葫蘆白粉病病原菌觀察及系統(tǒng)進(jìn)化分析

丁 卓,崔浩楠,高 鵬

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030;2.農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與 種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

白粉病是危害葫蘆科蔬菜的世界性真菌病害之一，在葫蘆科作物的生產(chǎn)過程中廣泛發(fā)生，嚴(yán)重影響葫蘆科作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)的引起葫蘆科蔬菜感染白粉病的真菌屬于子囊菌亞門、核菌綱、白粉菌目下白粉菌屬、內(nèi)絲白粉菌屬、單囊殼屬等3個(gè)屬，可細(xì)分為6個(gè)種[1]。在中國(guó)侵染葫蘆科作物使其感染白粉病的主要病原菌是二孢白粉菌(Golovinomycescichoracearum，Gc;也為Erysiphecichoracearum)和單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii，Px)[2]。白粉病的發(fā)病速度和傳播速度極快，其孢子可通過空氣傳播，在高溫高濕條件下更有助于病害的發(fā)生。國(guó)內(nèi)春秋兩季的生產(chǎn)中，溫室大棚以及陸地都有不同程度的發(fā)生，影響葫蘆科作物的生長(zhǎng)，使其生長(zhǎng)緩慢，對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重危害[3]。選擇抗病品種是防治白粉病的有效途徑，抗白粉病育種成為主要的育種目標(biāo)。

葫蘆(Lagenariasiceraria)屬于葫蘆科葫蘆屬，具有食用、藥用價(jià)值，是中國(guó)南方主要的蔬菜。同時(shí)葫蘆作為工藝品有經(jīng)濟(jì)和收藏價(jià)值，此外葫蘆作為西瓜重要的砧木材料，選擇抗白粉病的葫蘆作為嫁接砧木，能夠降低西瓜白粉病危害[4]。引起葫蘆科作物的白粉病菌有很多，不同地區(qū)致病的菌種并不相同。顧海峰等[5]對(duì)上海不同地區(qū)進(jìn)行鑒定，引起致病的主要白粉病菌為單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii),優(yōu)勢(shì)生理小種為1號(hào)生理小種,浦東地區(qū)發(fā)現(xiàn)的生理小種為2F。引起北京地區(qū)的白粉病菌主要是Podosphaeraxanthii，優(yōu)勢(shì)生理小種則為2F[6]。徐志豪等[7]對(duì)侵染甜瓜的白粉病菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，生理小種主要為Podosphaeraxanthii生理小種1。雖然前人有關(guān)于葫蘆科相關(guān)作物白粉病菌研究的報(bào)道，但中國(guó)對(duì)于侵染葫蘆的白粉病菌研究報(bào)道少見，并且系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不明，觀察鑒定葫蘆白粉病的病原菌及其生理小種對(duì)葫蘆白粉病抗性育種具有重大意義。本研究于2018年8月在黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程試驗(yàn)中心種植葫蘆，等待其自然發(fā)病，觀察病原真菌的形態(tài)特征，以及克隆真菌ITS區(qū)序列進(jìn)行Blastn分析，對(duì)侵染葫蘆的白粉病菌進(jìn)行鑒定，確定其病原菌種類；同時(shí)將其ITS區(qū)與不同地區(qū)不同作物采集到的白粉病菌的ITS區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析；以期為葫蘆抗白粉病育種提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 白粉病菌分生孢子采集純化及生理小種的鑒定

2018年6月，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程試驗(yàn)中心種植葫蘆材料以及13份葫蘆科白粉病鑒別寄主，待葫蘆材料自然發(fā)病，從感染白粉病菌的葫蘆葉片上采集白粉病分生孢子。參考郭麗霞等[8]的方法對(duì)采集到的白粉病分生孢子進(jìn)行單孢子分離純化培養(yǎng)，根據(jù)柯赫氏法則，將純化后的白粉病菌回接到葫蘆和13份鑒別寄主上，調(diào)查13份鑒別寄主的抗感情況。

1.2 觀察病原菌形態(tài)特征

對(duì)感染白粉病的葫蘆葉片采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色觀察。將感染白粉病的葫蘆葉片浸泡在脫色液中(0.15%三氯乙醇-三氯甲烷)，60 ℃恒溫水浴直至葉片完全脫色，用清水沖洗后，浸泡于染色液中[0.15%三氯乙酸和 0.6%考馬斯亮藍(lán) R-250(溶于99%甲醇中)混合液]，染色 5 min，取出后用清水沖凈，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子梗的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及分生孢子的形態(tài)，測(cè)定分生孢子和足細(xì)胞的長(zhǎng)寬，與已知的白粉病病原菌形態(tài)進(jìn)行比較鑒定。

