內(nèi)皮微顆粒對(duì)新生兒ABO溶血病預(yù)后價(jià)值的研究

楊旭，楊訊，許詞，胡松，余東，韓海心

（南陽(yáng)市中心醫(yī)院輸血科，河南 南陽(yáng) 473000）

母胎血型不合介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是導(dǎo)致新生兒溶血病 （hemolytic disease of the newborn，HDN）的重要原因[1]。胎兒紅細(xì)胞（red blood cells，RBC）可被來(lái)自父系的抗RBC 同種抗體破壞[2]。我國(guó)新生兒溶血癥病例多數(shù)屬于ABO 溶血（ABO-HDN），但目前尚缺乏有效的方法對(duì)ABO-HDN 進(jìn)行預(yù)測(cè)。近年來(lái)Awad 等人的一項(xiàng)研究顯示,CD144+內(nèi)皮微顆粒（Endothelial microparticles，EMP）是 ABO-HDN內(nèi)皮損傷的標(biāo)志物之一[3]。微粒是一類在某些生理或病理狀況下, 由正常細(xì)胞出芽并脫落的顆粒,外周血中微粒多來(lái)源于血細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞,在細(xì)胞間信號(hào)通路傳遞和促進(jìn)凝血等方面起到重要作用[4,5]。微粒直徑多在 0.2-2.0μm 之間，表面含有多種抗原成分[6,7]。在這些微粒中EMP 被認(rèn)為可作為血管損傷的生物標(biāo)志物之一, 并且具有無(wú)創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn),是目前研究的熱點(diǎn)之一[8]?，F(xiàn)如今已有多種抗原可用于 EMP 的檢測(cè)，如 CD31、CD31、CD34、CD51、CD54、CD62E、CD105、CD106、CD144 和 CD146 等[9]，其中由于CD144（又稱VE-鈣粘蛋白）目前尚未發(fā)現(xiàn)在任何血細(xì)胞中表達(dá)，因此是EMP 檢測(cè)中特異性最高的標(biāo)志物之一[10]。但目前關(guān)于EMP 對(duì)ABO-HDN 的產(chǎn)與ABO 血型不合之間相關(guān)性尚缺乏深入研究，因此本研究旨在探索EMP 對(duì)ABOHDN 的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究回顧性納入了2017 年6月-2019 年 6 月之間就診于我院的 55 例 ABOHDN 新生兒、50 例 Rh-HDN 新生兒和 50 例母嬰血型匹配的健康新生兒作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)為：⑴合并活動(dòng)性感染；⑵未能完成EMP 檢測(cè)。

1.2 標(biāo)本留取預(yù)先處理 所有入組新生兒均留取外周血標(biāo)本并經(jīng)EDTA 抗凝處理，外周血用于常規(guī)血液學(xué)檢查和直接Coombs 試驗(yàn)。對(duì)于流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)標(biāo)本，采用1.8ml 外周血和0.2ml 檸檬酸鈉（3.8%）混合。對(duì)于血清標(biāo)本，將外周血置于體外凝結(jié) 1h，然后采用 80×g 條件下離心 15min，血清用于間接抗球蛋白試驗(yàn)、生化分析和C 反映蛋白（C-reactive protein，CRP）檢測(cè)。

1.3 診斷相關(guān)檢測(cè)和流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè) 血常規(guī)采用Sysmex XT―1800i 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀完成，紅細(xì)胞形態(tài)和白細(xì)胞各種亞型計(jì)數(shù)采用利什曼染色外周血涂片方法，網(wǎng)織紅細(xì)胞采用亮甲酚藍(lán)(brilliantcresylblue,BCB)染色方法完成。新生兒及母親的抗體檢測(cè)采用直接和間接Coombs 試驗(yàn)。其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，如肝腎功能、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和間接膽紅素（indirect bilirubin）等溶血標(biāo)志物、 高敏C 反應(yīng)蛋白采用羅氏Cobas Integra 800 全自動(dòng)生化分析儀完成。血管性血友病因子抗原（vWF-Ag）的定量分析采用Sysmex CA_1500 全自動(dòng)凝血分析儀完成。

