桑果原汁和桑果酒功效成分和抗氧化活性測定

楊金宏，陳正余，孟 剛，孔衛(wèi)青

（安康學院/陜西省蠶桑重點實驗室，陜西 安康 725099）

桑葚是由大量小核果集合而成為的聚花果果實，是國家“既是食品又是藥品（1985）”的農(nóng)產(chǎn)品之一，并被列入《中華人民共和國藥典》，具有很高的食藥用價值。桑葚富含黃酮、綠原酸、原花青、多糖、有機酸等活性物質(zhì)，具有保護神經(jīng)、提高免疫力、減肥、預防癌癥、糖尿病、心血管疾病等功效［1］。同時，成熟桑葚還含豐富的花青素（矢車菊素-3-葡萄糖苷）（C3G）成分，具有抗氧化、抗衰老、增強血管彈性、消炎抗過敏等功效［1-3］。在韓國和日本，桑葚也被用于民間醫(yī)藥藥理作用，包括退燒、治療喉嚨痛、肝腎保護、視力改善以及降血壓等［4，5］。

桑葚可新鮮食用，也可干燥或加工成酒、果汁和果醬，味道鮮美，熱量低、營養(yǎng)高，深受大眾喜愛。隨著近年來人們保健意識的增強，果酒以其低酒度、時尚、個性化等元素，很好地滿足了人們對時尚酒精飲料的認同和追求。利用天然釀酒酵母，將新鮮桑葚榨汁糖發(fā)酵轉(zhuǎn)化為酒精生產(chǎn)的桑果酒，酒質(zhì)醇厚芳香、酒體清亮透明［6］，深受消費者喜愛，但相關制品活性成分的含量及其功效等未見研究報道。本研究對采摘自中度富硒土壤的桑果原汁和桑果酒進行研究，測定了其中的類黃酮、總酚、原花青素、綠原酸、C3G、木犀草苷和硒等的含量，及其總抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 桑葚品種紅果2 號，采摘自安康市石泉縣城關鎮(zhèn)，選取成熟度高、含糖量高、無霉變及病蟲害的新鮮桑葚，利用打漿機制作桑果原汁。桑果酒的制作：桑果原汁加入0.008%（W/V）SO2，0.1%（W/V）的釀酒酵母，22 ℃發(fā)酵7 d，桑果原汁和桑果酒在陜西博硒農(nóng)業(yè)科技有限公司制作完成。

1.1.2 主要儀器設備 Agilent 1100 高效液相色譜儀、Thermo X Series II 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀。Millipore 超純水系統(tǒng)、Multiskan Sky 全波長酶標儀，低溫離心機Microfuge 22R、離心機Z-160M 等。

1.1.3 主要試劑 沒食子酸、蘆丁、兒茶素、綠原酸、木犀草苷標準品購于上海源葉生物科技有限公司；矢車菊素-3-葡萄糖苷標準品來自中國計量所；硒標準儲備液（1 000 μg/mL）購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；乙腈、硝酸為優(yōu)級純；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、稀鹽酸、磷酸二氫鉀等為分析純，購自天津化學試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 總酚含量測定 分別取桑果原汁和桑果酒0.5 mL，針頭式過濾器（0.22 μm）過濾，福林酚試劑法［7］測定其總酚含量，以沒食子酸為標準品，測定760 nm 吸光度并制作標準曲線，計算桑果原汁和桑果酒總酚含量。

1.2.2 原花青素含量測定 原花青素含量測定采用香草醛法［8］，以兒茶素為標準品，測定 500 nm 吸光度并制作標準曲線，計算樣品原花青素含量。

1.2.3 類黃酮含量測定 類黃酮含量的測定采用亞硝酸鹽比色法［9］，以蘆丁為標準品，測定 510 nm 吸光度并制作標準曲線，計算樣品類黃酮含量。

1.2.4 綠原酸含量測定 綠原酸含量使用HPLC 方法［10］，流動相 A 為甲醇，B 為 1% 乙酸水，檢測波長280 nm。配制0.5、2.0、16.0、80.0、200.0、400.0 μg/mL的綠原酸標準品溶液測定并制作標準曲線，計算樣品綠原酸含量。

1.2.5 C3G含量測定 C3G含量測定方法同“1.2.4”，流動相A 為1.6%甲酸水溶液，B 為1.6%甲酸甲醇溶液，檢測波長530 nm。配制2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL 的C3G 標準品溶液測定并制作標準曲線，計算樣品的C3G 含量。

1.2.6 木犀草苷含量測定 木犀草苷含量測定方法同“1.2.4”，流動相A 為1%乙酸水溶液、流動相B 甲醇，檢測波長350 nm。配制0.1、1.0、10.0、40.0、100.0、200.0 μg/mL 木犀草苷標準品溶液測定并制作標準曲線，計算樣品木犀草苷含量。

1.2.7 硒含量測定 樣品硒含量采用ICP-MS 方法［11］測定，配制 0、5、10、20、30 μg/L 的系列硒標準溶液，制作硒溶液標準曲線，計算樣品硒含量。

1.2.8 對羥基自由基的清除作用 采用鄰二氮菲-Fe2+比色法計算樣品羥自由基清除能力［12］，測定樣本吸光度記為A測，去離子水代替樣品作對照的吸光度記為A對，去離子水代替H2O2測吸光度記為A空，根據(jù)公式D=（A測-A對）/（A空-A對）×100%計算樣品的羥自由基清除率。

