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      宮頸液內(nèi)炎癥因子及菌群水平與產(chǎn)婦早產(chǎn)相關(guān)性研究

      2021-05-19 03:52:24盧濤牛玉玲
      實驗與檢驗醫(yī)學(xué) 2021年2期
      關(guān)鍵詞:洗液早產(chǎn)菌群

      盧濤,牛玉玲

      (開封市婦幼保健院婦科,河南 開封 475000)

      早產(chǎn)是一種全球性流行病。近年來發(fā)現(xiàn),早產(chǎn)可導(dǎo)致每年超過一百萬嬰兒的死亡[1],也是五歲以下兒童死亡的主要原因[2]。早產(chǎn)有多種病因,但在多達50%的早產(chǎn)病例中,感染被認(rèn)為是一種潛在的致病機制[3]。其中,生殖道感染引起的炎癥可能是導(dǎo)致早產(chǎn)的重要原因[2]。孕期陰道菌群紊亂與早產(chǎn)也有一定的相關(guān)性[3,4]。宮頸液內(nèi)炎癥因子及菌群水平與婦女早產(chǎn)是否有一定的關(guān)系,目前研究尚不充足。本研究主要探究宮頸液內(nèi)炎癥因子及菌群水平與婦女早產(chǎn)的相關(guān)性,為預(yù)防孕婦早產(chǎn)提供理論依據(jù)。

      1 研究對象與方法

      1.1 研究對象 選取 2017 年 10 月-2019 年 10 月我院收治的年齡20~40 歲早產(chǎn)孕婦(孕周<37 周+0天)和足月孕婦各50 例。孕婦需滿足:⑴單胎妊娠,自然受孕;⑵采集樣本前3 天內(nèi)無性生活;⑶無其他合并癥,如心臟病,糖尿病,前置胎盤等;⑷無子宮或胎兒異常;⑸無活動性陰道感染;⑹過去2 周內(nèi)未使用抗生素治療或抗炎治療;⑺取得孕婦及其家屬知情同意。

      1.3 樣本采集 孕婦分娩42d 后,通過無菌窺陰器暴露宮頸,用無菌宮頸拭子采集宮頸分泌物。收集宮頸拭子,用10 ml 無菌鹽水注入宮頸后穹窿進行灌洗,收集灌洗液進行宮頸炎性標(biāo)記物分析。宮頸拭子儲存于-80℃,用于后續(xù)微生物檢測。宮頸灌洗液離心取上清液保存在-80℃,用于炎癥因子的檢測。

      1.4 宮頸液微生物組分析 宮頸微生物組分析由南京金唯智生物科技公司完成。使用蛋白珠法從宮頸拭子中提取總基因組DNA,以 20-30ng DNA為模板,使用金唯智設(shè)計的一系列 PCR 引物擴增原核生物 16S rDNA 上包括 V3 及 V4 的 2 個高度可變區(qū)。另外,通過 PCR 向16S rDNA 的 PCR產(chǎn)物末端加上帶有 Index 的接頭,以便進行NGS測 序 。通 過 Qubit3.0 Fluorometer (Invitrogen,Carlsbad, CA)檢測文庫濃度。雙端測序得到的正反向reads 首先進行兩兩組裝連接,過濾拼接結(jié)果中含有N 的序列,保留序列長度大于200bp 的序列。經(jīng)過質(zhì)量過濾,去除嵌合體序列,最終得到的序列用于 OTU 分析,使用 VSEARCH(1.9.6)進行序列聚類(序列相似性設(shè)為 97%),比對的16S rRNA 參考數(shù)據(jù)庫是 Silva 132。然后用 RDP classifier (Ribosomal Database Program) 貝葉斯算法對 OTU 的代表性序列進行物種分類學(xué)分析,并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成。

      1.5 宮頸灌洗液炎癥因子分析 采用Luminex 多重分析檢測宮頸灌洗中炎癥因子的濃度。使用10 種分析物多重測定板 (Milliplex MAP 人細(xì)胞因子/趨化因子磁珠多重測定板,HCYTOMAG-60K-10,上海益啟生物科技有限公司),按照制造商建議的方案一式兩份地測定灌洗液中的細(xì)胞因子和趨化因子濃度,并使用Bio-Plex 讀取數(shù)據(jù)。使用Bio-Plex Manager 軟件(Bio-Rad)分析數(shù)據(jù)。

      1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 對采集的數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 進行數(shù)據(jù)分析,連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ±SD)表示,分類變量采用中位數(shù)和四分位數(shù)表示。兩組之間比較采用t 檢驗,宮頸液內(nèi)炎癥因子及菌群水平與婦女早產(chǎn)之間的關(guān)系采用Spearman 秩相關(guān)檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 早產(chǎn)組和足月組孕婦一般情況的比較 早產(chǎn)組和足月組孕婦年齡,體重指數(shù)(BMI),早產(chǎn)史,懷孕次數(shù),產(chǎn)檢次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

