高通量測序技術(shù)在循環(huán)腫瘤DNA檢測中的應(yīng)用

李斯特，徐文博

（思路迪醫(yī)學檢驗所有限公司）

腫瘤已成為人生命健康的重要威脅因素，我國每年新發(fā)癌癥病例約392.9 萬例，癌癥死亡約233.8 萬例，發(fā)病率接近世界平均水平，死亡率更是高于世界平均水平[1]。腫瘤發(fā)生是一個漸進的過程，基因突變通常發(fā)生在腫瘤發(fā)生過程中，可用于腫瘤診療?，F(xiàn)有腫瘤基因診斷方法主要基于組織活檢以及液體活檢，組織活檢通常存在組織異質(zhì)性、腫瘤內(nèi)異質(zhì)性、轉(zhuǎn)移間異質(zhì)性和時間異質(zhì)性，存在一定的局限性，可能導致錯失針對性治療機會或治療干預不當。對比傳統(tǒng)組織活檢，液體活檢具有非侵入性、患者依從性高、取樣量少、取樣風險低、特異性高、可重復多次取樣等優(yōu)點，并且可解決腫瘤異質(zhì)性的問題，在腫瘤的早期輔助診斷、伴隨診斷、治療監(jiān)測、預后評估等方面的應(yīng)用價值極高，液體活檢可能是未來幾年腫瘤最具影響力的領(lǐng)域之一[2,3]。

液體活檢檢測的樣本主要包括循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)和外泌體等，其中 ctDNA是目前臨床實驗室應(yīng)用最多的液體活檢靶標。盡管近年來ctDNA 的研究取得了大量的成果，但ctDNA 作為生物標志物在臨床應(yīng)用中仍存在許多技術(shù)問題。這主要是因為與正常體細胞DNA 相比，ctDNA 具有以下獨特的特征:(1)它處于動態(tài)、實時變化的狀態(tài)，ctDNA 含量隨腫瘤分期的變化而動態(tài)變化;(2)半衰期短，通常為2h[4];(3)DNA 片段破碎程度高，在酶切的作用下，長度主要在166 bp 左右[5]；(4)與大量野生型DNA 共存，血液中突變型ctDNA 的拷貝數(shù)僅為野生型的1%或更少，野生型DNA 中僅一個堿基差異即可嚴重干擾突變型ctDNA 的檢測[6];(5)濃度低,每毫升血漿樣本中只有幾十個ctDNA 拷貝。這些特征使得ctDNA 的檢測比體細胞更難。因此，檢測ctDNA 的技術(shù)平臺需要具有高度的特異性和靈敏度。

1 NGS技術(shù)是檢測ctDNA的核心技術(shù)

ctDNA 是一類來源于腫瘤細胞的循環(huán)游離DNA (cfDNA),由腫瘤細胞凋亡、壞死或分泌產(chǎn)生的DNA 片段[7,8]。一般來說,ctDNA 包含與產(chǎn)生 ctDNA的腫瘤DNA 相同的基因缺陷,如突變、缺失、插入、重排、 拷貝數(shù)異常以及甲基化等相關(guān)突變信息。ctDNA 在腫瘤細胞凋亡或壞死后進入循環(huán)系統(tǒng)時，保留了相對完整的遺傳信息。腫瘤細胞中的大部分DNA 突變都可以在ctDNA 中得到反映，通過檢測ctDNA，可以獲得大量的腫瘤信息。檢測結(jié)果可用于判斷腫瘤突變類型、腫瘤分期、復發(fā)轉(zhuǎn)移的可能性。

