不同檢驗方案對碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌檢測的臨床應用

凌敏

（周口市中心醫(yī)院檢驗科，河南 周口 466000）

碳青霉烯類抗生素是治療肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia，KP)的最重要手段之一[1]，隨著碳青霉烯類抗生素大規(guī)模生產及不規(guī)范應用，臨床出現了以腸桿菌科細菌為主要代表的對碳青霉烯類不敏感的細菌菌株，包含沙雷菌屬、埃希菌屬、克雷伯菌屬、沙門菌屬等[2]，多重耐藥細菌的出現給臨床治療帶來了極大挑戰(zhàn)。因此盡早準確檢測出碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE） 對臨床阻斷或減緩耐藥菌傳播有重要意義。目前檢測碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌的主要方法有改良Hodge 試驗 (Modified Hodge Test，MHT)、Carba NP direct 試驗(CNPt-d)、Carba?NP 試驗(CNPt)等[3]，但MHT、CNPt-d、CNPt 三種檢測方法的比較國內還鮮有報道。本研究收集我院2018 年5 月-2019 年5 月臨床分離的碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌138 株，以PCR 檢測為金標準，對比研究MHT、CNPt-d、CNPt 在碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌檢測中的應用價值，以期指導臨床合理用藥，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集我院 2018 年5 月-2019 年5月臨床分離的碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌138 株用于本研究。入選標準：⑴采用珠海迪爾生物工程有限公司的DL-96 細菌鑒定儀進行細菌鑒定及藥敏試驗，藥敏結果解釋參照美國臨床和實驗室標準研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的 M100-S25 標準，質控菌株為ATCC 700603 及ATCC 25922；⑵碳青霉烯類不敏感表現為對第三代頭孢噻肟、亞胺培南、多利培南、頭孢曲松、美羅培南具有耐藥性；⑶標本來源于引流液、血液、胸腹水、尿液、痰液等。排除標準：⑴重復菌株；⑵藥敏結果解釋未參照美國CLSI 推薦的M100-S25 標準。

1.2 檢測方法 ⑴PCR：采用DNA 提取試劑盒（美國Mpbio 公司）提取細菌 DNA，使用PCR 儀（美國Bio-Rad 公司） 擴增碳青霉烯酶基因 blaKPC、blaNDM、blaVIM。PCR 反應體系為：模板 2μl、200 μmol/L dNTPs 4μl、10×buffer 5μl、Taq 聚合酶 1.5 U、5μmol/L 上下游引物各 2μl, 用 ddH2O 補足至50μl。PCR 反應條件為：94℃預變性 30s，94℃變性5s，58℃退火 34s，72℃延伸 30s，40 次循環(huán)。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，PCR 陽性產物上Miseq 測序儀（美國Illumina 公司）測序，測序結果用Chromas 直接作 BLAST Search 比對。

⑵MHT： 參照 CLSI 推薦的 M100-S24 進行試驗。將0.5 麥氏單位的大腸埃希菌ATCC25922 稀釋10 倍后按常規(guī)紙片法藥敏試驗涂抹于MHA 平板 （青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司）上，待平板干燥5min，平板中間貼10 μg 厄他培南紙片（法國生物梅里埃公司），接種待檢菌株，以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 為陰性對照，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705 為陽性對照，37 ℃條件下孵育16~20h 觀察結果，若待檢菌株與大腸埃希菌抑菌環(huán)交匯處呈矢狀生長則提示該菌株產碳青霉烯酶。

⑶CNPt： 用 10μl 接種環(huán)從 37 ℃培養(yǎng) 18~22h的血平板培養(yǎng)基上直接刮取約1 個接種環(huán)細菌的量, 分別混懸于兩個加入100μl 細菌蛋白抽提液（北京中科瑞泰生物科技有限公司）的EP 管中，振蕩5s，兩個EP 管分別加入檢測液A（0.05%酚紅溶液）和檢測液 a（含 0.1mmol/L ZnSO4 溶液、6mg/ml亞胺培南的0.05%酚紅溶液），置于37℃孵箱，每0.5h 觀察記錄顏色變化(2h 內觀察為宜)，若顏色由紅色變成黃色為陽性則提示待測菌產碳青霉烯酶。

⑷CNPt-d： 用 10μl 接種環(huán)從 37 ℃培養(yǎng) 24h的血平板培養(yǎng)基上直接刮取約1 個接種環(huán)細菌的量，分別混懸于加入檢測液B（含0.1 mmol/L Zn-SO4 溶液、12mg/ml 亞胺培南、0.1%Triton X-100 溶液的0.05%酚紅溶液） 的EP 管中和加入檢測液b（含0.1%Triton X-100 溶液的 0.05%酚紅溶液）的EP 管中,渦旋震蕩器(上?；偕锟萍加邢薰?上劇烈振蕩 1min，靜置20~30min，置于 37℃孵箱（溫州利邦生物技術有限公司）待用，每0.5h 觀察記錄顏色變化(2h 內觀察為宜)，若顏色由紅色變成黃色為陽性則提示待測菌產碳青霉烯酶。

