chǎn)物水解產(chǎn)物的Fe2＋結(jié)合的位點(diǎn)主要對應(yīng)于羧酸酯基團(tuán)。Chen Qianru等[31]研究利用MS2技術(shù)發(fā)現(xiàn)Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly中組氨酸的咪唑環(huán)可能是潛在的Fe2＋結(jié)合位點(diǎn)。林慧敏等[32]利用核磁共振及紅外光譜結(jié)構(gòu)表征顯示，肽鏈His-Tyr-Asp中的—NH—、—NH2以及末端—COOH上的—C＝O及—OH與Fe2＋發(fā)生結(jié)合，形成不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的結(jié)合物。Wu Haohao等[27]發(fā)現(xiàn)鳀魚蛋白Fe3＋結(jié)合活性肽myosin1116-1127側(cè)鏈的羧基是Fe3＋的結(jié)合位點(diǎn)，即肽鏈羧基結(jié)合Fe3＋形成COO—Fe，再水解形成COO—Fe(OH)n，最后脫水縮合完成晶體形成。

圖7 TSPP及TSPP-Fe2＋結(jié)合物紅外光譜Fig. 7 FTIR spectra of TSPP and TSPP-Fe2+ complexes

2.6 TSPP的分子質(zhì)量分布

圖8 TSPP的分子質(zhì)量分布Fig. 8 Molecular mass distribution of TSPP with different hydrolysis times

蛋白質(zhì)在不同的酶解時(shí)間下，生成的酶解物中含有各種不同分子質(zhì)量大小的TSPP，且每一種分子質(zhì)量的TSPP在不同酶解物中的含量不同。由圖8可知，隨著胰蛋白酶酶解時(shí)間的延長，羅非魚皮蛋白酶解物中大分子質(zhì)量（＞3 000 Da）的TSPP逐漸減少，小分子質(zhì)量（＜3 000 Da）的TSPP逐漸增多；且2 h的酶解物中500～3 000 Da之間的TSPP含量（90.40%）高于其他酶解時(shí)間點(diǎn)下同等分子質(zhì)量的酶解物。大部分研究表明分子質(zhì)量在1 500 Da范圍內(nèi)的多肽，其Fe3＋和Fe2＋結(jié)合活性較高，從豬血漿蛋白水解物中鑒定出的Fe2＋結(jié)合活性肽為1 055 Da[33]，從核桃蛋白水解物中分離鑒定的2 條Fe3＋結(jié)合活性肽的分子質(zhì)量分別為971.508 0 Da和1 357.648 0 Da[7]。結(jié)合2.2節(jié)的結(jié)果（胰蛋白酶2 h的TSPP-Fe2＋結(jié)合活性最高），推測出羅非魚皮蛋白Fe2＋結(jié)合活性肽的分子質(zhì)量很可能在500～3 000 Da之間。

2.7 TSPP氨基酸含量的分析

蛋白酶具有特殊的酶切位點(diǎn)，在酶解蛋白后可生成特殊氨基酸組成及序列的多肽，從而具有特殊的生物活性。由表2可知，羅非魚皮中Asp、Glu、Gly、Ala、Arg及Pro含量較高，羅非魚皮蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解2 h后得到的TSPP，上述6 種氨基酸在其酶解物中的含量均增加了3 倍左右，且高于其他氨基酸。根據(jù)路易斯規(guī)則，充當(dāng)路易斯酸的Fe3＋和Fe2＋可以與富含氧或富含氮的基團(tuán)（路易斯堿）反應(yīng)，如Arg、Asn中的氨基等含氮基團(tuán)或Glu、Asp中的羧基和磷酸基等含氧基團(tuán)[34]。紀(jì)曉雯等[10]分離出的酪蛋白Fe2＋結(jié)合活性肽富含Glu、Asp、Gln。Budseekoad等[8]發(fā)現(xiàn)Pro-Ala-Ile-Asp-Leu與Fe2＋結(jié)合的能力可能與肽鏈中的Pro、Asp和Leu中的吡咯烷環(huán)、羧基和烷基的協(xié)同效應(yīng)有關(guān)。Wu Haohao等[14]從鳀魚肌肉蛋白的胰蛋白酶水解物中分離并表征出的Fe3＋結(jié)合活性肽Ser-(Gly)7-Leu-Gly-Ser-(Gly)2-Ser-Ile-Arg、Ile-(Glu)2-Leu-(Glu)3-Ile-Glu-Ala-Glu-Arg，其Glu和Gly含量占肽鏈氨基酸總量60%及以上。綜上說明，酶解物中的Asp、Glu、Gly、Arg及Pro在Fe2＋結(jié)合活性中起重要作用。

表2 羅非魚皮和TSPP中氨基酸的成分及含量Table 2 Amino acid composition of tilapia skin protein and 2 h trypsin hydrolysate