目前,實驗室常用的ctDNA 檢測方法目前主要分為靶向檢測和非靶向檢測，靶向檢測的目的是識別一個或幾個常見靶向治療相關(guān)基因的已知突變，檢測技術(shù)為基于聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)，包括熒光定量PCR、數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)和核酸質(zhì)譜檢測等； 非靶向檢測的目的則是同時識別多基因,包括腫瘤治療相關(guān)的已知突變及未知突變，檢測技術(shù)以高通量測序(next generation se-quencing，NGS)為主，隨著 NGS 技術(shù)的高速發(fā)展，其通量高、敏感度高及對DNA 樣本濃度要求低等優(yōu)點，已成為液體活檢實驗室檢測的核心技術(shù)。

2 NGS技術(shù)檢測ctDNA技術(shù)的選擇

NGS 技術(shù)能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進行序列測定，具有高通量和高自動化程度，可以在短時間內(nèi)完成數(shù)千億堿基的測序，對比一代測序（Sanger 測序），NGS 對 DNA 模板的濃度和純度要求更低，通過對同一區(qū)域的DNA 片段進行重復測序，可實現(xiàn)高深度測序，因而獲得了更高的靈敏度、特異性和準確性，也正是由于NGS 技術(shù)的技術(shù)優(yōu)勢，使得NGS 技術(shù)非常適合樣本濃度低、高度片段化的ctDNA 檢測。盡管NGS 具有較高的靈敏度和特異性，但根據(jù)應(yīng)用平臺的不同，其隨機錯誤率在0.1%至1%之間[9]，這使得通過總cf DNA 中的罕見突變檢測ctDNA 具有挑戰(zhàn)性。因此NGS 在ctDNA 的檢測中衍生了多個應(yīng)用技術(shù)，包括全基因組測序(whole-genome sequencing, WGS)、全外顯子組測序（whole-exome sequencing, WES）、深 度 測 序 、TAm-Seq （tagged-amplicon deep sequencing，標記擴增深度測序）、 Safe-SeqS（safe-sequencing system，安全測序系統(tǒng))和CAPP-Seq(Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing，深度測序腫瘤個體化建檔法)等。

2.1 全基因組測序 （WGS） 全基因組測序是對生物全基因組序列進行測序，以獲得完整的基因組信息,可檢測的突變類型包括點突變、Indel、重排和CNV。ctDNA 在轉(zhuǎn)移性癌癥中具有很高的敏感性和特異性[10]。但是，ctDNA 測定都依賴于復發(fā)基因中的特定突變或需要對腫瘤組織進行測序,這無疑給轉(zhuǎn)移性癌癥的預后檢測帶來了阻礙。Aguilar-Mahecha A 等[11]通過低深度全基因組測序技術(shù)(lowpass whole genome sequencing, low-pass WGS)對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的ctDNA 進行檢測，將患者DNA的拷貝數(shù)變化用于計算基因組不穩(wěn)定性數(shù)(GIN)，該研究結(jié)果表明，基線、早期、治療時的GIN 值和動態(tài)變化可以預測治療的反應(yīng)，以及總生存期。通過該方法既可以預測3 個月的早期腫瘤反應(yīng)，也可以預測預后,為轉(zhuǎn)移性乳腺癌早期預測及預后提供了更可行的方法。

2.2 全外顯子組測序 （WES） 全外顯子組測序是一種廣泛使用的NGS 方法, 人類外顯子組所占基因組的比例不超過2%，但它包含了約85%已知與疾病相關(guān)的變異[12]，WES 和WGS 之間最大的區(qū)別是生成的數(shù)據(jù)的數(shù)量和內(nèi)容。一般來說，如果目標是尋找目標突變，WES 更適合,并且成本會更低,這使得該方法成為全基因組測序的一種經(jīng)濟高效的替代方法。在非小細胞肺癌的治療中,盡管免疫檢查點抑制劑(ICIs)延長了部分晚期非小細胞肺癌(N SCLC)患者的腫瘤反應(yīng),但大多數(shù)患者會出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥,了解ICIs 的晚期進展機制對改進未來的預后治療策略很重要。Etienne Giroux Leprieur 等[13]對8 例非小細胞肺癌患者ctDNA 進行了全外顯子組測序(whole- exome sequencing, WES)，并比較了使用ICIs 治療的晚期NSCLC 患者在至少治療6個月后,初始和延長腫瘤應(yīng)答并出現(xiàn)繼發(fā)進展的患者在ICI 治療開始和腫瘤進展之間的分子譜，首次發(fā)現(xiàn)了Wnt 通路在晚期NSCLC 繼發(fā)性耐藥中的作用, 對非小細胞肺癌的晚期治療提供了新的思路。

