薄荷素油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

曾蘭花，劉瀟瀟，陳漫麗，李華，程常勇

(1.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510630；2.中山大學(xué)新華學(xué)院，廣東 廣州 510600)

薄荷素油(薄荷油) 為唇形科植物薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)的新鮮莖和葉經(jīng)水蒸氣蒸餾、冷凍、部分脫腦加工提取的揮發(fā)油，有一種特有的薄荷樣香氣，香氣新鮮、強(qiáng)烈透發(fā)，具有消炎鎮(zhèn)痛[2]、解痙、抗感染[3]、利膽、溶石排石等作用?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2015年版(一部)，其含量測定采用毛細(xì)管氣相色譜法[1]，以萘為內(nèi)標(biāo)，測定薄荷腦的含量，測定成分單一，難以全面評(píng)價(jià)薄荷素油的內(nèi)在質(zhì)量。本研究采用毛細(xì)管氣相色譜程序升溫法，以環(huán)己酮為內(nèi)標(biāo)，將薄荷素油中各主要成分分離，測定各組分含量。同時(shí)建立薄荷素油指紋圖譜，對(duì)指紋圖譜中主要色譜峰進(jìn)行歸屬，以期為進(jìn)一步完善薄荷素油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 日本島津GC-2030氣相色譜儀；日本島津GC-2010AF/FID/ECD氣相色譜儀；Thermo Trace1300 FID+ECD+頂空氣相色譜儀；空氣發(fā)生器AG-1602；氫氣發(fā)生器HG-1803A。色譜柱：HP-INNOWAX(30.0 m×0.25 mm，0.25 μm)；FFAP(30.0 m×0.25 mm，0.25 μm)。

1.2 試劑 環(huán)己酮、無水乙醇、萘、聯(lián)苯、甲醇。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品 薄荷腦(批號(hào)：110728-201707，含量為99.8%)、檸檬烯(批號(hào)：100470-201302，含量為96.0%)、乙酸薄荷酯(批號(hào)：190044-201001，鑒別用)均購于中國食品藥品檢定研究院；(-)-薄荷酮(批號(hào)：M158010-5mL，含量>90.0%)購于阿拉丁試劑公司。內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮(批號(hào)：20190101-1)購于廣州化學(xué)試劑廠。

1.4 供試品 批號(hào)為181216、190118、190219的樣品，由黃山天目薄荷藥業(yè)有限公司提供；批號(hào)為OAY180725、OAY181112、OAY190301、OAY190705、OAY191111的樣品，由安徽豐樂香料有限責(zé)任公司提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 以改性聚乙二醇為固定相的毛細(xì)管柱(柱長為30 m，內(nèi)徑為0.25 mm，膜厚度為0.25 μm)，柱溫為程序升溫：初始溫度60 ℃，保持5 min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至125 ℃，保持1 min；再以每分鐘2 ℃的速率升溫至140 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測器溫度250 ℃；分流進(jìn)樣；分流比10∶1。

2.2 溶液制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取環(huán)己酮8 g，用無水乙醇溶解稀釋至2 000 mL，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取檸檬烯對(duì)照品0.076 74 g、(-)-薄荷酮對(duì)照品0.252 68 g、乙酸薄荷酯對(duì)照品0.075 86 g、薄荷腦對(duì)照品0.405 01 g，至50 mL容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。(每1 mL含檸檬烯1.473 4 mg、(-)-薄荷酮4.548 2 mg、乙酸薄荷酯1.517 2 mg、薄荷腦8.084 mg)。

2.2.3 混合對(duì)照品溶液制備 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液4 mL，置10 mL的容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL含檸檬烯0.589 36 mg、(-)-薄荷酮1.819 30 mg、乙酸薄荷酯0.606 88 mg、薄荷腦3.233 6 mg)。

2.2.4 供試品溶液的制備 稱取本品0.2 g，精密稱定，至25 mL量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，測定，即得。

3 方法與結(jié)果

采用氣相色譜法同時(shí)測定檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦4個(gè)組分的含量[6-8]。具體試驗(yàn)情況如下：

