超聲法制備銅納米簇并應(yīng)用于谷胱甘肽檢測(cè)

張雨婷，高鵬飛，李天棟，2，雙少敏，張彥*

（1.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；2.浙江傳化智聯(lián)股份有限公司，浙江 杭州 311215）

0 引言

金屬納米簇是一種尺寸小于2 nm的超小納米粒子，因其熒光性能強(qiáng)、Stocks位移大、光穩(wěn)定性和水溶性好、抗光漂白能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，納米粒子合成和表征引起了諸多關(guān)注[1-3]。由于金屬納米簇的粒徑一般小于2 nm，表面能非常大，易團(tuán)聚成不發(fā)光的大顆粒，因此，制備穩(wěn)定性好的金屬納米簇有十分重要的科學(xué)意義。與金銀等貴金屬納米簇相比，銅納米簇有著不可比擬的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，并且電化學(xué)性能好，熒光性強(qiáng)，生物相容性良好[4-9]。銅納米簇作為一類新型的光致發(fā)光和納米催化材料，在光致發(fā)光分析，生物探針成像和催化等領(lǐng)域越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注，是一類較為理想的金屬納米簇材料。目前已有采用脫氧核糖核酸（DNA）、肽、蛋白質(zhì)、小分子配體和聚合物等作為模板制備銅納米簇的文獻(xiàn)報(bào)道。如：Mao等將DNA先在90oC加熱10 min后，加入硫酸銅和抗壞血酸還原劑在25oC下孵育15 min制備得到銅納米簇[10]。Luo等以谷胱甘肽作為還原劑和配體保護(hù)劑，在生理溫度（37oC）下，1 h內(nèi)合成了銅納米簇[11]。Wang等采用牛血清白蛋白作為穩(wěn)定劑，水合肼作為還原劑，制備了水溶性好的熒光銅納米簇[12]。Li等利用腐殖酸作為還原劑和穩(wěn)定劑，在600oC下反應(yīng)2 h合成穩(wěn)定的銅納米簇[13]。Wang等以抗壞血酸作為還原劑，制備了聚乙烯吡咯烷酮負(fù)載的銅納米簇[14]。但是目前已報(bào)道的方法需要在加熱條件下進(jìn)行，或者需要加入水合肼、抗壞血酸等還原劑，獲得環(huán)保、綠色、簡(jiǎn)單的化學(xué)合成方法一直都是研究者努力的方向。超聲法具有效率高，儀器要求低，成本低廉以及處理時(shí)間短，因此被認(rèn)為是新型“綠色”技術(shù)[15]。2-巰基-5-苯并咪唑磺酸鈉（MBISA）是一種帶有巰基基團(tuán)和咪唑環(huán)的化合物，已有文獻(xiàn)報(bào)道以MBISA作為保護(hù)劑，采用硼氫化鈉作還原劑制備了金納米粒子[16]，說(shuō)明MBISA中含有的巰基可以與貴金屬形成較強(qiáng)的鍵合作用，且MBISA中含有的磺酸基可使形成的納米簇具有良好的水溶性及良好的生物相容性。本文采用MBISA為配體及還原劑，以超聲化學(xué)法制備了熒光銅納米簇。

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是一種廣泛存在于體內(nèi)的小分子肽，能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用，許多疾病的產(chǎn)生與體內(nèi)谷胱甘肽的含量變化有關(guān)[17-18]，因此，準(zhǔn)確檢測(cè)GSH含量在健康掃描、疾病檢測(cè)等方面用途廣泛，具有重要的研究?jī)r(jià)值[19-20]。目前，測(cè)定谷胱甘肽的常用方法有：高效液相色譜法[21]、毛細(xì)管電泳法[22]、分光光度法[23]、電化學(xué)法[24]、酶法[25]、熒光分析法[26]等，與其他方法相比，熒光分析法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高及能夠可視化觀察等優(yōu)點(diǎn)[27-29]。本文制備的MBISA保護(hù)的銅納米簇在GSH的存在下熒光強(qiáng)度會(huì)有所增強(qiáng)，且熒光強(qiáng)度和GSH濃度有良好的線性關(guān)系，基于此建立了可選擇性測(cè)定GSH的檢測(cè)新方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