全基因組測序(WGS)或全外顯子組測序(WES)的優(yōu)勢包括:(1)能夠識別腫瘤治療過程中發(fā)生的新變化，發(fā)現(xiàn)新的未知突變；(2)不需要關(guān)于原發(fā)腫瘤基因組的信息。在科研級的ctDNA 研究中有廣泛的使用，并且已經(jīng)走進了“千元基因組”時代。然而對于臨床級的使用，無論是WGS 還是WES 都需要較高的樣品量，并且需要花費大量的設(shè)備、場地、人員資質(zhì)、數(shù)據(jù)解讀等相關(guān)成本，這阻礙了它們在臨床用于篩查和早期診斷的推廣。

2.3 DNA 甲基化測序 ctDNA 的甲基化水平可用于腫瘤的診斷。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準血漿SEPT9 基因甲基化檢測，可作為結(jié)直腸癌的篩選試驗。CFDA 目前批準了SHOX2、 RASSF1A 基因甲基化檢測，通過肺泡灌洗術(shù)獲取可溶性滲出物, 用于早期肺癌的輔助診斷。但是已批準的ctDNA 突變或甲基化檢測，均基于熒光定量PCR 的方法，該方法的檢測靈敏度有限。近年來結(jié)合數(shù)字PCR、NGS 等方法，液體活檢的檢測靈敏度有大幅提升。其中測序方法的應(yīng)用大大提高了檢測通量并能發(fā)現(xiàn)更多潛在的腫瘤變異。最近，基于cfDNA 全基因組測序發(fā)現(xiàn)，起源于腫瘤的ctDNA 存在片段圖譜的特征性改變，這為未知腫瘤的篩查監(jiān)測提供了一種新的分析方法。腫瘤發(fā)生早期，DNA 已經(jīng)出現(xiàn)了甲基化的趨勢或CpG 局部甲基化的改變，因此可以通過體液活檢檢測ctDNA 的水平和甲基化特征來實現(xiàn)腫瘤的早期診斷以及分期[14]。另外，DNA 甲基化異常則可提示腫瘤的侵襲性和手術(shù)切除后復發(fā)的風險。由于ctDNA 的半衰期較短（約 2h）術(shù)后 ctDNA 在血液中的持久性與較差的預后相關(guān)[15]。ctDNA 的甲基化測序后特征可以預測癌癥患者的術(shù)后復發(fā)及死亡風險，有助于調(diào)整治療方案，評估是否需要術(shù)后化療以及確定化療方案。

