鮐魚冷海水貯藏期間特定腐敗菌的鑒定

鄭振霄，戴志遠(yuǎn)*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江工商大學(xué) 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310012）3 浙江工商大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 杭州310012）

魚類在捕獲后很容易發(fā)生腐敗變質(zhì)，細(xì)菌活動(dòng)是引起魚類腐敗變質(zhì)的主要因素。新鮮漁獲物中的細(xì)菌組成多樣，包含漁獲物所生長(zhǎng)環(huán)境中的細(xì)菌和魚體自帶的細(xì)菌。然而，在魚體捕獲后，貯藏條件（如溫度、氧氣、鹽分等）對(duì)魚體的菌相組成產(chǎn)生重要影響，能夠適應(yīng)貯藏條件的細(xì)菌大量繁殖，不適應(yīng)的細(xì)菌被淘汰。這些適應(yīng)環(huán)境的細(xì)菌中，又有一少部分可以降解魚體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，代謝產(chǎn)生三甲胺和硫化氫，這些物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的腐敗臭味，具有很強(qiáng)的致腐能力[1-6]。20世紀(jì)90年代，丹麥國(guó)科學(xué)家Dalgaard[7]在總結(jié)前人的諸多研究的基礎(chǔ)上，將這一少部分細(xì)菌定義為特定腐敗菌，這一概念對(duì)于后來(lái)人們研究水產(chǎn)的腐敗，具有重要意義。

鮐魚是一種中、上層魚類，隨著我國(guó)海洋漁業(yè)資源分布的變遷，鮐魚等中、上層魚類漁業(yè)資源的地位不斷攀升[8]。鮐魚的漁汛一般在夏季，溫度高，漁獲量大，此外，鮐魚屬于鯖科魚類，漁獲不及時(shí)處理，易發(fā)生組胺積累，導(dǎo)致鮐魚比其它水產(chǎn)更容易發(fā)生腐敗劣變。因此，鮐魚捕獲后應(yīng)立即采取保鮮措施，否則難以保質(zhì)。鑒于漁船上的實(shí)際條件，能夠有效執(zhí)行的保鮮方法有冰鮮、凍藏保鮮和冷海水保鮮。冰鮮是最常用的保鮮方法，它可以較大程度地保持鮐魚肌肉的原始特征，從而保持較好的口感，然而冰鮮的處理量較少，需要占用較大的空間；凍藏是另一種常用的保鮮方法，凍藏的最大特點(diǎn)就是保鮮時(shí)間長(zhǎng)，然而凍藏不僅能耗高，而且凍藏的樣品解凍后不能完全保持原有特征，且凍藏期間的氧化劣變也是不可忽視的。相比于上述兩者，冷海水保鮮采用的冷卻介質(zhì)為液體，液體的傳熱效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于空氣，這樣魚體的溫度能夠在較短時(shí)間內(nèi)降下來(lái)，利于后期處理。此外，冷海水保鮮的處理量大，廣泛應(yīng)用于鮐魚等中、上層魚類捕獲后的暫存。然而，冷海水保鮮的貯藏環(huán)境也與上述兩者有很大差別，使貯藏期間微生物種群的變化與前兩者有較大差別[9-10]，而對(duì)于特定腐敗菌，它不僅隨魚種的變化而變化，而且還隨貯藏環(huán)境的變化而變化[7]。