EMP 檢測(cè)采用抗CD144 抗體流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)完成[11]，將檸檬酸鈉處理后的外周血按照1:50 于磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行稀釋，將50μL 稀釋血液和5μL 藻紅蛋白標(biāo)記的抗CD144 抗體混合，室溫下暗室孵育20 分鐘后采用EPICS-XL PROFILE II Coulter 流式分析儀（美國(guó)Coulter 公司）完成檢測(cè)。同型對(duì)照IgG 抗體購(gòu)自Coulter 公司。EMP 的流式檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示：說(shuō)明抗CD144 抗體中EMP陽(yáng)性比例超過(guò)90%；側(cè)面印證，EMP 足以用于在抗CD144 抗體分析其與ABO-HDN 的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0 軟件完成。連續(xù)性變量均符合正態(tài)分布，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分類變量采用頻數(shù)表示。連續(xù)性變量組間差異采用單因素方差分析和Tukey’s test 多種比較，分類變量采用Pearson 卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)比較組間差異。采用Spearman 檢驗(yàn)行相關(guān)性分析。本研究以雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ABO-HDN 組直接Coombs 試驗(yàn)和間接Coombs 試驗(yàn)陽(yáng)性病例數(shù)分別為8 例和11例。三組人群白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)方面無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但ABO-HDN 和Rh-HDN 新生兒血紅蛋白顯著低于健康對(duì)照組、 網(wǎng)織紅細(xì)胞顯著高于對(duì)照組，同時(shí)ABO-HDN 和Rh-HDN 新生兒血膽紅素和LDH 水平也顯著高于健康對(duì)照組。ABO-HDN 和Rh-HDN 新生兒治療前EMPs 和血管性血友病因子抗原(vWF Ag)顯著高于健康對(duì)照組，但ABO-HDN 和Rh-HDN 新生兒兩組之間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且ABO-HDN 和Rh-HDN 新生兒治療后EMPs 之間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 治療前EMP 與血紅蛋白相關(guān)性分析 我們進(jìn)一步采用相關(guān)性分析探索治療前EMP 與血紅蛋白相關(guān)性，結(jié)果如圖2 所示，二者之間存在顯著負(fù)性線性相關(guān)性（r=-0.823，P＜0.05）。

圖2 治療前EMP與血紅蛋白相關(guān)性分析

圖1 EMP流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料 本研究共納入55 名ABOHDN 新生兒、50 名 Rh-HDN 新生兒和 50 名健康對(duì)照組新生兒。結(jié)果如表1 所示，三組新生兒在胎齡、 性別和出生體重方面均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ABO-HDN 和Rh-HDN 組在治療方法方法上無(wú)顯

2.3 回歸分析結(jié)果 多因素回歸分析結(jié)果如表2所示，ABO-HDN 組的血紅蛋白、LDH 和間接膽紅素水平與治療前EMP 水平獨(dú)立相關(guān)。Rh-HDN 組中只有血紅蛋白和LDH 水平與治療前的EMP 水平獨(dú)立相關(guān)。

3 討論

光滑的血管內(nèi)皮對(duì)于保護(hù)血管結(jié)構(gòu)的重要性不言而喻。當(dāng)其受損時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞便釋放細(xì)胞因子從而改變血管功能，繼而引發(fā)各類心血管事件。因?yàn)樵缙趦?nèi)皮功能異常是可以通過(guò)干預(yù)逆轉(zhuǎn)的,所以找到能特異性反映心血管功能異常的生物性標(biāo)志物是研究各類血管和血液性疾病的重要探討方向，EMP 探索即據(jù)此應(yīng)運(yùn)而生。EMP 是細(xì)胞在損傷時(shí)脫落的球形結(jié)構(gòu)（磷脂囊泡），直徑 0.1～1μm；它的外膜存在各類攜帶親代細(xì)胞特異性表面抗原的表面蛋白,CD144(VE-鈣粘蛋白)就是其中之一[12]。而ABO 血型是人類最重要的血型系統(tǒng)，凝集原A和凝集原B 抗原廣泛存在于人體多種組織器官中，這些抗原在內(nèi)皮細(xì)胞表面呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)[13]。本研究顯示，血管損傷的生物標(biāo)志物之一的EMP 與多個(gè)溶血相關(guān)指標(biāo)獨(dú)立相關(guān),提示內(nèi)皮損傷與溶血性疾病相關(guān)。