1.3 白粉病菌DNA的提取

用軟毛刷采集感病葉片表面由單孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的白粉病菌分生孢子，采用改良的CTAB法[9-10]對(duì)白粉病菌的DNA進(jìn)行提取，并溶解在ddH2O中。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取到的白粉病菌DNA的質(zhì)量與濃度。

1.4 PCR 擴(kuò)增

1.4.1 引物序列 使用真菌核糖體ITS區(qū)段通用的ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)作為擴(kuò)增葫蘆上白粉病菌ITS區(qū)的引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.2 PCR擴(kuò)增體系 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)液總量為20 μL(ExTaq10 μL,上下游引物各1 μL，模板DNA 3 μL,ddH2O 5 μL)。

1.4.3 PCR反應(yīng)程序 94 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃變性45 s,60～45 ℃退火(每個(gè)循環(huán)降 0.5 ℃)45 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)； 94 ℃變性45 s，45 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)。

1.4.4 PCR產(chǎn)物的檢測(cè) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)完畢后,取5 μL PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 克隆和測(cè)序分析

將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物利用膠回收試劑盒(TaKaRa)回收，將目的片段連接T1載體(TransGen Biotech)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)，在選擇培養(yǎng)基上篩選，挑取陽性克隆在LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，通過菌液PCR進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)后的菌落交由上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。并將測(cè)序得到的準(zhǔn)確序列在NCBI網(wǎng)站上的GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn分析,下載對(duì)比結(jié)果同源性高的菌種ITS區(qū)序列(含5.8s),利用ClustalX[11]軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì),用MEGA6.0[12]對(duì)上述序列采用鄰近距離法(Neighbour-hoodJoining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹來進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葫蘆白粉病菌的形態(tài)特征

利用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)白粉病菌進(jìn)行染色，結(jié)果如圖1所示，在顯微鏡下觀察到葫蘆上的白粉病菌的菌絲生長(zhǎng)在大小不同、形狀各異的約8 μm左右寬的附著孢上，有隔膜，呈分枝狀、長(zhǎng)直或彎曲。分生孢子呈橢圓或直筒形，大小為：長(zhǎng)(28～42 μm)×寬(15～22 μm)，長(zhǎng)寬比例平均為 1.5～ 2.0。分生孢子梗簡(jiǎn)單無分枝，長(zhǎng)90～260 μm、寬10～14 μm。足細(xì)胞呈圓形，長(zhǎng)38～75 μm，肌底隔輕微收縮并且有1～4個(gè)短細(xì)胞，未見閉囊殼。分生孢子串生，內(nèi)含有纖維體，附著器乳頭狀，芽管通常較短，個(gè)別叉狀，末端加粗。白粉病菌的形態(tài)特征與單囊殼白粉病菌一致[13]，初步判斷為單囊殼白粉菌。

2.2 侵染葫蘆的白粉病菌生理小種的鑒定

對(duì)13份葫蘆科白粉病鑒別寄主[14]‘IranH’ ‘Topmark’ ‘Vedrantais’ ‘PMR45’ ‘PMR5’ ‘WMR29’‘Eidisto47’ ‘PI414723’ ‘MR-1’ ‘PI 124111’ ‘PI 124112’‘PMR6’和‘Nantais Oblong’接種白粉病，其抗感情況如表1所示。結(jié)果表明，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程試驗(yàn)中心的葫蘆科白粉病菌屬于單囊殼白粉菌1號(hào)生理小種。

表1 鑒別寄主抗感反應(yīng)Table 1 Identification of host anti-sense response

2.3 葫蘆白粉病菌ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

采用真菌核糖體ITS區(qū)通用引物ITS1、ITS4對(duì)采集自葫蘆的白粉病菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一段582 bp的5.8srRNA-ITS區(qū)序列，通過連接T1載體進(jìn)行測(cè)序得到該片段的序列(圖2)。這段序列已提交至NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GenBank數(shù)據(jù)庫中登記，登錄號(hào)為MG706136。

2.4 同源性序列的檢測(cè)

將MG706136在NCBI上進(jìn)行Blastn分析，得到同源性較高的ITS序列。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，同源性較高的序列均屬于子囊菌亞門，核菌綱，白粉菌目，白粉菌科，叉絲單囊殼屬，如表2(1～24)所示。

