水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的結構與功能分析

李秋瑩，徐瑾秀，朱金帥，林 洪，孫 彤，勵建榮*

（1 渤海大學食品科學與工程學院 遼寧錦州121013 2 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 3 中國海洋大學食品科學與工程學院 山東青島266100）

水產(chǎn)品口感鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費者的喜愛，然而，水產(chǎn)品極易腐敗變質，造成巨大的經(jīng)濟損失。由于微生物的生長和入侵是導致水產(chǎn)品腐敗的主要因素[1]，因此水產(chǎn)品的保鮮過程中對微生物的抑制十分重要。低溫保鮮技術是使用最早，也是應用最廣的水產(chǎn)品保鮮技術[2]。低溫會使微生物的生理機能發(fā)生重要的變化，比如膜流動性降低，核酸二級結構穩(wěn)定性增強，轉錄、翻譯及蛋白折疊的效率降低等[3]。在低溫下有些微生物仍能以一定的生長速率生長，即使生長較慢。腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是一種耐冷菌，在0 ℃下也能生長、繁殖，其在有氧冷凍或冷藏狀態(tài)下是多種水產(chǎn)品的特定腐敗菌[4]，引起冷藏水產(chǎn)品的腐敗變質，這嚴重降低了水產(chǎn)品的品質，極有可能導致食品安全問題。鑒于水產(chǎn)品保鮮的重要經(jīng)濟價值，深入了解腐敗希瓦氏菌低溫適應的分子機制，可以輔助預測腐敗菌在冷藏食品中的行為，便于進行更準確的風險預測和防范。

研究發(fā)現(xiàn)，微生物在低溫作用下會產(chǎn)生冷應激反應，生成一系列的抗低溫蛋白，稱為冷激蛋白（Cold shock protein，CSPs）[5]。細菌冷激蛋白是一類包含核酸結合冷休克結構域的高度保守的小分子蛋白（～7.4 ku），可以作為分子伴侶與單鏈DNA或單鏈RNA 結合，阻止DNA 或RNA 在低溫下形成二級結構，從而促進轉錄和翻譯[6]。此外，冷激蛋白還參與細菌的多個生理生化過程，如：細胞膜的流動性，細菌正常生長與分化，營養(yǎng)脅迫，細菌的毒力等。冷激蛋白對細菌在低溫時恢復生長和發(fā)揮細胞各種功能是非常重要的[7-9]，是解析微生物低溫適應機制的關鍵蛋白。然而，目前關于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的研究鮮有報道。

細菌通常具有多個冷激蛋白，且冷激蛋白的作用規(guī)律十分復雜，并非所有冷激蛋白都受低溫誘導表達[10]。通過對NCBI（National center for biotechnology information）數(shù)據(jù)庫中腐敗希瓦氏菌模式菌株的全基因組序列檢索，發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌中存在3 個典型冷激蛋白，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關其主要冷激蛋白及相關功能的研究。本文以水產(chǎn)品的腐敗希瓦氏菌為研究對象，通過PCR 擴增獲得水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3 個冷激蛋白基因序列，在此基礎上通過生物信息學分析腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的理化性質、結構和功能特性等，旨在為冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌低溫適應過程中的功能研究，以及對水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌的抑制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌為本實驗室自腐敗的冷藏大菱鲆中分離所得，于-80 ℃保藏。聚合酶鏈式反應（Polemerase chain reaction，PCR）引物委托生工生物工程（上海）技術服務有限公司合成。EasyTaqRDNA Polymerase，北京全是金生物技術有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、GeneRed 核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司；Biowest 瓊脂糖、LB 營養(yǎng)瓊脂、LB 營養(yǎng)肉湯，青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

防蒸發(fā)梯度PCR，美國Eppendrof 公司；凝膠電泳及配套設備，美國Bio-Bad 公司；微量冷凍離心機，美國Thermo 公司。

1.3 菌種鑒定及冷激蛋白基因的克隆與測序

活化本實驗室保藏的腐敗希瓦氏菌，按照基因組DNA 提取試劑盒的操作步驟提取基因組DNA，利用細菌16S rRNA 基因通用引物27F 和1492R 進行PCR 擴增，獲得腐敗希瓦氏菌的16S rRNA 基因（表1）[11]。采用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 檢索近緣腐敗希瓦氏菌菌株基因組信息（GenBank：CP002457.1），依據(jù)注釋冷激蛋白基因及其上、下游序列，設計引物（表1），進行冷激蛋白的Csp1589，Csp1376 和Csp2252 基因的擴增。PCR 擴增條件為94 ℃5 min；94 ℃30 s，Tm℃30 s（詳見表1），72 ℃45 s，循環(huán)30 次。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工測序。