三水合硝酸銅，上海阿拉丁試劑有限公司（99%）；2-巰基-5-苯并咪唑磺酸鈉（MBISA），美國(guó)ALDRICH公司（98%）；谷胱甘肽（GSH），阿拉?。?9.99%）。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Hitachi，U-2910）；愛(ài)丁堡穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀（FLS920）；紅外光譜儀（珀金埃爾默儀器有限公司，Paragon 1000）；納米粒徑電位分析儀（馬爾文，NanoZS90）；超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-ⅡD）；透射電子顯微鏡（JEOL有限公司，JEM-2100）。

1.2 銅納米簇的制備

在 10 mL離心管中分別加入 100 μL Cu（NO3）2（0.1 mol·L-1），300 μL MBISA（0.1 mol·L-1）和 4.6 mL二次去離子水，搖勻后用1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.30，此時(shí)的產(chǎn)物標(biāo)記為Cu（I）-MBISA配合物，再將其置于300 W的超聲波細(xì)胞粉碎儀中超聲反應(yīng)15 min，得到MBISA@CuNCs，于4℃下保存用于后續(xù)分析。

為了優(yōu)化合成條件，在不同反應(yīng)條件下制備了一系列CuNCs，并測(cè)定了其熒光強(qiáng)度。反應(yīng)條件如下：Cu（NO3）2·3H2O 和 MBISA 的物質(zhì)的量比為 1∶1，1∶3，1∶6，1∶9，1∶12、反應(yīng) pH 值為 5.70，5.90，6.10，6.30，6.50，6.70，6.90以及超聲反應(yīng)時(shí)間為0，5，10，15，20，25，30，35，40，45 min。

1.3 銅納米簇的表征

將 100 μL MBISA@CuNCs和 2 mL 的磷酸緩沖液（PBS，pH 6.3，0.03 mol·L-1）混合，測(cè)定其紫外-可見(jiàn)吸收光譜，激發(fā)、發(fā)射光譜，熒光壽命，并進(jìn)行納米粒徑電位分析測(cè)定Zeta電位值。將少量的MBISA@CuNCs固體粉末與KBr粉末混合，壓片后掃描其在4 000 cm-1～375 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的紅外吸收光譜。將MBISA@CuNCs水溶液滴加到超薄碳膜上，完全干燥后進(jìn)行透射電子顯微鏡測(cè)試。

1.4 谷胱甘肽的測(cè)定實(shí)驗(yàn)

將10 μL不同濃度的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液加入含有100 μL CuNCs的 PBS緩沖液中（2.0 mL，0.03 mol·L-1，pH 6.3），分別測(cè)定熒光光譜。并測(cè)定在體系中加入銅納米簇和14種其它小分子干擾物（氨基葡萄糖、維生素B1、維生素B6、維生素B12、N-羥基琥珀酰亞胺、D，L-半胱氨酸、D，L-苯丙氨酸、高半胱氨酸、谷氨酰胺、L-半胱氨酸、NAC、天門冬氨酸、維生素C、纈氨酸）的熒光光譜。

將 1.5 mL 不同 Cu（NO3）2·3H2O 和 MBISA 摩爾比下制備好的CuNCs分別滴加在剪好的濾紙條上，再滴加 10 μL GSH（0.01 μmol·L-1），自然風(fēng)干后分別在日光和365 nm的紫外燈下觀察濾紙條的顏色。

1.5 實(shí)際樣品中谷胱甘肽含量的檢測(cè)

水樣取自我校令德湖水、迎澤公園湖水和實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水，血清樣品取自我校校醫(yī)院。使用過(guò)濾器將水樣過(guò)濾，除去水中雜質(zhì)，以10 000 r·min-1離心10 min，將血清稀釋20倍。將1.0 mL水樣/血樣、100 μL 的 MBISA@CuNCs和 1.0 mL PBS 緩沖溶液混合，測(cè)定熒光光譜，并分別將1.5、3.0和15.0 μmol·L-1的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液加入上述溶液中，測(cè)其熒光光譜。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 CuNCs的性能表征