      表1 早產(chǎn)組和足月組孕婦的一般情況

      2.2 早產(chǎn)組和足月組孕婦宮頸液中菌群相對表達量的比較 研究表明,Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)是評價菌群多樣性的指標(biāo)[5],Chao1 指數(shù)是一種未加權(quán)測量微生物多樣性的方法,反應(yīng)不同微生物數(shù)量。Shannon 指數(shù)是一種加權(quán)測量微生物多樣性的方法,反應(yīng)微生物的數(shù)量和比例。與足月組相比,早產(chǎn)組Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明早產(chǎn)與宮頸中菌群紊亂具有明顯的相關(guān)性。見表2。

      表2 早產(chǎn)組和足月組孕婦宮頸液中菌群多樣性的比較

      2.3 早產(chǎn)組和足月組孕婦宮頸-陰道灌洗液中炎癥因子水平的比較 早產(chǎn)組宮頸灌洗液中IL1-β、IL-6、 和 IL-8 較足月組孕婦明顯升高 (P<0.001),而TNF-α 和 MCP-1 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明早產(chǎn)與宮頸液中炎癥因子的增加具有相關(guān)性。見表3。

      表3 早產(chǎn)組和足月組孕婦宮頸- 陰道灌洗液中炎癥因子水平

      2.4 早孕組宮頸液炎癥因子與宮頸-陰道液中菌群多樣性的比較關(guān)系 早產(chǎn)組炎癥因子IL1-β 與Chao1 指數(shù)的相關(guān)系數(shù) r=0.718,P<0.001,IL-8 與Chao1 指 數(shù) 的 相 關(guān) 系 數(shù) r=0.7180.474,P=0.019,IL1-β 與 Shannon 指數(shù)的相關(guān)系 數(shù) r=0.623,P=0.032,IL-8 與 Shannon 指數(shù) r=0.554,P=0.045,具有正相關(guān)性,表明宮頸灌洗液炎癥因子IL1-β 和IL-8 與宮頸液中菌群紊亂有關(guān)。而 IL-6、TNF-α和 MCP-1 與 Chao1 指數(shù)和 Shannon 指數(shù)無相關(guān)性(P>0.05)。見表4,表5。

      表4 早產(chǎn)組孕婦Chao1 指數(shù)和炎癥因子的關(guān)系

      表5 早產(chǎn)組孕婦Shannon指數(shù)和炎癥因子的關(guān)系

      3 討論

      孕婦早產(chǎn)是導(dǎo)致圍產(chǎn)期新生兒死亡和疾病的重要原因。正常女性懷孕期間,子宮頸是機體抵抗細(xì)菌和病原菌的功能屏障和物理屏障,可保護子宮和胎兒免受來自于陰道上行性感染[6]。宮頸液成分的改變可能對早產(chǎn)、HPV 感染以及宮頸癌變等疾病有一定的預(yù)測作用[7,8]。健康女性生殖道的菌群相對簡單,主要是乳酸桿菌屬,乳酸桿菌比例下降可導(dǎo)致生殖道微生態(tài)失衡。研究發(fā)現(xiàn),陰道厭氧菌的增多與不良妊娠反應(yīng)有關(guān)[9]。細(xì)菌性陰道炎、真菌性陰道炎和宮頸上皮內(nèi)瘤變的女性,陰道菌群改變[4,10,11],且早產(chǎn)和晚期流產(chǎn)的風(fēng)險也是正常女性的2倍和6 倍[4]。本研究發(fā)現(xiàn),與足月產(chǎn)孕婦相比,早產(chǎn)孕婦宮頸液中菌群的多樣性明顯改變,表明宮頸液中微生物的多樣性與早產(chǎn)具有明顯的相關(guān)性。

      研究表明,宮頸液中菌群的改變可增加宮頸IL-4、IL-6 和 TGF-β1 等炎癥因子的表達[12,13]。而宮頸炎癥的增加與不良妊娠的發(fā)生有關(guān)[14,15]。宮頸液中IL-6 的增加與胎膜早破有關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)與足月組孕婦相比,早產(chǎn)組孕婦宮頸液中IL1-β、IL-6、和IL-8 的表達明顯升高,表明宮頸液中炎癥因子 IL1-β、IL-6、 和 IL-8 與早產(chǎn)具有明顯的相關(guān)性,進一步比較宮頸液中炎癥因子和菌群多樣性發(fā)現(xiàn)IL1-β 和IL-8 表達與宮頸液菌群Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)具有一定的相關(guān)性。

      綜上所述,宮頸液內(nèi)炎癥因子及菌群水平與孕婦早產(chǎn)存在相關(guān)性,通過干預(yù)宮頸液炎癥因子或者菌群可能為防止孕婦早產(chǎn)提供一定的手段。

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