關(guān)于鮐魚不同貯藏過(guò)程中的菌相組成及變化的研究報(bào)道較多。翁佩芳等[11]采用16S rDNA 測(cè)序技術(shù)研究鮐魚在凍藏期間優(yōu)勢(shì)菌群的變化，結(jié)果表明不動(dòng)桿菌為貯藏前期的優(yōu)勢(shì)菌群，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群變?yōu)樗髼U菌屬和希瓦氏菌屬，凍藏20 d 的樣品中優(yōu)勢(shì)種群為能產(chǎn)生組胺的哈夫尼菌屬和沙雷菌屬。孟璐[12]采用宏基因組測(cè)序的方法研究氣調(diào)包裝后，在冷藏條件下鮐魚中的菌相變化，結(jié)果表明鮐魚在貯藏過(guò)程中菌相組成逐漸單一，由初始的以海洋科細(xì)菌和鹽單胞菌科細(xì)菌為主過(guò)渡到以希瓦氏菌為主，貨架終點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)微生物為發(fā)光桿菌。雖然許多學(xué)者對(duì)鮐魚貯藏過(guò)程中的微生物變化做過(guò)相關(guān)研究，但是關(guān)于鮐魚冷海水貯藏期間的菌相變化及特定腐敗菌的研究甚少。本文以新鮮鮐魚為對(duì)象，采用機(jī)制冷海水對(duì)其進(jìn)行保鮮處理，采用選擇性培養(yǎng)基和16S rDNA 序列法分析鮐魚在貯藏前、中、后期的菌相組成及變化，并通過(guò)對(duì)腐敗樣品中優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐能力的測(cè)定，確定鮐魚冷海水保鮮的特定腐敗菌，為鮐魚的質(zhì)量安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮鮐魚，捕獲于中國(guó)東海，與漁船工作協(xié)商將最后一網(wǎng)捕獲的鮐魚作為試驗(yàn)原料。

假單胞菌（CFC）選擇性培養(yǎng)基（Pseudomonas CFC selective agar）、硫代硫酸鈉檸檬酸膽鹽蔗糖（TCBS） 瓊脂 （Thiosulfate citrate bile sucrose agar）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖 （VRBGA） 瓊脂（Violet red bile glucose agar，VRBGA）、MRS 瓊脂（MRS agar）、鐵瓊脂（Icron agar）、2216E 瓊脂（2216E agar）、STAA 瓊脂培養(yǎng)基（STAA agar mesium），青島海博生物科技有限公司；鹽酸、氯化鈉等常規(guī)化學(xué)試劑（分析純級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)（上海）有限公司。

恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器設(shè)備有限公司。

1.2 模擬冷海水保鮮系統(tǒng)的建立

潔凈的海水取自中國(guó)東海，裝入25 L 的不銹鋼容器中（下有流水出口），將此容器放置在冷藏室中（設(shè)定溫度為-1～0 ℃）。新鮮的鮐魚捕獲于中國(guó)東海，捕獲后立即放入裝有冷海水的容器中，6 h 內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室。運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，挑取規(guī)格統(tǒng)一、體形完整的樣品放進(jìn)實(shí)驗(yàn)室自制的冷海水系統(tǒng)中（海水與魚的質(zhì)量比為7∶3），試驗(yàn)期間每2 d 更換1 次冷海水。貯藏期為12 d，其中第0，3，6，9，12天為取樣時(shí)間節(jié)點(diǎn)，每次取3 條，采集鮐魚的背部肌肉用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 感官評(píng)定

取不同貯藏期的鮐魚肉樣品，參考Manju等[13]的方法對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定。感官評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為色澤、質(zhì)地和氣味。由6 位經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的感官評(píng)定人員組成評(píng)定小組，對(duì)鮐魚的色澤、質(zhì)地和氣味進(jìn)行打分，綜合評(píng)分為1～9 分，1 分品質(zhì)最差，9分品質(zhì)最好，4 分作為可接受下限。

1.4 理化分析

揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定參照《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》（GB 5009.228-2016）[14]中的方法進(jìn)行測(cè)定；三甲胺的測(cè)定參照《食品中三甲胺的測(cè)定》（GB 5009.179-2016）[15]中的方法進(jìn)行測(cè)定；組胺的測(cè)定參照《食品中生物胺的測(cè)定》（GB 5009.208-2016）[16]中的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 選擇性培養(yǎng)基分析菌群群落變化

分別采用不同的選擇性培養(yǎng)基，對(duì)不同貯藏時(shí)間的鮐魚樣品中相關(guān)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，具體培養(yǎng)條件見表1[17-19]。

1.6 菌種鑒定

樣品中DNA 的提取方法參照DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.A）試劑盒說(shuō)明書的方法進(jìn)行。引物采用27F 和1492R 這2 種通用引物，擴(kuò)增所得產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析其純度，測(cè)序由上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.7 優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐能力的測(cè)定