采用紫外-可見(jiàn)吸收光譜、熒光光譜、透射電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜和納米粒徑電位分析對(duì)制備的MBISA@CuNCs進(jìn)行了表征。圖1A為MBISA，Cu（NO3）2·3H2O，CuNCs 和 CuNCs＋GSH 的UV-vis吸收光譜圖。從MBISA-CuNCs的光譜圖中觀察到其在332 nm處有一個(gè)較為明顯的吸收峰，這與配體 MBISA及Cu（NO3）2·3H2O的吸收光譜有明顯的區(qū)別，且在300 nm～400 nm范圍內(nèi)，吸收強(qiáng)度逐漸減低，符合納米團(tuán)簇的吸收特征[11]。圖1B為CuNCs的熒光光譜圖，分別在332 nm和642 nm處顯示最大激發(fā)和發(fā)射峰，較大的斯托克斯位移（310 nm）可以避免激發(fā)和發(fā)射峰的重疊。銅納米簇在332 nm處的吸收峰信號(hào)與熒光激發(fā)光譜相一致。從TEM表征結(jié)果（圖1C）可看出MBISA@CuNCs呈現(xiàn)球形，無(wú)明顯聚集，分散性較好，且從圖1C插圖可觀察到明顯的晶格結(jié)構(gòu)，從粒徑分布直方圖（圖1D）中可得CuNCs的平均粒徑為2.8 nm。

圖1 （A）紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖。a線：MBISA，b線：CuNCs+GSH，c線：Cu（NO3）2，d線：CuNCs；（B）CuNCs的激發(fā)和發(fā)射熒光光譜圖。Ex：激發(fā)光譜，Em：發(fā)射光譜；（C）CuNCs的HRTEM圖。（D）CuNCs的粒徑分布直方圖Fig.1 （A）UV-visible absorption spectra.a：MBISA，b：CuNCs+GSH，c：Cu（NO3）2·3H2O，d：CuNCs；（B）Fluorescence excitation and emission spectra of CuNCs.Ex：excitation，Em：emission spectra.（C）HRTEM image of the as prepared CuNCs；（D）The particle size histogram from several TEM images

比較配體MBISA和CuNCs的IR光譜圖（圖2A），結(jié)果表明MBISA的S-H拉伸帶（2 580 cm-1）在CuNCs的光譜中消失，說(shuō)明MBISA分子在銅納米簇中形成了硫醇鹽。3 394 cm-1處的吸收峰可歸屬于MBISA的仲胺υNH，1 625 cm-1～1 450 cm-1處的吸收帶歸屬于苯環(huán)框架振動(dòng)。與游離MBISA相比，CuNCs在1 653 cm-1處的吸收峰藍(lán)移了29 cm-1，且歸屬于C=N雙鍵組的在1 690 cm-1～1 500 cm-1范圍內(nèi)吸收峰變的松散，可能是歸因于Cu原子的誘導(dǎo)效應(yīng)和MBISA的官能團(tuán)與CuNCs之間的相互作用。此外，由于傳導(dǎo)電子的影響，與配體MBISA相比，CuNCs在＜1 400 cm-1的吸收帶中的精細(xì)結(jié)構(gòu)變寬。動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CuNCs在332 nm的紫外光照射50 min后仍保持95%以上的熒光強(qiáng)度，如圖2B所示，說(shuō)明CuNCs具有良好的抗光漂白性。對(duì)CuNCs的納米粒徑電位分析結(jié)果可知，MBISA@CuNCs的Zeta電位為-18.1 mV，如圖2C所示，表明該納米簇帶負(fù)電荷，在水溶液中有良好的穩(wěn)定性。