表1 菌種鑒定及冷激蛋白基因擴增的引物Table 1 Primers of strain identification and cold shock protein gene amplification

1.4 系統(tǒng)發(fā)生樹的構建

自NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得大腸桿菌（NC_000913.3）的9 個冷激蛋白（CspA～I），以FASTA file 形式保存。通過軟件Clustal X 對測序所得腐敗希瓦氏菌冷激蛋白和大腸桿菌的冷激蛋白進行序列比對，并用Mega7.0 中的鄰接法 （Neighbor-jioning method，NJ）為其構建系統(tǒng)發(fā)生樹，步長值（Bootstrap values）為1 000[12]。

1.5 冷激蛋白的理化性質及結構域的預測

用ExPASy 網(wǎng)站中的一個工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）來預測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的基本生理、生化特征，用PSORT www Server 中的PSORT Prediction 工具預測冷激蛋白細胞定位，用TMHMM Server 2.0 預測冷激蛋白跨膜區(qū)域，用SignalIP 5.0 在線預測冷激蛋白信號肽，用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預測冷激蛋白結構域的構成及其功能，用在線軟件NCBI Conserved Domain Search 進行其氨基酸保守序列分析。

1.6 結構預測與模型質量評估

使 用PSIPRED （http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/） 預測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的二級結構。將腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）網(wǎng)站進行三級結構的預測[13]。將構建的蛋白三級模型用PROCHECK 和Verify3D 進行質量評估[14-16]。PROCHECK 和Verify3D 是SAVES v5.0（http：//servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/）中的結構評估服務。

1.7 互作蛋白及配體結合位點的預測

用STRING（https：//string-db.org/）工具確定在活體內與腐敗希瓦氏菌冷激蛋白存在相互作用的蛋白。這種相互作用既包括蛋白質之間直接的物理相互作用，也包括蛋白質之間間接的功能相關性[17]。將從SWISS-MODEL 得到的模型文件輸入COACH （https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/COACH/），以預測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白潛在的配體結合位點[18-19]。

2 結果與分析

2.1 冷激蛋白基因的克隆

通過16S 測序結果的比對分析確定該菌為腐敗希瓦氏菌。以這株水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的基因組DNA 為模板，用相應引物對冷激蛋白基因進行PCR 擴增，然后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物[19]，結果如圖1所示。PCR 擴增產(chǎn)物的長度在500 bp 左右，與預期的產(chǎn)物大小相符。將PCR 產(chǎn)物送至上海生工測序，并將測序序列用ORF Finder 軟件和Blast 分析。使用ORF Finder軟件的結果表明，克隆的基因片段都有完整的開放閱讀框 （ORF），3 個冷激蛋白基因Csp1589，Csp1376 和Csp2252 的ORF 長度分別為210，210，207 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，分別編碼69，69，68 個氨基酸。Blast 結果表明，水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3 個冷激蛋白基因與腐敗希瓦氏菌模式菌株的3 個冷激蛋白基因的序列相似性均達100%，說明冷激蛋白高度保守。

2.2 系統(tǒng)發(fā)生樹的構建

使用MEGA 7.0 軟件構建腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌的冷激蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹，結果如圖2所示。水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp1589 和Csp1376 與大腸桿菌的冷激蛋白基因CspA 聚類在同一類群，表明它們之間的有較高的相似性和較近的親緣關系。大腸桿菌CspA 為主要的冷誘導蛋白，低溫下大量表達[7，20-21]。初步推測Csp1589 和Csp1376 在腐敗希瓦氏菌對低溫脅迫的適應中起關鍵作用。腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp2252 與大腸桿菌的冷激蛋白基因CspD位于同一分枝，大腸桿菌CspD 在營養(yǎng)缺乏時大量表達并能結合單鏈DNA，從而抑制染色體的復制[22]，因此腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp2252可能與細胞生長分化有關。

2.3 冷激蛋白的理化特點

圖1 冷激蛋白基因PCR 擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR amplification products of CSPs genes

圖2 冷激蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic analysis of the CSPs