將從腐敗樣品中得到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌置于液體培養(yǎng)基中，制成105CFU/mL 的菌懸液，按照魚肉∶菌懸液=1∶0.1 （g/mL） 的料液比接種到無(wú)菌魚塊上，以未接種腐敗菌的無(wú)菌魚肉塊作為對(duì)照，貯藏在0 ℃冰箱中，定期測(cè)定樣品中的揮發(fā)性鹽基氮、三甲胺、組胺和菌落總數(shù)，以評(píng)價(jià)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的致腐能力[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)價(jià)

貯藏期間感官評(píng)分變化見圖1。在整個(gè)貯藏期間，感官評(píng)分和貯藏時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，感官評(píng)分的最大值和最小值分別為8.5 分和1.6 分。新鮮鮐魚體表鱗片有光澤，有透明黏液附著在其表面，肌肉堅(jiān)實(shí)有彈性，感官評(píng)價(jià)為8.5 分。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，感官評(píng)分不斷下降，在貯藏第6 天時(shí)，樣品出現(xiàn)了顯著軟化，并伴隨破肚現(xiàn)象，評(píng)分下降到5分；貯藏到第9 天，破肚樣品進(jìn)一步增多，且散發(fā)出特有的腐敗臭味，感官評(píng)分降低至3.1 分；貯藏結(jié)束時(shí)，多數(shù)樣品出現(xiàn)了破肚現(xiàn)象，散發(fā)出濃重的腐敗惡臭，感官評(píng)分低至1.5 分。綜上所述，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，鮐魚冷海水保鮮的保鮮期為9 d。對(duì)比前人研究[10，22-23]，冷海水保鮮的貨架期與冰鮮貯藏方法較為接近，然而明顯短于凍藏。

2.2 菌相變化

選擇性培養(yǎng)基是根據(jù)某類微生物特殊的營(yíng)養(yǎng)要求，或者該類微生物的某些特殊化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的，能夠選擇性區(qū)分這一類微生物的培養(yǎng)基。利用選擇性培養(yǎng)基，可使混合菌群中的某一類微生物變成優(yōu)勢(shì)種群，提高篩選效率。然而，腐敗菌的種類繁多，通常使用1 種培養(yǎng)基不能對(duì)腐敗菌進(jìn)行全面篩選，通常需要幾種選擇性培養(yǎng)基一起使用，才能夠?qū)φw的腐敗菌做到有效篩選[9，24-25]。本文選取了6 種常用于篩選腐敗菌的選擇性培養(yǎng)基，對(duì)鮐魚冷海水貯藏期間的菌相變化進(jìn)行分析，不同選擇性培養(yǎng)基上菌相變化如圖2所示。整體來(lái)看，貯藏初期樣品在不同選擇性培養(yǎng)基上的菌落數(shù)都處于較低水平，數(shù)值分別為2.54 lg（CFU/g）（VRBGA），2.63 lg （CFU/g）（2216E），2.15 lg （CFU/g）（CFC），1.50 lg （CFU/g）（IA），1.31 lg（CFU/g）（MRS）和1.10 lg（CFU/g）（STAA）。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，2216E、MRS 和STAA 培養(yǎng)基上的菌落總數(shù)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，最大值分別出現(xiàn)在第6 天[4.60 lg （CFU/g）]、第9 天[（2.78 lg（CFU/g）]和 第3 天[（3.61 lg （CFU/g）]。VRBGA、CFC 和IA 培養(yǎng)基上的菌落總數(shù)在整個(gè)貯藏過(guò)程中始終處于增加趨勢(shì)，最大值為5.50，4.81，6.17 lg（CFU/g），分別是初始值的2.17，2.23，4.11 倍。結(jié)果表明，2216E、MRS 和STAA 培養(yǎng)基上的種群在貯藏過(guò)程中不能適應(yīng)所處的環(huán)境，因而逐漸被淘汰，而VRBGA、CFC 和IA 培養(yǎng)基上的種群能夠適應(yīng)冷海水貯藏環(huán)境，逐漸成為優(yōu)勢(shì)種群。