圖2 （A）MBISA、CuNCs和CuNCs+GSH的傅里葉紅外光譜圖。a線：CuNCs，b線：CuNCs+GSH，c線：MBISA；（B）CuNCs動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性曲線圖；（C）CuNCs和CuNCs+GSH的Zeta電位圖。a柱：CuNCs，b柱：CuNCs+GSHFig.2 （A）FTIR spectra of MBISA，CuNCs and CuNCs+GSH.a：CuNCs，b：CuNCs+GSH，c：MBISA；（B）Kinetic stability curve of CuNCs；（C）Zeta potentials of CuNCs and CuNCs+GSH.a：CuNCs and b：CuNCs+GSH

2.2 CuNCs的合成

首先硝酸銅水溶液和2-巰基-5-苯并咪唑磺酸二水合鈉鹽（MBISA）水溶液混合，MBISA通過(guò)咪唑環(huán)與二價(jià)銅Cu（Ⅱ）發(fā)生配位形成Cu（Ⅱ）-MBISA配合物；使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6.3，由于2-巰基-5-苯并咪唑磺酸二水合鈉鹽（MBISA）中苯并咪唑的pKa約為5.53，所以此時(shí)其中的咪唑環(huán)是一個(gè)富電子中心，其還原性增強(qiáng)，可把Cu（Ⅱ）還原為Cu（I），形成 Cu（I）-MBISA 配合物；在 300 W 功率的超聲環(huán)境中反應(yīng)15 min，一部分Cu（I）-MBISA配合物在超聲波的能量下被還原為零價(jià)Cu并聚集成Cu核，未被還原的Cu（I）-MBISA配合物的聚集在零價(jià)Cu核周圍，形成了銅納米簇。

為了制備出最佳熒光性能的MBISA@CuNCs，本文通過(guò)單一變量法分別探索了MBISA與Cu（NO3）2·3H2O物質(zhì)的量之比、pH條件、超聲時(shí)間等主要合成條件對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響。圖3A中結(jié)果表明當(dāng) MBISA與 Cu（NO3）2·3H2O物質(zhì)的量之比為1∶3時(shí)銅納米簇的熒光強(qiáng)度最高，且試紙條的顯色也得同樣的結(jié)果（圖3B）。從圖3C結(jié)果可得在合成過(guò)程中pH值為6.3時(shí)，MBISA@CuNCs的熒光強(qiáng)度最高。這是由于當(dāng)pH值為6.30時(shí)，MBISA的咪唑環(huán)完全成為一個(gè)富電子中心，還原能力最強(qiáng)，當(dāng)pH值大于或小于這個(gè)值時(shí)就會(huì)降低MBISA中咪唑環(huán)的還原性，造成銅納米簇的熒光強(qiáng)度降低。部分Cu（I）-MBISA配合物在超聲環(huán)境中被還原，未被還原的Cu（I）-MBISA配合物的聚集在零價(jià)Cu核周圍，形成了銅納米簇。通過(guò)對(duì)照未超聲的產(chǎn)物（Cu（I）-MBISA配合物）的吸收和熒光光譜，如圖3D所示，CuNCs在310 nm～380 nm處吸收峰強(qiáng)度比Cu（I）-MBISA配合物的高，且熒光強(qiáng)度提高了約6倍。從圖3D插圖的照片可看出超聲后的銅納米簇水溶液日光下呈偏黃色，而未超聲的產(chǎn)物（Cu（I）-MBISA配合物）在日光下呈現(xiàn)藍(lán)色。如圖3D插圖所示，超聲時(shí)間為15 min～20 min熒光強(qiáng)度最高，本著省時(shí)經(jīng)濟(jì)，選擇超聲15 min繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 （A）不同Cu（NO3）2·3H2O和MBISA摩爾比下合成的CuNCs的熒光光譜圖，插圖為Cu（NO3）2·3H2O和MBISA的摩爾比對(duì)合成CuNCs的熒光強(qiáng)度影響；（B）在自然光和365 nm紫外燈照射下有無(wú)加入GSH的CuNCs在濾紙上的照片（從左到右依次為 Cu（NO3）2·3H2O和MBISA摩爾比為1∶1，1∶3，1∶6，1∶9，1∶12下合成的 CuNCs）。上圖為在自然光下拍攝，下圖為在365 nm紫外燈下拍攝；（C）不同pH下合成的CuNCs的熒光光譜圖，插圖為pH值對(duì)合成CuNCs的熒光強(qiáng)度的影響；（D）a和c線為Cu（I）-MBISA配合物的紫外可見(jiàn)吸收和熒光發(fā)射光譜，b和d線為CuNCs的紫外可見(jiàn)吸收和熒光發(fā)射光譜。插圖為超聲時(shí)間對(duì)CuNCs的熒光強(qiáng)度影響。插圖圖片為Cu（I）-MBISA配合物（左圖）和CuNCs在日光下的照片（右圖）Fig.3 （A）Fluorescence spectra of CuNCs synthesized under different mole ratio of Cu（NO3）2·3H2O and MBISA；（B）Photographs show the filter paper added CuNCs with and without GSH under sun light and 365 nm UV light；（C）Fluorescence spectra of CuNCs synthesized under different pH；（D）UV-visible absorption and fluorescence spectra of Cu（I）-MBISA complex（a and c）and CuNCs（b and d）.Inset：effect of ultrasonic time on the fluorescence intensity of CuNCs.Inset pictures：the photographs of Cu（I）-MBISA complex（left）and CuNCs（right）under sun light