1.3 統(tǒng)計學處理 本研究在spss23.0 軟件上采用受試者工作特征曲線分析對碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌的篩查價值進行分析。

2 結果

2.1 PCR 檢測結果 138 株碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌共檢測出碳青霉烯酶基因120 株，其中NDM-1 型大腸埃希菌10 株，KPC-2 型腸科桿菌 106 株，VIM-2 型肺炎克雷伯菌 4 株，見圖1。

圖1 PCR檢測結果

2.2 MHT 檢測結果 120 株碳青霉烯酶基因陽性的CRE 中，有110 株MHT 檢測結果為陽性，陽性率為91.67%。其中KPC-2 型肺炎克雷伯菌MHT陽性率為100%，KPC-2 型大腸埃希菌MHT 陽性率為100%，KPC-2 型黏質沙雷菌MHT 陽性率為60.00%，KPC-2 型產氣腸桿菌 MHT 陽性率為66.67%，KPC-2 型弗氏檸檬酸桿菌MHT 陽性率為50.00%，NDM-1 型大腸埃希菌 MHT 陽性率為50.00%，VIM-2 型肺炎克雷伯菌MHT 陽性率為75.00%。MHT 出現陽性結果的反應時間在9~20 min，見表1。

表1 MHT檢測結果（n，±s）

表1 MHT檢測結果（n，±s）

基因型 菌株KPC-2株數 MHT 陽性（株）85 11 85 11 NDM-1 VIM-2肺炎克雷伯菌大腸埃希菌黏質沙雷菌產氣腸桿菌弗氏檸檬酸桿菌大腸埃希菌肺炎克雷伯菌5 3 2 1 0 4 3 2 1 5 3陽性反應時間（min）16.77±3.22 16.11±3.38 16.29±3.37 15.59±3.58 15.47±3.17 11.26±2.25 16.14±3.12

2.3 CNPt 檢測結果 120 株碳青霉烯酶基因陽性的CRE 中，有115 株CNPt 檢測結果為陽性，陽性率為95.83%。其中KPC-2 型肺炎克雷伯菌、KPC-2 型產氣腸桿菌、KPC-2 型弗氏檸檬酸桿菌CNPt陽性率為100%，KPC-2 型大腸埃希菌CNPt 陽性率為95.91%，KPC-2 型黏質沙雷菌CNPt 陽性率為80.00%，NDM-1 型大腸埃希菌CNPt 陽性率為80.00%，VIM-2 型肺炎克雷伯菌CNPt 陽性率為75.00%。CNPt 出現陽性結果的反應時間在5~20 min，見表2。

表2 CNPt檢測結果（n，±s）

表2 CNPt檢測結果（n，±s）

基因型 菌株KPC-2株數 CNPt 陽性（株）85 11 85 10 NDM-1 VIM-2肺炎克雷伯菌大腸埃希菌黏質沙雷菌產氣腸桿菌弗氏檸檬酸桿菌大腸埃希菌肺炎克雷伯菌5 3 2 1 0 4 4 3 2 8 3陽性反應時間（min）16.35±3.50 15.66±3.58 15.87±3.76 15.62±3.98 15.23±3.36 6.38±1.19 15.27±3.38

2.4 CNPt-d 檢測結果 120 株碳青霉烯酶基因陽性的CRE 中，有120 株CNPt-d 檢測結果為陽性，陽性率為100.00%。CNPt-d 出現陽性結果的反應時間在4~20 min，見表3。

2.5 MHT、CNPt-d、CNPt 對碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌的篩查價值 MHT、CNPt-d、CNPt 中，CNPt-d 對碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌的檢測價值最高，見表4~5、圖2。

表3 CNPt-d檢測結果（n，±s）

表3 CNPt-d檢測結果（n，±s）

基因型 菌株KPC-2株數 CNPt-d 陽性(株)85 11 85 11 NDM-1 VIM-2肺炎克雷伯菌大腸埃希菌黏質沙雷菌產氣腸桿菌弗氏檸檬酸桿菌大腸埃希菌肺炎克雷伯菌5 3 2 1 0 4 5 3 2 1 0 4陽性反應時間(min)16.33±3.47 15.57±3.13 15.62±4.05 15.65±3.95 14.76±3.96 5.11±1.02 15.15±3.16