圖1 感官評(píng)分的變化Fig.1 Changes in sensory score

圖2 菌群組成的變化Fig.2 Changes in the composition of the flora

2.3 菌種鑒定

采用16S rDNA 序列分析法對(duì)鮐魚貯藏初期（0 d）、中期（6 d）和末期（12 d）的樣品中的代表性微生物進(jìn)行菌種鑒定，鑒定結(jié)果如表2所示。貯藏初期的樣品中共純化得到12 株具有代表性菌株，它們分別來(lái)自3 種選擇性培養(yǎng)基，VRBGA（3 株），2216E（5 株），CFC（4 株）。其中，6 株被鑒定為嗜冷桿 菌 （Psychrobacter），3 株被鑒定為假單胞菌（Pseudomonas），2 株被鑒定為伽馬變形菌（Oceanisphaera sp.），1 株被鑒定為類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.），嗜冷桿菌占多數(shù)，說(shuō)明嗜冷桿菌是鮐魚貯藏初期的優(yōu)勢(shì)微生物。貯藏中期的樣品中共純化得到30 株具有代表性的菌株，分別為CFC（11 株），VRBGA（6 株），IA（5 株），2216E（5株），STAA（2 株），MRS（1 株）。在30 株菌中，有12株被鑒定為假單胞菌，占絕大多數(shù)，說(shuō)明假單胞菌是貯藏中期的優(yōu)勢(shì)微生物，其次為希瓦氏菌（Shewanella，6 株）和嗜冷桿菌（6 株）。此外，還有2 株被鑒定為腸桿菌（Enterobacter），短桿菌（Brevibacterium sp.）、伽馬變形菌、發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）和穩(wěn)桿菌（Empedobacter）各有1株。貯藏末期的樣品中共純化得到41 株具有代表性菌株，分別為IA（12 株），VRBGA（11 株），CFC（8 株），2216E（4 株），MRS（3 株），STAA（3 株）。在這41 株菌株中，數(shù)量較多的有希瓦氏菌（14 株）、腸桿菌（6 株）和檸檬酸桿菌（Citrobacter，6 株），此外還有4 株被鑒定為假單胞菌，2 株被鑒定為葡萄球菌 （Staphylococcus saprophyticus），2 株被鑒定為熱死環(huán)絲菌 （Brochothrix thermosphacta），2株嗜冷桿菌，變形桿菌（Proteus vulgaris）、伽馬變形桿菌、發(fā)光桿菌、勒克斯菌（Leclercia adecarboxylata）、穩(wěn)桿菌各1 株。希瓦氏菌是一種嗜冷菌，它可以還原水產(chǎn)中的氧化三甲胺為三甲胺，此外還可以將含硫的氨基酸降解成揮發(fā)性的硫化氫。三甲胺和硫化氫都是具有魚腥惡臭的代謝產(chǎn)物，與水產(chǎn)腐敗臭味密切相關(guān)，許多學(xué)者將希瓦氏菌認(rèn)定為水產(chǎn)品在低溫貯藏條件下的主要腐敗微生物[26-28]。腸桿菌是一類常見的兼性厭氧革蘭氏陰性菌，某些腸桿菌具有致病性，尤其對(duì)抵抗力差的人群，更容易受其感染而患病[29]。檸檬酸桿菌可以分泌胞外酶，這些酶具有降解組氨酸成組胺的能力，非常容易導(dǎo)致人體出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)[30-31]。希瓦氏菌、腸桿菌和檸檬酸桿菌所占的比例分別為34.15%，14.63%和14.63%，其它菌株的占比均小于10%。這說(shuō)明希瓦氏菌、腸桿菌和檸檬酸桿菌是腐敗樣品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。為研究這3 類細(xì)菌在鮐魚腐敗過(guò)程中所發(fā)揮的作用，后續(xù)試驗(yàn)以這3種細(xì)菌的不同組合接種于滅菌魚塊上，并以沒(méi)接種細(xì)菌的滅菌魚塊為對(duì)照，以魚塊中揮發(fā)性鹽基氮、三甲胺、組胺和菌落總數(shù)為指標(biāo)，研究這3 種細(xì)菌在鮐魚腐敗過(guò)程中的致腐能力。具體分組為第1 組、第2 組、第3 組分別接種希瓦氏菌、腸桿菌、檸檬酸桿菌，第4 組、第5 組、第6 組分別接種等量的希瓦氏菌和腸桿菌、希瓦氏菌和檸檬酸桿菌、腸桿菌和檸檬酸桿菌，第7 組接種等量的希瓦氏菌、腸桿菌和檸檬酸桿菌，第8 組為空白對(duì)照組。