2.4 靶向測序 (targeted sequencing, TS) 為了利用NGS 更快速地檢測目的基因突變,并在保證檢測準確性和測序深度的基礎(chǔ)上降低成本，靶向測序(targeted sequencing, TS) 正受到越來越多的關(guān)注。與WGS 和WES 相比，TS 可以獲得更大的覆蓋范圍和更高的數(shù)據(jù)精度，提高目標區(qū)域的檢測效率。同時縮短了檢測周期，降低了測序成本，適合分析大量樣本。目前，通過TAm-Seq、CAPP-Seq 等方法進行癌癥個性化分析, 是ctDNA 靶向深度測序的主要技術(shù)。TAm-Seq 的檢出限為0.02%，對循環(huán)DNA中EGFR 點突變的特異性為99.9997%[16],保證了高特異性及高靈敏度;CAPP-Seq 在NSCLC 患者中檢測EGFR 突變也是高度敏感, 特異度＞99.99%[17,18],兩種方法是研究ctDNA 非常實用的測試方法，但是TAm-Seq 以及CAPP-Seq 均只能檢測已知突變，對于研究未知突變有一定的局限性。若通過對高覆蓋的靶區(qū)(＞10,000×)進行測序，其靈敏度可達到0.02%，特異性可達到80%[19]，有研究通過獨特分子標記(UMT)和下一代超深度測序檢測在早期或晚期乳腺癌患者中的ctDNA[20]，由于ctDNA 的含量非常低，因此以排除克隆造血(CH)來源的變異，該研究對于突變的患者，采用相應(yīng)的白細胞(WBC)的DNA 進行對照測序，排除CH 突變后，局部或局部晚期乳腺癌(I-III 期)的ctDNA 檢出率為37%，轉(zhuǎn)移性或復發(fā)性乳腺癌的ctDNA 檢出率為81%，為乳腺癌的靶向治療提供了新的檢測方法，通過血漿ctDNA 和WBC 進行配對測序可以提高液體活檢的準確性。

3 NGS技術(shù)檢測ctDNA臨床應(yīng)用

ctDNA 相關(guān)標志物在臨床應(yīng)用的研究領(lǐng)域包括伴隨診斷指導用藥、治療監(jiān)測、早期輔助診斷等多個方面。目前國內(nèi)批準的ctDNA 基因突變檢測試劑的方法為ARMS-PCR 的方法，而基于NGS 技術(shù)檢測ctDNA 的試劑僅在美國FDA 有獲批，但是基于NGS 技術(shù)ctDNA 基因突變檢測的腫瘤早期輔助診斷，術(shù)后腫瘤復發(fā)監(jiān)測、腫瘤治療后效果評估、微小殘留病灶診斷（MRD）等前沿性臨床應(yīng)用的開發(fā)及研究成果層出不窮，為未來的臨床推廣帶來希望。

3.1 腫瘤早期篩查 腫瘤早期篩查 （簡稱癌癥早篩）是指借助于快速、簡便、有效的方法，從大量無癥狀的“健康”人群中篩選出腫瘤高危群體或者腫瘤陽性患者的過程。由于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)可以進行提前干預，明顯降低死亡率、延長生存期,因此腫瘤早篩具有非常重要的意義。近年來ctDNA 研究重心逐步前移到腫瘤超早期篩查上,有研究標明[21],接受手術(shù)和輔助治療的乳腺癌患者，對16 個與原發(fā)腫瘤相關(guān)的突變,在這些動態(tài)采集的血漿ctDNA樣本中進行超深NGS 測序。發(fā)現(xiàn)18 例復發(fā)患者中，高達16 例ctDNA 檢測結(jié)果早于常規(guī)影像學發(fā)現(xiàn)，31 例未復發(fā)患者任一時間點血漿樣均為ctDNA 陰性，特異性為100%。美國GRAIL 公司計劃2021 年推出的液體活檢產(chǎn)品Galleri 是一項基于cfDNA 靶向甲基化的血液檢測分析方法,該檢測可區(qū)分多階段的50 多種癌癥類型，包括缺乏篩查指南的高死亡率癌癥和早期癌癥, 可作為一種LDT檢測用于50 歲以上的無癥狀人群的癌癥篩查。

3.2 腫瘤微小病灶殘留檢測 微小殘留病灶（Minimal Residual Disease，MRD）,是癌癥治療后殘留在體內(nèi)的少量對治療無反應(yīng)或耐藥的癌細胞,傳統(tǒng)影像學或?qū)嶒炇曳椒ú荒馨l(fā)現(xiàn),但可通過液體活檢發(fā)現(xiàn)癌來源分子存在異常,代表腫瘤的持續(xù)存在和臨床進展可能。根據(jù)我國《肺癌MRD 的檢測和臨床應(yīng)用共識》，肺癌分子異常指的是外周血可穩(wěn)定檢出豐度≥0.02%的ctDNA，包括肺癌驅(qū)動基因或其他的I/II 類基因變異。MRD 檢測技術(shù)包括RTPCR、流式細胞術(shù)、數(shù)字微滴PCR 和NGS，目前處于探索階段，需要前瞻性研究確定其敏感性、特異性和預測價值。對于早期或晚期腫瘤患者進行MRD 檢測，可有助于判斷手術(shù)或治療后預后，和制定進一步的治療策略。目前一些研究進展表明MRD 可用于白血病、肺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌的預后和治療方案評估[22-28]。