2.3 探究CuNCs的選擇性

選擇性是判斷一個(gè)傳感器能否良好的應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)的關(guān)鍵因素。因此，在實(shí)驗(yàn)條件最佳情況下，考察各種可能存在的物質(zhì)對(duì)銅納米簇探針熒光強(qiáng)度的影響。如圖4A所示，在332 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定加入不同小分子后CuNCs的熒光強(qiáng)度，結(jié)果表示GSH的加入能顯著增強(qiáng)CuNCs的熒光，其他潛在干擾物對(duì)其熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)影響，說(shuō)明該CuNCs對(duì)GSH具有良好的選擇性。如圖4B所示，在自然光下和365 nm紫外燈下加入不同小分子后銅納米簇的顏色變化，其中加入GSH后CuNCs在紫外燈照射下有明顯的熒光增強(qiáng)，說(shuō)明該CuNCs可選擇性識(shí)別GSH。

圖4 （A）在不同小分子存在下CuNCs的熒光強(qiáng)度圖，濃度：GSH：0.01 μmol·L-1，其他小分子：0.1 μmol·L-1（1：氨基葡萄糖、2：谷胱甘肽、3：VB6、4：VB12、5：N-羥基琥珀酰亞胺、6：D，L-半胱氨酸、7：D，L-苯丙氨酸、8：高半胱氨酸、9：VB1、10：谷氨酰胺、11：L-半胱氨酸、12：NAC、13：天門冬氨酸、14：VC、15：纈氨酸）；（B）在日光和365 nm紫外燈照射下CuNCs的照片F(xiàn)ig.4 （A）Fluorescence intensities of CuNCs with other small molecules.GSH：0.01 μmol·L-1，other small molecules：0.1 μmol·L-1（1：Glucosamine，2：glutathione peptide，3：VB6，4：VB12，5：N-hydroxysuccinimide，6：D，L-cysteine，7：D，L-phenylalanine，8：homocysteine，9：VB1，10：glutamine，11：L-cysteine，12：NAC，13：aspartate，14：VC，15：proline）；（B）Photographs of CuNCs under sun light and 365 nm UV lamp