表1 三組患者一般信息比較

表2 治療前EMP與臨床參數(shù)多因素回歸分析結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn), 傳統(tǒng)Coombs 試驗(yàn)作為ABO-HDN新生兒的診斷價(jià)值有限，敏感性較低。急需找到更敏感和具有預(yù)后價(jià)值的標(biāo)志物。它與健康對(duì)照組相比，ABO-HDN 組和Rh-HDN 組新生兒的血紅蛋白水平顯著降低，網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高，并且Rh-HDN 組新生兒網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)高于ABOHDN 組新生兒。此外，Rh-HDN 組新生兒 Coombs試驗(yàn)均呈陽(yáng)性，ABO-HDN 組新生兒直接和間接Coombs 試驗(yàn)陽(yáng)性率則顯著低于Rh-HDN 組新生兒。這些結(jié)果表明，ABO-HDN 和 Rh-HDN 新生兒均存在血管內(nèi)溶血,這與既往的研究結(jié)果相符[14,15]。Herschel 等的研究顯示，ABO-HDN 新生兒中Coombs 試驗(yàn)多為陰性，僅3.5%的患者Coombs 試驗(yàn)為陽(yáng)性，且多為呈弱陽(yáng)性[16]。

CD144 作為EMP 中的代表蛋白，已發(fā)現(xiàn)其在糖尿病、冠心病、缺血性卒中和終末期腎病等多種疾病患者中均顯著升高[17]，據(jù)此可預(yù)測(cè)為內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究顯示，ABO-HDN 和 Rh-HDN 組新生兒的EMP 水平顯著高于健康對(duì)照組，ABO-HDN組新生兒的EMP 水平絕對(duì)值高于Rh-HDN 組新生兒，但二者之間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這提示抗A凝集素和抗B 凝集素與內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原的相互作用可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和EMP 水平升高。

既往的研究顯示，ABO 抗原在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)，但Rh 抗原則在內(nèi)皮細(xì)胞表面無(wú)表達(dá)[17]，這提示Rh-HDN 中的抗原抗體反應(yīng)只發(fā)生在紅細(xì)胞表面，由此導(dǎo)致的溶血反應(yīng)可間接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,而ABO-HDN 中抗原抗體反應(yīng)在血管內(nèi)皮細(xì)胞和紅細(xì)胞表面均可發(fā)生,由此可直接導(dǎo)致更為明顯的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，Awad 等人的研究也表明ABO-HDN 新生兒的內(nèi)皮細(xì)胞更為明顯[3]，但目前在中國(guó)人中尚缺乏一定的研究[18]。Ataga 等研究顯示，鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥患者血漿EMP 水平顯著升高，并與多個(gè)溶血標(biāo)志物顯著相關(guān)[19]。此外，陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿患者外周血EMP 水平也顯著升高[20]。本研究顯示，ABO-HDN 新生兒治療前EMP 水平與血紅蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，多因素回歸分析顯示，ABO-HDN 新生兒血漿EMP 與血紅蛋白、LDH 和間接膽紅素獨(dú)立相關(guān)，而Rh-HDN新生兒血漿EMP 與血紅蛋白和LDH 獨(dú)立相關(guān)。

綜上所述, 本研究從與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)預(yù)后預(yù)測(cè)對(duì)比, 以及ABO 抗原位置分布和溶血前后相關(guān)因素三方面分析，顯示EMP 檢測(cè)可能是ABO-HDN 新生兒的一個(gè)可靠的生物標(biāo)志物和檢測(cè)指標(biāo)，為早期監(jiān)測(cè)ABO-HDN 新生兒血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷提供了一個(gè)新的方法。