2.8 TSPP及TSPP-Fe2＋結(jié)合物的抗氧化能力分析

Fe2＋結(jié)合活性肽及肽-Fe2＋結(jié)合物的主要作用是促進(jìn)鐵元素在人體中的吸收，除此之外，還具有抗氧化活性[35]。由圖9可知，5 mg/mL質(zhì)量濃度下的TSPP對DPPH自由基具有一定的清除能力，且胰蛋白酶各酶解時(shí)間點(diǎn)下的TSPP，其DPPH自由基清除能力均高于其他蛋白酶的TSPP；此外，TSPP結(jié)合Fe2＋形成TSPP-Fe2＋結(jié)合物后，其DPPH自由基清除率由42.47%降低為37.63%，變化不顯著，但均顯著低于谷胱甘肽（95.97%）。由圖10可知，在Trolox等效抗氧化能力中，堿性蛋白酶酶解8 h TSPP的等效抗氧化能力高于其他TSPP，此外，TSPP結(jié)合Fe2＋后，其Trolox等效抗氧化能力從0.014 2 mmol/L降低為0.011 5 mmol/L，均顯著低于谷胱甘肽（0.849 1 mmol/L）。研究指出，TSPP的抗氧化活性與肽鏈中的氨基酸組成及含量息息相關(guān)，大多數(shù)抗氧化肽富含Trp、Phe、Leu、Gly、Val等疏水性氨基酸以及Tyr、Phe、Trp等芳香族氨基酸，疏水性氨基酸殘基通過提供電子或供體電子穩(wěn)定活性自由基，芳香族氨基酸殘基可作為氫供體，抑制自由基介導(dǎo)的過氧化鏈反應(yīng)，肽的支鏈氨基酸（Val、Leu和Ile）和非極性脂肪族氨基酸（Leu和Ala）對肽的抗氧化活性也有很大的貢獻(xiàn)[36-38]。綜合TSPP氨基酸組成及含量的結(jié)果，TSPP中主要含有Asp、Glu、Gly、Arg及Pro，在Fe2＋結(jié)合活性中，TSPP的結(jié)合活性高于谷胱甘肽，而在抗氧化活性中，谷胱甘肽的活性高于TSPP，由此說明，不同的TSPP具有不同的氨基酸組成及含量，決定其特殊的生物活性。

圖9 TSPP及TSPP-Fe2＋結(jié)合物的DPPH清除活性Fig. 9 DPPH scavenging activity of TSPP and TSPP-Fe2+ complexes

圖10 TSPP及TSPP-Fe2＋結(jié)合物的Trolox等效抗氧化能力Fig. 10 Trolox equivalent antioxidant capacity of TSPP and TSPP-Fe2+ complexes

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以羅非魚皮為原料，進(jìn)行了羅非魚皮蛋白TSPP-Fe2＋結(jié)合物的制備及其結(jié)合條件、結(jié)構(gòu)特征、生物活性的探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSPP的Fe2＋結(jié)合活性不隨蛋白水解度的增加而增加，且胰蛋白酶酶解2 h的TSPP，其Fe2＋結(jié)合率最高；TSPP與Fe2＋的結(jié)合率受pH值、溫度和時(shí)間的影響，當(dāng)pH值為5、溫度為37 ℃、時(shí)間為90 min時(shí)，結(jié)合反應(yīng)基本完成；TSPP結(jié)合Fe2＋后，其內(nèi)源性熒光強(qiáng)度降低且光譜發(fā)生紅移，說明結(jié)合后，肽鏈發(fā)生了折疊；TSPP結(jié)合Fe2＋前后，其紫外光吸收帶的位移表明TSPP結(jié)合Fe2＋后形成了新物質(zhì)；根據(jù)TSPP及TSPP-Fe2＋結(jié)合物的紅外光譜推測出肽鏈中的氨基、羰基、羧基參與了Fe2＋的結(jié)合；TSPP中的Fe2＋結(jié)合活性肽，其分子質(zhì)量大約在500～3 000 Da之間；此外，肽鏈中的Asp、Glu、Gly、Arg及Pro在Fe2＋結(jié)合活性中起關(guān)鍵作用；TSPP具有一定的抗氧化能力，但TSPP的抗氧化能力顯著低于谷胱甘肽，而其Fe2＋結(jié)合能力顯著高于谷胱甘肽，說明不同的肽段具有不同的氨基酸組成及含量，進(jìn)而決定了其生物活性的特異性。由于蛋白酶解物中含有各種不同分子質(zhì)量大小及氨基酸組成的肽段，需對其進(jìn)行分離純化、序列鑒定以及生物利用度的測定，以期為膳食鐵元素補(bǔ)充劑的研究及開發(fā)提供依據(jù)。