2.4 GSH的檢測(cè)條件優(yōu)化

MBISA@CuNCs的量和孵育時(shí)間等因素均會(huì)影響GSH的檢測(cè)?？疾炝薓BISA@CuNCs的用量在20 μL～200 μL范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化如圖5A，并向其中加入 0.01 μmol·L-1的 GSH，得到熒光強(qiáng)度的升高值F-F0，其中F0代表MBISA@CuNCs的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)代表MBISA@CuNCs中加入GSH的熒光強(qiáng)度，從圖中可看出在CuNCs用量為120 μL時(shí)F-F0值最大，故選取 120 μL CuNCs的量作為GSH的最佳檢測(cè)用量。此外，還考察了孵育時(shí)間對(duì)MBISA@CuNCs熒光強(qiáng)度的影響（圖5B）。CuNCs中加入 0.01 μmol·L-1的 GSH，其熒光強(qiáng)度在 6 min之內(nèi)迅速增大，之后熒光強(qiáng)度逐漸穩(wěn)定不再增加，說(shuō)明此時(shí)二者之間的作用達(dá)到平衡，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇孵育時(shí)間為6 min，較短的孵育時(shí)間為體系的快速檢測(cè)提供了可能。此外，如圖3B可知，在MBISA與 Cu（NO3）2·3H2O 物質(zhì)的量之比為 1∶3 時(shí)，在 365 nm紫外燈下滴加GSH的MBISA@CuNCs的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)最明顯。

圖5 （A）MBISA@CuNCs用量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。（B）孵育時(shí)間對(duì)MBISA@CuNCs熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 （A）Effect of MBISA@CuNCs amount on fluorescence intensity.（B）Effect of incubation time on fluorescence intensity of MBISA@CuNCs

2.5 GSH的檢測(cè)機(jī)理

本文進(jìn)一步探討了CuNCs對(duì)GSH的檢測(cè)機(jī)理，由圖2A的紅外光譜圖中我們可以看出，CuNCs加入GSH前后的紅外吸收光譜無(wú)明顯變化，表明配體中的殘基并未與GSH發(fā)生反應(yīng)。因此，CuNCs熒光強(qiáng)度的增加并非源自GSH與CuNCs表面上的MBISA之間的相互作用，可能是由GSH與CuNCs的Cu核發(fā)生了作用[30]。由圖2C可得加入GSH后CuNCs的Zeta電位為-19.7 mV，與CuNCs的Zeta電位值（-18.1 mV）相比變化不大，進(jìn)一步證明CuNCs熒光增強(qiáng)并不是由于CuNCs表面上的配體MBISA與GSH作用所致。TEM表征結(jié)果（圖6A）表明CuNCs中加入GSH后，銅納米簇被GSH誘導(dǎo)發(fā)生了聚集，并進(jìn)一步聚集成更大的聚集體，其平均粒徑為118 nm（圖6B）。因此，CuNCs對(duì)GSH的高選擇性識(shí)別作用可解釋為是基于聚集誘導(dǎo)的發(fā)射增強(qiáng)效應(yīng)。從加入不同濃度GSH的CuNCs的紫外吸收光譜圖（圖6C）可看出加入GSH后CuNCs的吸收峰無(wú)明顯變化，并無(wú)觀察到銅納米粒子的表面等離子體吸收峰，因此推測(cè)聚集后的較大粒徑的銅納米簇在尺寸和形態(tài)上也均是單分散的，這為分析應(yīng)用提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[31]。CuNCs的吸收強(qiáng)度隨GSH濃度的增大逐漸降低，表明由GSH引起的CuNCs的熒光增強(qiáng)作用僅僅發(fā)生在基態(tài)之間。這和熒光壽命測(cè)試結(jié)果一致，如圖6D所示，CuNCs的壽命為 0.70 ns（χ2=1.141），在加入GSH 后 ，CuNCs的壽命為 0.81 ns（χ2=1.072）。熒光壽命基本無(wú)變化，說(shuō)明GSH的加入沒(méi)有改變CuNCs的配體/配體，配體/金屬和金屬/金屬之間的相互作用（LMMCT），電荷由配體轉(zhuǎn)移到 Cu（I）-Cu（0）原子。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，加入GSH后的熒光增強(qiáng)是由GSH誘導(dǎo)CuNCs的聚集，產(chǎn)生了聚集誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)效應(yīng)引起的。

