鹽漬辣椒真菌多樣性分析

趙玲艷，黃嘉欣，楊 劍，卿煜維，潘金微，黃 潔，鄧放明

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 長沙410128）

鹽漬辣椒制作過程中常添加15%以上的食鹽，0.05%～0.1%的CaCl2及0.05‰～0.1‰的焦亞硫酸鈉，因此該類辣椒保藏時(shí)間較長，且能保持較脆的辣椒口感，是剁辣椒加工過程中一類原料[1-3]。鹽漬辣椒的質(zhì)量好壞，直接影響中、低鹽再加工品的質(zhì)量和安全。近年來，鹽漬辣椒的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，中、低鹽再加工品的提質(zhì)以及鹽漬辣椒的微生物多樣性等逐漸引起從業(yè)人員的重視[2-7]。

現(xiàn)階段微生物多樣性研究報(bào)道多集中在環(huán)境土壤湖泊等領(lǐng)域[6-9]，而食品方向以釀酒領(lǐng)域居多，發(fā)酵蔬菜類以韓國泡菜居多[8-15]，而發(fā)酵辣椒多樣性研究鮮見。454 焦磷酸測(cè)序技術(shù)測(cè)序已成熟應(yīng)用到微生物菌落鑒定中，能有效分析出樣品生態(tài)環(huán)境中原始微生物的組成及其比重[15-19]。趙玲艷等[2]研究發(fā)現(xiàn)線椒自然發(fā)酵過程中的真菌可歸屬到39 個(gè)屬、56 個(gè)種，優(yōu)勢(shì)真菌為漢遜酵母屬，米椒自然發(fā)酵過程中的真菌可歸屬到60 個(gè)屬、96個(gè)種，優(yōu)勢(shì)真菌為漢遜酵母屬和畢赤酵母屬。

本研究采用454 焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究鹽漬辣椒中真菌多樣性，以確定鹽漬辣椒中真菌群落結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度。在此基礎(chǔ)上，研究鹽漬辣椒細(xì)菌多樣性，分析高鹽腌漬辣椒過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度的變化，為安全生產(chǎn)腌漬辣椒，保障產(chǎn)品質(zhì)量，提高風(fēng)味提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

鹽漬米椒 （C.annuum L.var.dactylus M）、鹽漬線椒 （C.annuum L.var.conoides Irish），湖南壇壇香食品科技有限公司。

1.2 主要試驗(yàn)試劑

E.Z.N.A.?Soil DNA 試劑盒、TransStart Fastpfu DNA 聚合酶、AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒、Roche GS FLX Titanium emPCR 試劑盒、Manual_XLR70 試劑盒，美國Omega Bio-Tek 公司。

1.3 儀器與設(shè)備

DYY-6C 型凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700 型PCR 儀，美國ABI；QuantiFluorTM-ST 熒光定量系統(tǒng)，美國Promega；Roche GS FLX 測(cè)序儀，瑞士Roche。

1.4 方法

1.4.1 樣品采集 本研究以鹽漬線椒及鹽漬米椒為對(duì)象，選擇色澤、風(fēng)味較好的樣品，無菌操作取樣帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃冰箱保存[2]。

1.4.2 理化指標(biāo)的測(cè)定 總酸：參照GB/T 12456-2008[20]測(cè)定；NaCl：參照GB/T12457-2008[21]測(cè)定；水分：直接干燥法測(cè)定；辣椒素：參照GB-T 21266-2007[22]測(cè)定。

1.4.3 樣品中微生物DNA 的提取 參照OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA 試劑盒抽提方法提取DNA[22-25]。

1.4.4 擴(kuò)增產(chǎn)物定量及測(cè)序 正反向引物（27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，533R 5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’），帶有5’端454測(cè)序A、B 接頭的特異引物和3’端的融合引物，其中A 為測(cè)序端，需要加上條碼（barcode），B 端引物可以共用[26-28]。PCR 采用20 μL 反應(yīng)體系。

1.4.5 PCR 產(chǎn)物定量、測(cè)序 PCR 產(chǎn)物熒光定量，要求總量＞100 ng，要求PCR 產(chǎn)物濃度＞5 ng/μL，OD260/280值在1.8～2.0 左右，未降解，根據(jù)454 Roche GS-FLX 測(cè)序[28]。

1.4.6 生物信息分析方法 數(shù)據(jù)采取Qiime[29]（vsesion 1.17 http：//qiime.org/）軟件去雜，生物信息學(xué)分析以去除嵌合體、分類學(xué)分析、OTU 聚類、比對(duì)分析等[30-36]。計(jì)算α 多樣性指數(shù)后，進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)組分、繪制熱圖（Heatmap）、PCA 分析、豐度等級(jí)（Rank-Abundance）和多樣性（Shannon-Wiener）曲線繪制等分析[33-36]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽漬米椒和線椒的理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