利用ProtParam 預測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的基本生理、生化特征，結果見表2。預測的腐敗希瓦氏菌冷激蛋白是由68～69 個氨基酸殘基構成，分子質量在7.4 ku 左右的小分子蛋白，且其帶負電荷的氨基酸的量大于帶正電荷氨基酸的量，即酸性氨基酸的量大于堿性氨基酸的量，PI 小于7，說明這些蛋白質都是酸性蛋白質，符合CSPs 的特點[23-24]。蛋白質的總平均親水性為負數(shù)，說明測定的蛋白皆為親水性蛋白[25]。由不穩(wěn)定系數(shù)可知，除Csp2252 外，蛋白質在體外的穩(wěn)定性都較好，在大腸桿菌體內的半衰期大于10 h。PSORT 預測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白皆定位于細胞質。TMHMM預測結果顯示腐敗希瓦氏菌冷激蛋白均不存在α螺旋跨膜，是非跨膜蛋白。SignalIP 預測結果表明腐敗希瓦氏菌冷激蛋白不存在信號肽，不能分泌到胞外。推測腐敗希瓦氏菌的3 個冷激蛋白均為非分泌型、非跨膜蛋白，冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌細胞質中合成后不進行蛋白轉運，而是保留在細胞基質中發(fā)揮作用。

表2 冷激蛋白的理化性質分析Table 2 Analysis of the psysicochemical property of the CSPs

2.4 冷激蛋白的氨基酸保守序列及結構域分析

將腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交至CD service，檢測結果顯示：腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白Csp1589、Csp1376 和Csp2252 都具有DNA 結合位點和RNA 結合基序，且同屬于類S1總科。類S1 總科是一類包含與核糖體蛋白S1 的RNA 結合結構域相似的結構域的蛋白合集[26]。這種結構最初在S1 核糖體蛋白中被發(fā)現(xiàn)，目前已在多種RNA 相關蛋白中被發(fā)現(xiàn)。SMART 預測結果表明：腐敗希瓦氏菌的3 個冷激蛋白都包含冷休克結構域（Cold shock domain，CSD），冷休克結構域屬于類S1 總科這個超級家族，且其從原核生物到高等真核生物高度保守，具有RNA 分子伴侶功能[27-28]。包含冷休克結構域的蛋白可以參與多種細胞生理生化過程，包括對低溫的適應、營養(yǎng)脅迫、細胞生長和發(fā)育過程等[29]。此外，由圖3可知腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白Csp1589 和Csp1376 屬于保守蛋白結構域家族CspC，是冷誘導蛋白，因此推測Csp1589 和Csp1376 與細菌對低溫的適應性有關；而腐敗希瓦氏菌Csp2252 不屬于CspC 家族，其可能參與其它的細胞過程，這個結果與上述系統(tǒng)發(fā)生樹的結果一致。

圖3 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸保守序列Fig.3 Amino acid conserved sequence of S.putrefaciens CSPs

2.5 冷激蛋白的結構分析

為更好了解冷激蛋白潛在的生物功能，分析其蛋白的空間結構。將水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交到PSIPRED 預測其二級結構，結果見圖4。典型的冷激蛋白的二級結構包含5 個β 折疊[24]，預測得到的二級結構與這個結果大致相符，Csp1589 和Csp1376 二級結構的最后一個β 折疊出現(xiàn)斷層，這可能是天冬酰胺預測可信度太低所致。

圖4 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的二級結構Fig.4 Secondary structure of S.putrefaciens CSPs

圖5 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的三級結構及結構評估Fig.5 Tertiary structure and structure assessment of S.putrefaciens CSPs

將冷激蛋白的氨基酸序列提交SWISS-MODEL 網(wǎng)站，根據(jù)序列相似性及模型質量分別選取1mjc 的A 鏈、5xv9 的A 鏈、3i2z 的B 鏈作為Csp1589、Csp1376 和Csp2252 的模板建模。然后，用PROCHECK 和verify3D 對所建三級模型進行質量評估。構建的腐敗希瓦氏菌冷激蛋白三級結構都包含5 個反向平行的β 鏈，其形成了一個桶狀結構，符合冷激蛋白的已知特征[24]。由拉氏構象圖可看出，對于Csp1589 蛋白模型，氨基酸處于有利區(qū)域、額外允許區(qū)域、一般允許區(qū)域以及不允許區(qū)域的量分別為88.9%，11.1%，0%和0%。對于Csp1376 型蛋白模型，對應值分別為92.7%，7.3%，0.0%和0.0%。對于Csp2252 型蛋白模型，對應值分別為96.1%，3.9%，0.0%和0.0%，氨基酸全部處于有利區(qū)域和額外允許區(qū)域，模型質量較好。在Verify3D 結果中，對于Csp1589、Csp1376 和Csp2252 模型，平均分≥0.2 的氨基酸的量分別是和100%，89.86%和100%，平均分≥0.2 的氨基酸的量達到80%就認為蛋白三級模型是合格的，因此，以verify3D 結果來看，這3 個模型均具有較好的質量。