2.5 ITS序列的比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將克隆得到的來自黑龍江省哈爾濱市的葫蘆科白粉病菌的ITS序列(MG706136)與下載到的叉絲單囊殼屬(Podosphaera)菌、高氏白粉菌屬(Golovinomyces)菌以及白粉菌科節(jié)絲殼屬杰絲殼屬(Arthrocladiella)菌的ITS序列(表2)進(jìn)行多序列比對(duì),再用MEGA6.0軟件采用近鄰歸群法(NeighborJoining,N-J)構(gòu)建獲得系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，穆氏節(jié)絲殼菌(Arthrocladiellamougeotii)作為系統(tǒng)進(jìn)化樹的外群。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，同屬于叉絲單囊殼屬的KX369541、MG462908、AB046988、AB046989、AB040302、AB040319、AB040346、AB040345、AB040294、LC270779、AB040337、AB040327、AB040329、AB040295、AB040323、KM260704、KM260719、KR779869、KM260735、FJ625796、JX546297、AB040332、AB040350和AB046987聚為一大類，屬于高氏白粉菌屬的AF229016、AF229017、AB022413、AB077670、AB077635、AB077652、AB077696和AF031282聚為一大類，而作為外群的AF073358單獨(dú)聚為一類。結(jié)果表明本研究在葫蘆上采集到的白粉病菌屬于叉絲單囊殼屬。

3 討 論

目前，對(duì)于葫蘆科白粉病菌的鑒別主要通過鏡檢的方法，通過觀察分生孢子是否具有纖維狀體，從而區(qū)分P.xanthii與G.cichoracearums[15-16]。這種方法操作簡(jiǎn)便，但是要求試驗(yàn)人員具備豐富的觀察經(jīng)驗(yàn)，并且鏡檢方法無法得到更多的病原菌信息。被廣泛采用的形態(tài)學(xué)分類鑒定方法無法支持白粉病菌的系統(tǒng)進(jìn)化研究，不利于追蹤白粉病的變異進(jìn)化過程，因此必須進(jìn)行分子層面的研究，核糖體RNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)存在種內(nèi)的豐富變異,進(jìn)化的速率較快，廣泛用于研究屬內(nèi)種間以及種以下個(gè)體之間的遺傳關(guān)系，所以對(duì)葫蘆科白粉病菌進(jìn)行ITS區(qū)測(cè)序及分析，不僅可以從分子水平進(jìn)行有效鑒定，還可以為追蹤某一地區(qū)白粉病菌變異情況、研究白粉病菌之間的進(jìn)化關(guān)系提供借鑒。

現(xiàn)在利用分子的手段對(duì)真菌種屬鑒定以及系統(tǒng)進(jìn)化分析比傳統(tǒng)的方法更簡(jiǎn)便更準(zhǔn)確[17]。真菌菌種種類多，傳統(tǒng)方法對(duì)于某些形態(tài)特別相似的菌種鑒定過于困難，基于rDNA-ITS的序列分析能夠從核酸序列中獲得信息來反應(yīng)親緣關(guān)系，提高真菌鑒定的準(zhǔn)確性。ITS區(qū)是rRNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，存在豐富的變異以及高多態(tài)性，不同的菌種之間，即使是非常近的兩個(gè)種，ITS序列都能表現(xiàn)出差異,但個(gè)體間的變異少見[18]。ITS區(qū)包含ITS1和ITS2兩個(gè)不同的非編碼區(qū),位于18S～5.8S rDNA和5.8S～28S rDNA，具有高度保守性，ITS區(qū)的基因片段并不長(zhǎng)，約 1 000 bp，容易對(duì)其進(jìn)行克隆和序列分析[19]。

本文利用真菌形態(tài)特征以及ITS序列分析兩種方法對(duì)葫蘆上收集到的白粉病進(jìn)行鑒定。通過鏡檢觀察到的白粉病菌形態(tài)特征與感染葫蘆科作物的單囊殼白粉菌基本一致。同時(shí)將該白粉病菌測(cè)序得到ITS區(qū)序列結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blastn分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)得到的序列與西瓜和苦瓜上分離得到的單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii)ITS區(qū)序列同源性為100%，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，本研究分離到的病原菌與叉絲單囊殼屬的真菌聚為一群，因此進(jìn)一步確定采自哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的葫蘆白粉病菌為單囊殼白粉菌。

研究表明，白粉病菌基因組內(nèi)存在著大量的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，從而使得白粉病菌的基因組十分活潑，變異速度很快[10-23]。目前，大部分研究人員認(rèn)為P.xanthii具有11個(gè)生理小種侵染葫蘆科作物，而McCreight[14]在綜合其他研究結(jié)果[24-34]基礎(chǔ)上，認(rèn)為P.xanthii已分化出28種生理小種侵染葫蘆科作物。當(dāng)前，關(guān)于甜瓜白粉病鑒別寄主的研究較少，雖然有研究者提出一種新的甜瓜白粉病鑒別方法[35]，但是在甜瓜白粉病的研究中未見使用，利用13份鑒別寄主依舊是鑒別甜瓜白粉病生理小種的公認(rèn)方法。同一植株對(duì)不同生理小種的真菌表現(xiàn)出不同的抗性，因此鑒定侵染葫蘆植株的生理小種，對(duì)葫蘆抗病育種具有重要 意義。