表4 MHT、CNPt-d、CNPt與PCR檢測結果比較

表5 MHT、CNPt-d、CNPt對碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌的篩查價值（%）

圖2 MHT、CNPt-d、CNPt篩查碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌的ROC曲線

3 討論

自19 世紀末20 世紀初青霉素被發(fā)現以來，抗生素逐漸成為人類對抗諸多疾病的 “秘密武器”，全球范圍內被廣泛應用于臨床，人類壽命得以大大提高。但隨著抗生素的不合理使用，細菌對抗生素耐藥性不斷增強，抗生素效力普遍下降，世界衛(wèi)生組織 （World Health Organization，WHO）發(fā)布全球范圍內每年有約70 萬人死于各種耐藥菌感染[4]，23 萬新生兒因耐藥菌感染而夭折[5]，抗生素的耐藥性問題已越來越成為醫(yī)療衛(wèi)生領域的重大挑戰(zhàn)和難題。碳青霉烯類抗生素是抗菌活性最強及抗菌譜最廣的非典型β-內酰胺 （β-lactam，β-LAC）抗生素，已成為治療嚴重細菌感染最主要的抗菌藥物之一[6]。碳青霉烯順式構象與青霉烯顯著不同，噻唑環(huán)上的硫原子為碳所替代，C2、C3之間存在不飽和雙鍵，6 位羥乙基側鏈為反式構象，故表現出對β-內酰胺酶的高度穩(wěn)定性[7,8]。臨床近年來出現了較多對碳青霉烯類不敏感的細菌菌株，以腸桿菌科細菌為主要代表。CRE 耐藥機制主要為產碳青霉烯酶，碳青霉烯酶的產生常造成碳青霉烯類細菌與青霉素結合蛋白 (Penicillin binding protein，PBP)的親和力改變，導致主動外排系統(tǒng)高表達，最終使細菌產生耐藥性[9,10]。碳青霉烯酶依據Ambler 分子分類系統(tǒng)，可分為包括 IMP、VIM、NDM-1 等基因型的金屬酶、包括 KPC、GES、SME、PER 基因型的絲氨酸蛋白酶、由blaOXA 等位基因編碼合成的OXA 酶，三類酶在質粒介導下可引起不同水平的耐藥性，造成疾病流行，嚴重危害現代醫(yī)學進展[11]。本研究采用PCR 檢測，結果顯示138株碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌共檢測出碳青霉烯酶基因120 株，其中NDM-1 型大腸埃希菌10 株，KPC-2 型腸科桿菌 106 株，VIM-2 型肺炎克雷伯菌4 株。

MHT 是由CLSI 推薦的臨床檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶表型的常規(guī)方法，操作簡便，不需要大型儀器，適宜大量篩選產碳青霉烯酶菌株，在一般檢驗科臨床微生物室都可開展[12]。然而MHT 只限于腸桿菌科細菌檢測,對于檢測非發(fā)酵菌靈敏度與特異度不高[13]，而CNPt 除運用于CRE 檢測外還可運用于不動菌屬與銅綠假單胞菌的檢測，CNPt具有高效、快速、準確的優(yōu)點，由Nordmann 教授團隊于2012 年首次提出并投入臨床使用，逐漸成為檢測碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌的主流方法[14]，2015 年 Pasteran 等[15]在 CNPt 基礎上簡化流程得出 CNPt-d，CNPt-d 較 CNPt 操作更加簡便，陽性反應更快。據報道[3]MHT、CNPt-d、CNPt 檢測碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌靈敏度與特異度均超過90%，這與本研究結果相符，本研究結果顯示120 株碳青霉烯酶基因陽性的CRE 中MHT 檢測陽性率為91.67%，CNPt 檢測陽性率為95.83%，CNPt-d 檢測陽性率為100.00%，MHT 出現陽性結果的反應時間在9~20min，CNPt 出現陽性結果的反應時間在5~20min，CNPt-d 出現陽性結果的反應時間在4~20min,說明CNPt-d 縮短了操作時間，陽性結果出現時間較短，靈敏度較高。ROC 曲線顯示 MHT、CNPt-d、CNPt 中，CNPt-d 檢測碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌的準確性最高，提示CNPt-d 可作為碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌的有效篩查方法應用于臨床,指導臨床科學謹慎地使用抗生素藥物,以緩解抗生素耐藥性現狀。

綜上所述，MHT、CNPt-d、CNPt 均能迅速檢測出碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌，但CNPt-d靈敏性更強，準確性更高，且無需昂貴的蛋白抽提液，試劑成本價廉，可作為碳青霉烯類非敏感類腸桿菌科細菌的有效篩查方法，應用于臨床。