鹽漬米椒和鹽漬線椒的辣椒素、水分、總酸、食鹽含量的變化見表1。從表1可以看出，鹽漬米椒的辣椒素含量為26 120 SHU，水分含量為65.10%，總酸含量為0.82%，食鹽含量為14.48%；鹽漬線椒的辣椒素含量為2 412 SHU，水分含量為73.18%，總酸含量為0.15%，食鹽含量為21.61%。

2.2 鹽漬線椒和米椒細(xì)菌和真菌的稀疏性曲線

鹽漬線椒和鹽漬米椒細(xì)菌和真菌的稀疏性曲線見圖1。由圖1可以看出，當(dāng)細(xì)菌測(cè)序量增加到5 000，真菌測(cè)序量增加到2 000 左右時(shí)，測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和，試驗(yàn)設(shè)定細(xì)菌10 000 條序列、真菌5 000 條序列的測(cè)序深度是合理的。鹽漬線椒細(xì)菌和真菌稀疏性曲線分別比鹽漬米椒細(xì)菌和真菌的稀疏性曲線陡、高，鹽漬線椒的細(xì)菌和真菌多樣性分別高于鹽漬米椒的細(xì)菌和真菌多樣性。

表1 鹽漬辣椒的理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 1 Physical and chemical indicator results of salted pepper

圖1 97%相似水平下鹽漬辣椒細(xì)菌和真菌稀疏性曲線Fig.1 Sparsity curve of bacteria and fungi in salted pepper at 97% similarity level

2.3 鹽漬米椒和線椒真菌多樣性評(píng)估結(jié)果

優(yōu)化序列在相似度97%的水平下進(jìn)行OTU聚類，從表2可以看出，鹽漬線椒和鹽漬米椒的真菌OTUs 數(shù)分別為304 個(gè)和18 個(gè)，鹽漬線椒中真菌的OTU 數(shù)分別大于鹽漬米椒真菌的OTU 數(shù)；鹽漬線椒和米椒真菌OUT 值小于ACE 值和Chao1 值，說明在鹽漬線椒和米椒中可能存在很多未知的微生物資源；鹽漬線椒細(xì)菌的ACE 和Chaol 指數(shù)大于鹽漬米椒，Shannon 指數(shù)小于鹽漬米椒，Simpson 大于鹽漬米椒，說明鹽漬線椒的真菌豐富度（richness）大于鹽漬米椒，鹽漬米椒的真菌均衡度（Species eveness）高于鹽漬線椒。

表2 鹽漬辣椒在97%相似性水平下真菌的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of fungi in salted pepper at 97% similarity level

2.4 鹽漬線椒和米椒的真菌群落多樣性分析結(jié)果

2.4.1 鹽漬線椒和米椒在門水平真菌群落組成鹽漬線椒和米椒的真菌18S rDNA 基因經(jīng)過焦磷酸測(cè)序和分類學(xué)分析后，在門分類水平，相對(duì)豐度大于0.01%的真菌見圖2。鹽漬線椒已知分類的真菌可歸屬到2 個(gè)門、13 個(gè)綱、17 個(gè)目、31 個(gè)科、45 個(gè)屬、87 個(gè)種。鹽漬米椒已知分類的真菌可歸屬到1 個(gè)門、1 個(gè)綱、2 個(gè)目、2 個(gè)科、2 個(gè)屬、1 個(gè)種。其中鹽漬線椒真菌門類（phylum）主要包括：子囊菌門（Ascomycota，73.63%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota，23.42%），其它（Unclassified）占真菌序列總數(shù)的2.95%。鹽漬米椒只有1 個(gè)已知分類真菌門類：子囊菌門（Ascomycota，99.96%）。

圖2 在門水平相對(duì)豐度大于0.01%的真菌群落組成Fig.2 The relative abundance of fungi is more than 0.01% at the phylum level