3.1 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已知含量的同一批號(hào)樣品(批號(hào)：190118，含檸檬烯5.8%；(-)-薄荷酮18.0%；乙酸薄荷酯5.8%；薄荷腦31.4%)0.1 g，按照對(duì)照品加入量與所取供試品中相應(yīng)成分含量為1.5∶1、1∶1、0.5∶1左右，分別按供試品溶液制備方法制備高、中、低3個(gè)不同濃度的供試品溶液，各3份，共9份，精密稱定，置25 mL容量瓶中，分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液2、4、6 mL，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，制成加樣回收供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定,分別計(jì)算檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦的回收率。結(jié)果檸檬烯的平均回收率為99.0%，RSD為1.3%(n=9)；(-)-薄荷酮的平均回收率為101.4%，RSD為0.6%(n=9)；乙酸薄荷酯的平均回收率為99.9%，RSD為0.5%(n=9)；薄荷腦的平均回收率為97.0%，RSD為1.5%(n=9)。結(jié)果見表1，表明該方法的準(zhǔn)確度較好。

表1 準(zhǔn)確度(加樣回收)試驗(yàn)結(jié)果

3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取本品(批號(hào)：190118)0.2 g，取共6份，按“2.2.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，結(jié)果：檸檬烯平均含量為6.0%(g·g-1)，RSD為1.5%(n=6)；(-)-薄荷酮平均含量為17.6%(g·g-1)，RSD為1.3%(n=6)；乙酸薄荷酯平均含量為5.9%(g·g-1)，RSD為1.4%(n=6)；薄荷腦平均含量為31.0%(g·g-1)，RSD為1.0%(n=6)。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

3.3 精密度考察 取“2.2.3”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)6次進(jìn)樣，結(jié)果檸檬烯峰面積的RSD為0.4%；(-)-薄荷酮峰面積的RSD為0.4%；乙酸薄荷酯峰面積的RSD為0.3%；薄荷腦峰面積的RSD為0.4%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液各1、2、4、6、8、10 mL，置10 mL容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”的色譜條件測定。以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪圖得直線，回歸方程如下：

檸檬烯Y=558.4X-10 664(r=0.999 8)；(-)-薄荷酮Y=413.94X-36 306(r=0.999 6)；乙酸薄荷酯Y=444.65X-7 934.1(r=0.999 8)；薄荷腦Y=521.68X-68 500(r=0.999 8)。結(jié)果表明：檸檬烯在147.34～1 473.41 ng；(-)-薄荷酮在504.35～5 043.49 ng；乙酸薄荷酯在151.72～1 517.20 ng；薄荷腦在808.40～8 084.00 ng的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.5 耐用性

3.5.1 色譜條件考察 經(jīng)過對(duì)恒溫和程序升溫的多次實(shí)驗(yàn)，因?yàn)闃悠分饕煞州^多，發(fā)現(xiàn)程序升溫有利于檸檬烯與桉油精、薄荷腦與胡薄荷酮的分離。所以選擇了“2.1”作為最終的色譜條件(見圖1)。

3.5.2 不同色譜柱及不同色譜儀的考察 取同一份本品溶液(批號(hào)：190118)，在不同品牌的聚乙二醇色譜柱上測定以及用同一根氣相色譜柱HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)在不同品牌的氣相色譜儀上測定，分離度均良好，測定結(jié)果基本一致，結(jié)果無明顯差別(見表2)。

表2 不同色譜柱及不同色譜儀的考察結(jié)果

3.5.3 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一份本品溶液(批號(hào)：190118)，分別在第0、5、10、15、20、25 h，注入氣相色譜儀中,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,結(jié)果檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦峰面積的RSD分別為2.0%、1.9%、1.9%、1.8%，結(jié)果表明供試品在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.檸檬烯；2.桉油精；3.薄荷酮；4.乙酸薄荷酯；5.薄荷腦；6.胡薄荷酮圖1 系統(tǒng)適用性圖譜

3.6 樣品測定 根據(jù)正文制定的方法，按含量測定方法測定，測定了8批薄荷素油里檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦的含量，結(jié)果詳見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果

4 指紋圖譜

按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，桉油精峰峰面積小，不適合作為參照峰。以檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦為參照峰，建立指紋圖譜，并進(jìn)行方法學(xué)考察，以期為其質(zhì)量控制提供參考[4-5]。

4.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：190118)，約0.2 g，精密稱定，共6份，按 “2.2.4”項(xiàng)下的方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定。以薄荷腦為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果測得各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間沒有顯著性差異，RSD為0；共有峰的相對(duì)峰面積RSD均<3%；采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件進(jìn)行處理,6份樣品的圖譜與對(duì)照圖譜相似度≥0.999，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：190118)，約0.2 g，精密稱定，按含量測定“2.2.4”項(xiàng)下的方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別于0、5、10、15、20、25 h注入氣相色譜儀進(jìn)行分析，記錄色譜圖。以環(huán)己酮為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果測得各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.1%，共有峰的相對(duì)峰面積RSD<5.0%；采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件進(jìn)行處理，6次進(jìn)樣的圖譜與對(duì)照圖譜相似度均≥0.998，結(jié)果表明供試品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定。