1.2.9 抗氧化活性測定 制備FRAP 工作液［13］，分別取桑果原汁和桑果酒6 μL，加入預熱至37 ℃的FRAP 工作液 180 μL、ddH2O 18 μL，反應 20 min 后，酶標儀測定593 nm 吸光度，測定以雙蒸水為空白對照。以0.2~1.6 mmol/L FeSO4溶液做標準曲線，以每克樣本每分鐘產(chǎn)生1 μmol Fe2+-TPTZ 定義為一個酶活力單位，計算樣品的總抗氧化活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有樣品均平行測定3 次，結(jié)果以x±s表示，顯著性和極顯著值分別為P<0.05 和P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑果原汁和桑果酒各成分含量測定結(jié)果

2.1.1 總酚含量測定結(jié)果 用沒食子酸制作標準曲線，獲得回歸方程y=2.808x+0.001 2，R2=0.999 7，相關系數(shù)R2均大于0.99，說明吸光度與濃度之間存在較好的線性關系，試驗的準確性高。進一步測得桑果原汁中總酚含量為（6.085±0.202）mg/mL，桑果酒總酚含量為（1.633±0.088）mg/mL，二者差異極顯著（P=0.001 0）。

2.1.2 原花青素含量測定結(jié)果 獲得標準曲線的回歸方程為y=0.009 7x+0.000 6，R2=0.999 9。測得桑果原汁和桑果酒的原花青素含量分別為（1.838±0.097）、（0.345±0.071）mg/mL，二者差異極顯著（P=0.002 7）。

2.1.3 類黃酮含量測定結(jié)果 獲得標準曲線的回歸方程為y=2.51x+0.000 7，R2=0.999 6。測得桑果原汁和桑果酒的類黃酮含量分別為（7.675±0.142）、（0.570±0.063）mg/mL，二者差異極顯著（P=0.000 2）。

2.1.4 綠原酸含量測定結(jié)果 綠原酸的保留時間是6.157 min，綠原酸標準品制作的標準曲線回歸方程為y=15.371x-15.504，R2=0.999 6，相關系數(shù)R2均大于0.99，說明峰面積與濃度之間存在較好的線性關系。測得桑果原汁和桑果酒的綠原酸含量分別為（11.550±0.508）、（1.453±0.108）μg/mL。

2.1.5 C3G 含量測定結(jié)果 C3G 的保留時間是24.793 2 min（圖 1），測得桑果原汁中 C3G 含量為81.476±2.417 μg/mL，桑果酒中沒有檢測到C3G。

2.1.6 木犀草苷含量測定結(jié)果 木犀草苷的保留時間是5.160 1 min（圖2），測得桑果原汁和桑果酒中木犀草苷的含量分別為（6.750±0.706）、（1.061±0.205）μg/mL。

2.1.7 硒含量測定結(jié)果 硒標準曲線的回歸方程為y=147.26x+41.603，R2=0.999 8，測得桑果原汁中硒含量為（2.221±0.034）μg/L，桑果酒中硒含量為（2.246±0.118）μg/L，二者間差異不顯著（P=0.881 9）。兩個樣品硒含量均未達到國家富硒食品質(zhì)量標準規(guī)定（≥ 10 μg/L）。

2.2 桑果原汁和桑果酒抗氧化活性

2.2.1 羥自由基清除率 羥自由基清除率是樣品抗氧化能力的重要指標之一，測得桑果原汁羥自由基清 除 率 為（6.533±1.260）% ，桑 果 酒 為（11.030±0.321）%，二者差異顯著（P=0.014 4）。

2.2.2 對鐵離子的還原能力 FeSO4標準曲線回歸方程為y=0.422 1x-0.004 8，R2=0.997 9，桑果原汁和桑果酒對鐵離子的還原力分別為（2 363.696±129.319）、（108.614±4.789）U/mL，二者差異極顯著（P=0.001 0）。

3 小結(jié)與討論

桑葚鮮果含有大量的水分（80%~85%），不能保存，進行干制、釀酒或進行活性成分提?。?4］是目前桑葚儲存和利用的主要出路。試驗對桑葚直接榨汁和釀造果酒的功能成分和抗氧化活性進行研究，發(fā)現(xiàn)桑果原汁的總酚、原花青素、類黃酮、綠原酸、木犀草苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷（C3G）等成分的含量均顯著高于桑果酒，二者的硒含量無顯著差異。這可能與桑果原汁直接來自桑葚，未經(jīng)過任何加工，能夠較好保存桑葚有效成分有關。

進一步測定顯示，桑果原汁對鐵離子還原能力顯著優(yōu)于桑果酒，而桑果酒對羥自由基的清除率優(yōu)于桑果原汁。羥自由基具有強氧化能力，可作用于體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等生物分子，使細胞結(jié)構(gòu)、功能受損，體內(nèi)代謝紊亂，引起疾病。桑果酒的羥自由基清除率更高，說明桑果酒也是一種具有很好發(fā)展前景的健康產(chǎn)品。由于試驗所測指標多依據(jù)桑葚成分確定，且僅對成酒前后進行了比較，而桑果酒釀造過程中的真菌發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物、動力學變化及其對桑果酒保健功能的作用有待于進一步的研究。