2.4.2 鹽漬線椒和米椒在綱水平真菌群落組成在綱水平，鹽漬線椒和鹽漬米椒相對(duì)豐度大于0.01%的真菌見圖3。從圖3可以看出，在綱水平，鹽漬線椒中相對(duì)豐度大于0.01%的真菌有酵母綱（Saccharomycetes，35.23%）、座囊菌綱（Dothideomycetes，29.78%）、銀耳綱（Tremellomycetes，21.27%）、糞殼菌綱（Sordariomycetes，5.68%）、無分類（Unclassified 5.22%）、柄銹菌亞門（Pucciniomycotina，1.72%）、錘舌菌綱（Leotiomycetes，0.43%）、傘型束梗孢菌綱（Agaricostilbomycetes，0.13%）、其它（Others，0.1%）、散囊菌綱（Eurotiomycetes，0.08%）、外擔(dān)菌綱（Exobasidiomycetes，0.07%）、傘菌綱（Agaricomycetes，0.02%）；鹽漬線椒中相對(duì)豐度大于0.01%的真菌有酵母綱（Saccharomycetes，99.89%）、無分類（Unclassified，0.11%）。

圖3 在綱水平相對(duì)豐度大于0.01%的真菌群落組成Fig.3 The relative abundance of fungi is more than 0.01% at the class level

2.4.3 鹽漬線椒和米椒在目水平真菌群落組成在目水平，鹽漬線椒和鹽漬米椒相對(duì)豐度大于0.01%的真菌見圖4。從圖4可以看出，在目水平，鹽漬線椒中相對(duì)豐度大于0.01%的已知分類地位的真菌有酵母目 （Saccharomycetales，35.23%）、格孢腔菌目（Pleosporales，22.82%）、銀耳目（Tremellales，20.02%）、煤炱目（Capnodiales，6.75%）、小叢殼目（Glomerellales，5.15%）、擔(dān)孢酵母目（Erythrobasidiales，1.58%）、線黑粉菌目（Filobasidiales，1.25%）、其它（Others，0.85%）、柔膜菌目（Helotiales，0.43%）、黑粉菌目（Agaricostilbomycetes_in certae_sedis，0.13%）、刺盾炱目（Chaetothyriales，0.08%）、鎖擲酵母目（Sporidiobolales，0.08%）；鹽漬米椒中相對(duì)豐度大于0.01%的已知分類地位的真菌有酵母目（Saccharomycetales，99.89%）、無分類（Unclassified，0.11%）。

圖4 在目水平相對(duì)豐度大于0.01%的真菌群落組成Fig.4 The relative abundance of fungi is more than 0.01% at the order level

2.4.4 鹽漬線椒和米椒在科水平真菌群落組成在科水平，鹽漬線椒和鹽漬米椒相對(duì)豐度大于0.01%真菌見圖5。在科水平，鹽漬線椒中相對(duì)豐度大于0.01%的已知分類地位的真菌有畢赤酵母科（Pichiaceae，25.78%）、孢腔菌科（Pleosporaceae，22.23%）、有絲分裂銀耳科（Mitosporic_Tremellales，18.15%）、有絲分裂酵母科（Mitosporic_Saccharomycetales，7.82%）、新球腔菌科（Davidiellaceae，6.27%）、未分類（Unclassified，5.42%）、其它（Others，4.72%）、小叢殼科（Glomerellaceae，4.4%）、銀耳科 （Tremellaceae，1.85%）、紅擔(dān)子科（Erythrobasidiaceae，1.58%）、金絲酵母科（Debaryomyc etaceae，0.95%）、酵母科（Saccharomycodaceae，0.15%）、有絲分裂傘型束梗孢菌亞綱（Mitosporic_Agaricostilbomycetidae，0.13%）、有絲分裂鎖擲酵母科 （Mitosporic_Sporidiobolales，0.08%）；鹽漬線椒中相對(duì)豐度大于0.01%的已知分類地位的真菌有有絲分裂鎖擲酵母科（Mitosporic_Sporidiobolale，93.49%）、金絲酵母科（Debaryomycetaceae，0.06%）、無分類（Unclassified，6.09%）、其它（Others，0.37%）。

圖5 在科水平相對(duì)豐度大于0.01%的真菌群落組成Fig.5 The relative abundance of fungi is more than 0.01% at the family level

2.4.5 鹽漬線椒和米椒在屬水平真菌群落組成在屬水平，鹽漬線椒和米椒相對(duì)豐度大于0.01%的真菌群落組成和相對(duì)豐度見圖6。鹽漬線椒相對(duì)豐度大于0.01%的真菌有12 個(gè)屬，分別為：畢赤酵母屬（Pichia，25.78%）、鏈格孢屬（Alternaria，21.85%）、漢納酵母屬（Hannaella，10.55%）、假絲酵母屬（Candida，7.82%）、隱球酵母屬（Cryptococcus，6.92%）、枝孢屬（Cladosporium，6.27%）、刺盤孢屬（Colletotrichum，4.4%）、不勒擔(dān)孢酵母（Bulleromyces，1.83%）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces，1.57%）、Dioszegia（1.15%）、未分類（Unclassified，5.47%）、其它（Others，6.4%）。鹽漬米椒優(yōu)勢(shì)真菌只有假絲酵母屬（Candida，93.49%）。另從圖7中可清楚看到相對(duì)豐度大于1%時(shí)，兩者的差別更加明顯。