2.4 優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐能力的測(cè)定

2.4.1 TVB-N 揮發(fā)性鹽基氮是由細(xì)菌分泌的內(nèi)源性蛋白酶降解樣品中蛋白所產(chǎn)生的一種含氮堿性物質(zhì)，是評(píng)判水產(chǎn)腐敗的重要指標(biāo)[32]。新鮮的水產(chǎn)中揮發(fā)性鹽基氮的含量很低，在腐敗進(jìn)程中，其含量會(huì)不斷上升，30 mg/100 g 通常被認(rèn)定為可食用上限[32-33]。接種不同腐敗菌的魚塊中的揮發(fā)性鹽基氮隨時(shí)間的變化如圖3a 所示。揮發(fā)性鹽基氮的初始值為10.58 mg/100 g，表明原料新鮮，品質(zhì)好。各試驗(yàn)組中的TVB-N 含量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，比較第1，2，3 組，第1 組的增量最多，貯藏結(jié)束時(shí)TVB-N 值為50.21 mg/100 g，TVB-N 含量在第2組和第3 組中的增加速度很慢，貯藏結(jié)束也未超過(guò)30 mg/100 g。比較第4，5，6，7 組，第6 組的TVB-N 含量顯著低于其它3 組，貯藏結(jié)束時(shí)TVB-N 含量也沒(méi)有超過(guò)可接受上限，其它3 組在第0～6 天時(shí)，增加緩慢，之后增加速度加快，在第9 天超過(guò)了30 mg/100 g。整個(gè)貯藏過(guò)程中對(duì)照組的TVB-N 含量最低，貯藏結(jié)束仍未超過(guò)可接受限量。從結(jié)果可以看出，接種了希瓦氏菌的樣品中揮發(fā)性鹽基氮的增加顯著高于未接種希瓦氏菌的樣品組，結(jié)果表明希瓦氏菌對(duì)于揮發(fā)性鹽基氮的貢獻(xiàn)大于腸桿菌和檸檬酸桿菌。

2.4.2 三甲胺 三甲胺是評(píng)價(jià)海水魚鮮度的另一項(xiàng)常用指標(biāo)，它的產(chǎn)生是由于微生物代謝產(chǎn)生的還原酶對(duì)氧化三甲胺的還原作用。三甲胺在不同魚中的限量值略有不同，在多數(shù)的多脂性魚類中的限量標(biāo)準(zhǔn)不超過(guò)5 mg/100 g，其它魚類的標(biāo)準(zhǔn)通常介于5～10 mg/100 g 之間[34]。接種不同菌株的魚塊中三甲胺的含量隨貯藏時(shí)間的變化如圖3b 所示。比較第1，2，3 組，第1 組中三甲胺的含量最高，貯藏結(jié)束后達(dá)20.15 mg/100 g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了限量值，第2 組和第3 組的三甲胺含量增加緩慢，貯藏結(jié)束時(shí)分別為9.11，5.59 mg/100 g。比較第4，5，6，7 組，第6 組的增加量要顯著低于其它3 組，貯藏結(jié)束為8.51 mg/100 g，其它組的三甲胺含量均超過(guò)了20 mg/100 g。