4.3 不同色譜柱 試驗(yàn)中考察了2種不同型號(hào)的色譜柱：S1:Agilent HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，S2:Agela Technologies DA-FFAP毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。結(jié)果采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件進(jìn)行處理，2份進(jìn)樣的圖譜與對(duì)照圖譜相似度均≥0.998，結(jié)果表明供試品溶液在不同型號(hào)色譜柱中穩(wěn)定。

4.4 不同儀器 試驗(yàn)中考察了3種不同品牌型號(hào)的氣相色譜儀：S1:Shimadzu GC-2030 氣相色譜儀；S2:Shimadzu GC-2010 氣相色譜儀；S3：Thermo Scientific Trace 1300氣相色譜儀。結(jié)果采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件進(jìn)行處理，3份進(jìn)樣的圖譜與對(duì)照圖譜相似度均≥0.994，結(jié)果表明供試品溶液在不同品牌型號(hào)的氣相色譜儀中穩(wěn)定。

4.5 樣品測定及色譜峰的化學(xué)成分指認(rèn) 取8批薄荷素油樣品，按照含量測定“2.2.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。對(duì)所有樣品的色譜圖進(jìn)行統(tǒng)一積分后，將所得圖譜以AIA格式導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)研制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件進(jìn)行處理， 8批AIA格式的色譜圖生成對(duì)照圖譜；選擇平均數(shù)法作為對(duì)照圖譜的生成方法，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1，運(yùn)用多點(diǎn)校正方法對(duì)色譜峰進(jìn)行Mark峰匹配，得到8批樣品 GC 指紋圖譜疊加圖，確定了6個(gè)共有峰，通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)峰1、2、4、6分別為檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦。混合對(duì)照品溶液、供試品溶液色譜圖分別見圖2～3。

1.檸檬烯；2.(-)-薄荷酮；4.乙酸薄荷酯；S.薄荷腦圖2 混合對(duì)照品溶液色譜圖

1.檸檬烯；2.(-)-薄荷酮；4.乙酸薄荷酯；S.薄荷腦圖3 供試品溶液色譜圖

4.6 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

4.6.1 指紋圖譜共有模式的建立 將所得8批薄荷素油GC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)研制的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)軟件，確定了除溶劑峰與內(nèi)標(biāo)峰以外的6個(gè)共有峰，建立了薄荷素油GC 指紋圖譜。

4.6.2 樣品檢驗(yàn)結(jié)果與分析 8批薄荷素油GC指紋圖譜疊加圖(見圖4)，生成對(duì)照指紋圖譜，并進(jìn)行了相似度計(jì)算，結(jié)果除溶劑峰和內(nèi)標(biāo)峰以外，8批供試品的相似度范圍：0.997～0.999；樣品之間的相似度較高，均大于0.90，故8批樣品均符合規(guī)定(見表4)。

圖4 8批薄荷素油GC指紋圖譜疊加圖

表4 8批供試品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

5 討論

本文考察了多種物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，其中萘與聯(lián)苯色譜峰保留時(shí)間遠(yuǎn)大于共有峰保留時(shí)間，而環(huán)己酮色譜峰在檸檬烯與(-)-薄荷酮之間，且與樣品中的其他色譜峰均能得到很好的分離，故選擇環(huán)己酮作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)物。完善了薄荷素油現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。采用多參照峰指紋圖譜結(jié)合多組分含量測定的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，能更全面地對(duì)薄荷素油進(jìn)行質(zhì)量控制。

本試驗(yàn)以薄荷素油《中國藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，修訂了氣相指紋圖譜，標(biāo)定共有峰6個(gè)，指認(rèn)了其中4 個(gè)化學(xué)成分，并對(duì)4個(gè)成分進(jìn)行了定量檢測。多組分含量測定與指紋圖譜結(jié)合，較常規(guī)檢驗(yàn)和單個(gè)成分定量測定，更能全面反映該制劑質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性，對(duì)薄荷素油的質(zhì)量評(píng)價(jià)有更積極的意義，為保證臨床用藥的安全性、有效性和穩(wěn)定性提供了方法和依據(jù)。