圖6 在屬水平鹽漬辣椒細(xì)菌（大于0.01%）群落組成和相對(duì)豐度Fig.6 Community composition and relative abundance of bacteria （more than 0.01%） in salted pepper at genus level

2.4.6 鹽漬線椒和鹽漬米椒真菌前100 個(gè)OTUs Heatmap 分析 鹽漬線椒和鹽漬米椒真菌前100個(gè)OTUs 相似性聚類結(jié)果見圖8。鹽漬線椒和鹽漬米椒真菌前100 個(gè)OTUs 經(jīng)聚類分析后發(fā)現(xiàn)：前100 個(gè)細(xì)菌OTUs 中，鹽漬線椒中含有75 個(gè)，鹽漬米椒中含有48 個(gè)，鹽漬線椒和鹽漬米椒中共同含有的細(xì)菌OTUs 有23 個(gè)。鹽漬線椒中共檢測(cè)到47個(gè)真菌OTUs，鹽漬米椒中共檢測(cè)到4 個(gè)真菌OTUs。鹽漬線椒中真菌主要以畢赤酵母屬（Pichia，25.78%）、鏈格孢屬（Alternaria，21.85%）和漢納酵母屬（Hannaella，10.55%）為主，鹽漬米椒中真菌主要以假絲酵母屬（Candida，93.49%）為主。分析對(duì)比鹽漬線椒及米椒數(shù)據(jù)情況，發(fā)現(xiàn)鹽漬線椒和米椒中參與發(fā)酵的真菌種類明顯不同，相對(duì)豐度差異也較大。

圖7 鹽漬辣椒優(yōu)勢(shì)真菌（相對(duì)豐度大于1%）屬群落組成和相對(duì)豐度Fig.7 The dominant fungi （relative abundance is more than 1%） belong to community composition and relative abundance of salted pepper

3 結(jié)論

鹽漬線椒的食鹽含量為21.61%，總酸含量為0.15%，水分含量為73.18%；鹽漬米椒的食鹽含量為14.48%，總酸含量為0.82%，水分含量為65.10%，雖然鹽漬線椒的食鹽含量高于鹽漬米椒的食鹽含量，但鹽漬線椒中的微生物種類比鹽漬米椒中的微生物種類豐富，推測(cè)其原因可能是鹽漬米椒的高酸和低水分含量抑制了部分微生物生長。

鹽漬線椒和鹽漬米椒的真菌經(jīng)454 焦磷酸測(cè)序分析和序列優(yōu)化處理后，鹽漬線椒和鹽漬米椒優(yōu)化后的真菌序列分別為12 659 條和7 047 條，真菌序列平均長度為430 bp。

鹽漬線椒已知分類的真菌可歸屬到2 個(gè)門、13 個(gè)綱、17 個(gè)目、31 個(gè)科、45 個(gè)屬、87 個(gè)種。鹽漬米椒已知分類的真菌可歸屬到1 個(gè)門、1 個(gè)綱、2個(gè)目、2 個(gè)科、2 個(gè)屬、1 個(gè)種。鹽漬線椒優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門 （Ascomycota，73.63%） 和擔(dān)子菌門（Basidiomycota，23.42%），其它為未分類（Unclassified）占真菌序列總數(shù)的2.95%。鹽漬米椒只有1個(gè)已知分類真菌門類：子囊菌門（Ascomycota，99.96%）。鹽漬線椒優(yōu)勢(shì)真菌屬為：畢赤酵母屬（Pichia，25.78%）、鏈格孢屬（Alternaria，21.85%）、漢納酵母屬 （Hannaella，10.55%）、假絲酵母屬（Candida，7.82%）、隱球酵母屬（Cryptococcus，6.92%）、枝孢屬（Cladosporium，6.27%），鹽漬米椒優(yōu)勢(shì)真菌只有假絲酵母屬（Candida，93.49%）。

圖8 相對(duì)豐度前100 的真菌OTUs 在樣品間的分布Fig.8 Distribution of OTUs in top 100 fungi

本研究分析了鹽漬辣椒在高鹽環(huán)境中仍能夠參與發(fā)酵的真菌種類，真菌群落結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度，為后續(xù)研究高鹽鹽漬蔬菜產(chǎn)品，改善鹽漬辣椒產(chǎn)品風(fēng)味，提升產(chǎn)品安全性提供了參考。