目前國外一些商業(yè)化MRD 檢測開始應(yīng)用到臨床。Natera 公司的Signatera 檢測產(chǎn)品獲得美國FDA“突破性設(shè)備”認定，能夠個體化設(shè)計16 種獨特的克隆性體細胞變體,隨后進行多重PCR(mPCR)和超深度測序（靶標平均＞100,000 個reads），用于全血樣品縱向ctDNA 分析并檢測微小殘留病變（MRD）。2021 年美國紐約州衛(wèi)生部臨床實驗室評估項目 （CLEP） 批準了 Guardant Health 公司的Guardant Reveal 液體活檢產(chǎn)品用于檢測和監(jiān)測早期癌癥患者（結(jié)直腸癌，CRC II 和III 期）的MRD,意味著紐約州的腫瘤科醫(yī)生可以使用Guardant Reveal 的MRD 檢測來識別可能受益于輔助治療的結(jié)直腸癌高風險患者和監(jiān)測癌癥復發(fā)。

3.3 腫瘤伴隨診斷指導用藥 美國FDA 于2020 年8 月 7 日已批準 Guardant Health 基于 NGS 的液體活檢測定法，Guardant360 CDx，用于患有任何實體惡性腫瘤的晚期癌癥患者的腫瘤突變圖譜分析，同時還被批準為一種輔助診斷方法，用于識別表皮生長因子受體（EGFR）基因突變的轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌（NSCLC）患者，這些患者可能會受益于奧西替尼的治療。這是FDA 批準的首個將NGS 和液體活檢技術(shù)結(jié)合，指導臨床治療決策的診斷檢測。2020 年美國FDA 批準了基于NGS 的液體活檢伴隨診斷大 panel 檢測產(chǎn)品 FoundationOne Liquid CDx 上市，該產(chǎn)品可檢測324 個基因的變異信息及免疫治療相關(guān)的生物標志物血液微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（bMSI）和血液腫瘤突變負荷（bTMB），適用于泛實體瘤，并作為多個靶向藥物的伴隨診斷。

4 展望

隨著檢測技術(shù)的更新迭代,液體活檢技術(shù)也在飛速發(fā)展中, 雖然ctDNA 是目前液體活檢技術(shù)中使用最多的標志物,但是我們也看到在實際檢測中依然存在著一些挑戰(zhàn), 技術(shù)上對檢測靈敏度要求高、對測序深度要求高，臨床應(yīng)用上還缺乏大量的臨床有效性證據(jù)。高通量測序具有的高靈敏度和高通量，已成為ctDNA 檢測的主流技術(shù)平臺，雖然在前沿性的科研中，NGS 技術(shù)能夠大放異彩，但在臨床應(yīng)用中卻還在初級階段,一方面是由于臨床級測序價格高,需要開展單位擁有從平臺建設(shè)到人員資質(zhì)全力投入, 另一方面由于NGS 技術(shù)發(fā)展速度快,開發(fā)符合政府監(jiān)管的產(chǎn)品周期非常長，往往拿到注冊證時，檢測的產(chǎn)品也有些過時了。因此NGS技術(shù)在ctDNA 檢測的發(fā)展應(yīng)用中，是機會與挑戰(zhàn)并存的，需要不斷完善技術(shù)，加快臨床轉(zhuǎn)化，才能造?；颊?。