菌菌菌菌菌菌桿菌桿桿桿菌桿菌形菌菌菌菌菌桿腸菌桿腸菌桿腸菌桿腸菌桿腸菌桿腸酸檬檸桿形變酸檬檸酸檬檸酸檬檸桿冷嗜酸檬檸桿冷嗜變馬伽胞單假胞單假桿光發(fā)氏瓦希果結(jié)定鑒16S rDNA的種菌中品樣天12第和天6、第天0第藏貯2表th day sample th day sample and the 12，the 6 16S rDNA gene analysis results of the bacteria in the fresh sample Table 2 果結(jié)定鑒12 d基養(yǎng)培果結(jié)定鑒6 d基養(yǎng)培果結(jié)定鑒0 d基養(yǎng)培VRBGA Enterobacter sp.菌桿冷嗜VRBGA Psychrobacter sp.菌桿冷嗜VRBGA Psychrobacter sp.Enterobacter sp.菌桿冷嗜Psychrobacter sp.菌桿冷嗜Psychrobacter marincola Enterobacter sp.菌桿冷嗜Psychrobacter sp.菌桿孢芽類Paenibacillus sp.Enterobacter sp.菌桿腸Enterobacter sp.菌桿冷嗜Psychrobacter sp.2216E Enterobacter sp.菌桿腸Enterobacter sp.菌桿冷嗜Psychrobacter sp.Enterobacter sp.菌桿短Brevibacterium sp.菌桿冷嗜Psychrobacter immobilis Citrobacter sp.菌桿冷嗜Psychrobacter faecalis 2216E菌桿冷嗜Psychrobacter sp.Proteus vulgaris菌桿冷嗜Psychrobacter sp.菌形變馬伽Oceanisphaera sp.Citrobacter sp.菌桿冷嗜Psychrobacter sp.菌胞單假Pseudomonas sp.CFC Citrobacter sp.菌形變馬伽Oceanisphaera sp.菌胞單假Pseudoalteromonas tetraodonis Citrobacter sp.菌胞單假Pseudomonas sp.菌形變馬伽Oceanisphaera sp.Psychrobacter faecalis 2216E菌胞單假Pseudomonas sp.CFC菌胞單假Pseudomonas sp.Citrobacter sp.菌胞單假Pseudoalteromonas tetraodonis Psychrobacter sp.菌胞單假Pseudomonas sp.Oceanisphaera sp.菌胞單假Pseudomonas sp.Pseudomonas sp.CFC菌氏瓦希Shewanella sp.Pseudoalteromonas tetraodonis菌胞單假Pseudomonas sp.Photobacterium phosphoreum菌胞單假Pseudomonas fragi Shewanella sp.菌胞單假Pseudomonas fluorescens菌胞單假Pseudomonas sp.

菌菌菌菌菌菌菌菌菌菌菌菌桿菌菌菌菌菌菌菌菌菌絲絲氏瓦希胞單假胞單假氏瓦希氏瓦希氏瓦希氏瓦希氏瓦希氏瓦希酸檬檸氏瓦希氏瓦希氏瓦希氏瓦希氏瓦希氏瓦希球萄葡球萄葡斯克勒環(huán)死熱環(huán)死熱菌桿穩(wěn)果結(jié)定鑒12 d Shewanella sp.Pseudomonas sp.Pseudomonas fragi Shewanella sp.Shewanella sp.Shewanella sp.Shewanella putrefaciens Shewanella putrefaciens Shewanella sp.Citrobacter sp.Shewanella sp.Shewanella sp.Shewanella sp.Shewanella sp.Shewanella sp.Shewanella sp.Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus saprophyticus Leclercia adecarboxylata Brochothrix thermosphacta Brochothrix thermosphacta Empedobacter falsenii基養(yǎng)培IA MRS STAA菌菌菌菌菌菌菌菌菌胞單假桿光發(fā)氏瓦希氏瓦希氏瓦希氏瓦希氏瓦希胞單假胞單假菌桿穩(wěn)果結(jié)定鑒6 d Pseudomonas sp.Photobacterium phosphoreum Shewanella sp.Shewanella sp.Shewanella putrefaciens Shewanella putrefaciens Shewanella sp.Pseudomonas sp.Pseudomonas sp.Empedobacter falsenii IA MRS STAA基養(yǎng)培果結(jié)定鑒0 d）2表（續(xù)基養(yǎng)培