圖6 （A）和（B）分別為 CuNCs中加入10 μL 0.01 μmol·L-1GSH后的TEM圖和其粒徑分布直方圖；（C）向CuNCs滴加不同濃度 GSH后的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖；1-7分別滴加了10，20，40，100，380，740 μL的GSH（0.01 μmol·L-1）；（D）CuNCs的熒光壽命曲線圖。a線：CuNCs，b線：CuNCs中加入了 10 μL 0.01 μmol·L-1的 GSHFig.6 （A）and（B）are TEM image of the CuNC with 10 μL 0.01 μmol·L-1GSH and the particle size histogram respectively；（C）UV-visible absorption spectra of CuNCs in the presence of various concentrations of GSH；1-7 represent addition of 0，10，20，40，100，380，740 μL GSH（0.01 μmol·L-1）respectively；（D）Fluorescence decay spectra of CuNCs without（a）and with 10 μL 0.01 μmol·L-1GSH（b）

2.6 CuNCs對(duì)GSH傳感的靈敏度

所制備的MBISA@CuNCs的發(fā)光可以被GSH有效地增強(qiáng)，據(jù)此研究了測(cè)定谷胱甘肽濃度的熒光增強(qiáng)型化學(xué)傳感方法。加入不同濃度GSH的MBISA@CuNCs的熒光光譜如圖7A所示，隨著GSH濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。圖7B是熒光強(qiáng)度F對(duì)GSH濃度的谷胱甘肽濃度的依賴性，其中F是加入GSH后CuNCs的熒光強(qiáng)度值?？傻肎SH檢測(cè)線性范圍為6.59×10-7mol·L-1至 4.26×10-5mol·L-1，相關(guān)系數(shù)R2為0.996。在信噪比為3時(shí)，檢測(cè)限為4.46×10-7mol·L-1。

圖7 （A）加入不同濃度的GSH后CuNCs的熒光光譜圖；（B）熒光強(qiáng)度F與GSH濃度的線性關(guān)系Fig.7 （A）Fluorescence spectra of CuNCs with different concentrations of GSH.（B）Linear relationship between relative fluorescence intensity F and GSH concentration

2.7 實(shí)際樣品中GSH含量的檢測(cè)

GSH在生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，因此檢測(cè)飲用水、生活用水以及血清中的GSH含量具有非常重要的實(shí)際意義。利用上述傳感檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)際樣品中的谷胱甘肽進(jìn)行了檢測(cè)，如表1所示。

表1 MBISA@CuNCs應(yīng)用于測(cè)定實(shí)際樣品中GSH的測(cè)定結(jié)果Table 1 Analytical results of GSH in real samples based on MBISA@CuNCs.

結(jié)果表明，用本文建立的方法在實(shí)際水樣自來(lái)水、湖水中并未檢測(cè)到GSH，在2個(gè)人血清樣品中檢測(cè)到 GSH 的含量分別為 4.44 和 4.24 μmol·L-1。同時(shí)對(duì)各實(shí)際樣品采用加標(biāo)回收法測(cè)定，得回收率為96.09%～106.62%，經(jīng)6次測(cè)定計(jì)算的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于3.0%，進(jìn)一步證實(shí)了基于MBISA@CuNCs的熒光增強(qiáng)型傳感檢測(cè)方法具有較好的可靠性，可應(yīng)用于實(shí)際水樣和血樣中GSH的檢測(cè)，且該方法有望應(yīng)用于生物樣品中谷胱甘肽的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本文采用2-巰基-5-苯并咪唑磺酸二水合鈉鹽和硝酸銅為原料，以超聲化學(xué)法制備了水溶性穩(wěn)定性好的銅納米簇，其中MBISA既作保護(hù)劑又作還原劑，最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別是332 nm和642 nm。基于GSH對(duì)MBISA@CuNCs熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)，建立了一種檢測(cè)谷胱甘肽含量的傳感檢測(cè)新方法，并將其應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。谷胱甘肽濃度在 6.59×10-7mol·L-1～ 4.26×10-5mol·L-1的范圍內(nèi)與CuNCs的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，檢出限為4.46×10-7mol·L-1，回收率為 96.09%～106.62%。本文所制備的銅納米簇有反應(yīng)條件溫和、制備工藝簡(jiǎn)單、響應(yīng)特性優(yōu)良、抗干擾能力強(qiáng)、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)GSH含量方面具有較好的應(yīng)用前景。