2.6 冷激蛋白的互作蛋白及配體結合位點分析

利用STRING 和COACH 網(wǎng)站對腐敗希瓦氏菌冷激蛋白進行分析，得到如圖6所示與其緊密作用的蛋白質和潛在的配體結合位點。對于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白 Csp1589、Csp1376 和Csp2252，STRING 分別檢測到5，4，10 個與其相互作用的蛋白（圖6）。與冷激蛋白Csp1589 存在相互作用的蛋白是組氨酸激酶（ABP76854.1）、甲基轉移酶（ABP75296.1）、DNA 聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、伴侶蛋白（htpG）。與冷激蛋白Csp1376 存在相互作用的蛋白是組氨酸激酶（ABP76854.1）、DNA 聚合酶1（polA）、多功能融合蛋 白（trpC）、伴 侶 蛋 白（htpG）。與 冷 激 蛋 白Csp2252 存在相互作用的蛋白是依賴ATP 的Clp蛋白酶（ABP75948.1）、依賴ATP 的Clp 蛋白酶適配蛋白（ClpS）、組氨酸激酶（ABP76854.1）、DNA聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、組氨酸-磷酸氨基轉移酶（hisC）、磷酸庚糖異構酶（gmhA）、含有CBS 結構域的蛋白（ABP76571.1）、氮調控蛋白PtsN（ABP74443.1）、伴侶蛋白（htpG）。其中組氨酸激酶是一個磷酸化組氨酸保守殘基的信號傳導酶家族，參與構成雙組分信號傳導系統(tǒng)。雙組分信號傳導系統(tǒng)可以感應環(huán)境變化，應對環(huán)境變化引起的負面效應[30]，研究表明一些雙組分信號轉導系統(tǒng)參與了細菌的低溫適應過程[10]，推測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白與細胞對逆境的適應有關。DNA聚合酶是DNA 復制的重要酶，冷激蛋白可能與DNA 復制有關。冷激蛋白作為一種伴侶蛋白，可能與伴侶蛋白htpG 存在競爭關系。從分析結果可推測相較Csp1589 和Csp1376，腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp2252 的功能可能更為復雜。在許多重要的生命活動中，蛋白質功能的執(zhí)行依賴于蛋白質與配體的相互作用，對于蛋白質配體結合位點的預測具有重要的意義[31]。例如：把小分子放到目的蛋白的配體結合位點，優(yōu)化配體構象和位置，使之和目的蛋白有最佳的結合作用，就有可能發(fā)現(xiàn)抑制該蛋白的化合物。對于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589、Csp1376 和Csp2252，其分別預測到2，2，1 個可能性較高的配體結合位點（圖6）。

圖6 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的互作蛋白及其潛在的配體結合位點Fig.6 Protein and protein interaction and potential ligand binding site of S.putrefaciens CSPs

3 結論

冷激蛋白是解析細菌低溫適應的關鍵蛋白之一。本研究成功擴增了水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3個冷激蛋白基因，并對其進行生物信息學分析，獲得蛋白理化性質、結構和功能方面的相關進展。腐敗希瓦氏菌冷激蛋白均為親水的小分子酸性蛋白質，皆位于細胞質，為非分泌型、非跨膜蛋白，都存在冷激蛋白特有的冷休克結構域，存在DNA 結合位點和RNA 結合基序（motif），能與單鏈DNA 和單鏈RNA 結合。腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589和Csp1376 與大腸桿菌冷激蛋白CspA 親緣關系較近，可能在腐敗希瓦氏菌低溫適應過程中起重要作用。冷激蛋白的二級結構和三級結構均符合冷激蛋白家族的特征，其可靠的三級模型可用于各種對接和藥物靶向研究。通過蛋白互作和配體結合位點的分析，對其功能有更深的了解，為后續(xù)驗證冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌低溫適應過程中的功能，以及水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌冷激蛋白抑制劑的篩選奠定基礎。