2.4.3 組胺 組胺是一種化學(xué)性毒素，是鯖科魚類發(fā)生中毒事件的主要因素。組胺在新鮮的魚體中含量很低，然而如果在貯藏過(guò)程中操作不當(dāng)，產(chǎn)組胺微生物會(huì)快速繁殖，魚體內(nèi)的組氨酸會(huì)在組氨酸脫羧酶的作用下降解成組胺[35]。鮐魚是典型的鯖科魚類，其肌肉中組氨酸的含量處于較高水平，由于誤食造成的組胺中毒事件常發(fā)。因此，對(duì)于鮐魚體內(nèi)組胺積累情況的監(jiān)測(cè)十分必要。接種不同菌種鮐魚塊中組胺含量隨貯藏時(shí)間的變化如圖3c 所示。鮐魚原料中的組胺含量很低，僅有6.52 mg/kg，遠(yuǎn)低于FDA 規(guī)定的50 mg/kg 的限量[36]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組中組胺的含量均呈增加趨勢(shì)。比較第1，2，3 組，第3 組中組胺的增量最多，貯藏結(jié)束時(shí)含量高達(dá)100.33 mg/kg，第1 組和第2 組中組胺含量增加緩慢，貯藏結(jié)束時(shí)，仍低于50 mg/kg。比較第4，5，6，7 組，第4 組中組胺含量增加最少，貯藏結(jié)束時(shí)含量?jī)H為32.57 mg/kg，其它3 組均快速增加，貯藏結(jié)束時(shí)的含量分別達(dá)到79.31，86.12，80.62 mg/kg。對(duì)照組中組胺的含量在整個(gè)貯藏過(guò)程中始終處于較低水平，貯藏結(jié)束時(shí)的含量?jī)H為15.22 mg/kg。對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)接種檸檬酸桿菌的樣品，其組胺含量要顯著高于未接種檸檬酸桿菌的樣品，說(shuō)明檸檬酸桿菌是鮐魚中典型產(chǎn)組胺菌，與組胺的產(chǎn)生密切相關(guān)。

2.4.4 菌落總數(shù) 滅菌魚塊接種不同菌株后的菌落總數(shù)隨時(shí)間的變化如圖3d 所示。魚塊中菌落總數(shù)的初始值為0.7 lg（CFU/g），符合滅菌魚塊的標(biāo)準(zhǔn)[18]。第1 組中菌落總數(shù)增加迅速，并在第6 天超過(guò)了6 lg（CFU/g），貯藏結(jié)束時(shí)達(dá)到8.8 lg（CFU/g），對(duì)照組的菌落總數(shù)始終維持在較低水平，且變化不大。其它幾組菌落總數(shù)介于第1 組和對(duì)照組之間。致腐能力試驗(yàn)結(jié)果表明，希瓦氏菌在鮐魚腐敗過(guò)程中揮發(fā)性鹽基氮和三甲胺的積累方面起到了主要的作用，而檸檬酸桿菌則與組胺的產(chǎn)量具有更加緊密的關(guān)聯(lián)，兩者都有可能是鮐魚冷海水貯藏的特定腐敗菌。然而，根據(jù)課題組先前研究，發(fā)現(xiàn)鮐魚冷海水貯藏過(guò)程中的組胺含量始終在較低水平，因此，產(chǎn)組胺菌對(duì)冷海水貯藏下鮐魚的品質(zhì)影響較小，此外，接種過(guò)檸檬酸桿菌的魚塊中的菌落總數(shù)遠(yuǎn)低于特定腐敗菌的標(biāo)準(zhǔn)，這些結(jié)果都表明將檸檬酸桿菌作為鮐魚冷海水貯藏的特定腐敗菌是不合適的。因此，研究認(rèn)定希瓦氏菌為鮐魚冷海水貯藏的特定腐敗菌。

圖3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的致腐能力測(cè)定Fig.3 Spoilage potential test of the spoilage bacteria

3 結(jié)論

本文通過(guò)選擇性培養(yǎng)基和16S rDNA 序列分析法，對(duì)鮐魚冷海水貯藏期間的菌相組成和變化進(jìn)行研究，并通過(guò)對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐能力的測(cè)定，確定了鮐魚冷海水貯藏的特定腐敗菌。結(jié)果表明，鮐魚冷海水貯藏期間的主要菌相組成由嗜冷桿菌變?yōu)榧賳伟俚较Ｍ呤暇?。通過(guò)對(duì)腐敗樣品中菌相組成的分析，得出鮐魚冷海水保鮮下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為希瓦氏菌、腸桿菌和檸檬酸桿菌。通過(guò)致腐能力分析表明，希瓦氏菌具有較強(qiáng)的致腐能力，被認(rèn)定為鮐魚冷海水貯藏下的特定腐敗菌。