綿羊葡萄球菌的分離鑒定

李仕林，王雅雯，姜水兵，郭良帥，努爾麥麥提·麥麥提敏，王新新，焦海宏

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

葡萄球菌在自然界中分布極廣、種類繁多，分為非致病菌和致病菌。葡萄球菌可引起化膿性感染，是引起綿羊發(fā)病的病原菌之一。近年來，獸醫(yī)臨床上主要使用抗生素治療畜禽疾病，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性加重，中草藥具有不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)。甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、止咳祛痰等多種功效[1]。甘草對(duì)葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等細(xì)菌有明顯的抑制作用[2]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，甘草具有鎮(zhèn)咳祛痰、有抗癌、抗炎、抗氧化、抗過敏、治療艾滋病、防治肝損害、抗心律失常、皮質(zhì)激素樣、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3-4]。王曉利等[5]用甘草甜酸、甘草多糖、光甘草對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的毒性與免疫功能調(diào)節(jié)進(jìn)行試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)甘草甜酸、甘草多糖、光甘草均能增加巨噬細(xì)胞的吞噬能力。甘草黃酮類化合物可抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡[5-6]對(duì)各種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用。Yu等[7]從光果甘草黃酮類中提取出生松素，表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化能力及亞硝酸鹽清除能力。張敏[8]研究表明，甘草總黃酮可能是通過對(duì)突觸可塑性關(guān)鍵蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)而發(fā)揮抗抑郁作用的。研究中草藥藥理作用對(duì)開發(fā)新藥有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從新疆地區(qū)某規(guī)?；驁?chǎng)無菌采集患病綿羊鼻拭子20份，4 ℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；5%綿羊血平板（自制）；細(xì)菌基因DNA 提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；細(xì)菌16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；麥?zhǔn)媳葷峁苜?gòu)自常德比克曼生物科技有限公司。1%PBS、1%結(jié)晶紫、3%過氧化氫、5%綿羊血清、兔血漿等試劑。新霉素（30 μL/片）、氯霉素（30 μL/片）、諾氟沙 星（10 μL/片）、環(huán) 丙 沙 星（5 μL/片）、羅紅 霉 素（15 μL/片）、頭孢曲松（30 μL/片）、頭孢哌酮（75 μL/片）均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。甘草購(gòu)自新疆阿拉爾市郭森中藥房。

1.3 試驗(yàn)儀器

DHP-9080 型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、101-1ES電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、ZWY-240 臺(tái)式恒溫?fù)u床（上海智城儀器有限公司）、BL-75A 型立式壓力蒸汽滅菌氣筒（上海東亞壓力容器制造有限公司）、H-1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 葡萄球菌分離培養(yǎng)

制備TSB 培養(yǎng)基、TSA 培養(yǎng)基，將樣品接種于TSA 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，革蘭氏染色鏡檢，將疑似菌接種于TSB培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)6～8 h，進(jìn)一步接種于5%綿羊鮮血平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h培養(yǎng)，觀察菌落特征。

1.4.2 革蘭氏染色及鏡檢

挑取單個(gè)疑似葡萄球菌菌落或溶血菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.4.3 生化試驗(yàn)

試驗(yàn)采用過氧化氫酶、兔血漿凝固酶試驗(yàn)。

1.4.4 16S rRNA基因擴(kuò)增

根據(jù)細(xì)菌DNA 提取試劑盒說明書，進(jìn)行菌體DNA 提取，進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，1492R：TACGGCTACCTTG TTACGACTT，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，目的片段大小1500 bp 左右。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5min，(94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán))，72 ℃延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast對(duì)照，確定菌種。

1.4.5 藥敏試驗(yàn)

取活化菌液適量，用生理鹽水稀釋至1.5×108CFU/mL 均勻涂布于BHI 固體培養(yǎng)基，將各種抗菌藥物片貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈大小。依據(jù)參考文獻(xiàn)[8]確定判定標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥；直徑在10～15 mm為中度敏感；直徑大于15 mm以上為高度敏感。

1.4.6 甘草抑菌試驗(yàn)

1.4.6.1 水煮法制備藥液

將甘草稱重加入8～10 倍純凈水浸泡30～60 min，進(jìn)行煎煮，第1 次煎煮30 min，第2 次加入5 倍純凈水煎煮15 min，過濾；合并2次濾液，藥液終濃度為1 g/mL，離心取上清121 ℃高壓滅菌，4 ℃保存。

1.4.6.2 甘草水煎液對(duì)葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）

采用肉湯微量稀釋法進(jìn)行測(cè)定。向TSB 液體培養(yǎng)基（已滅菌）中加入1%葡萄糖、0.002%酚紅。取細(xì)菌瓶編號(hào)1～13，分別向1～10 瓶加入1 mLTSB 液體培養(yǎng)基；1 號(hào)瓶加入1 mL 甘草水煎液（含藥量1 g/mL）二倍稀釋至10 號(hào)瓶；11號(hào)瓶中加入2 mL TSB液體培養(yǎng)基做對(duì)照。將菌液用生理鹽水稀釋成1.5×106CFU/mL 菌液（麥?zhǔn)媳葷徇M(jìn)行比對(duì)），取1 mL稀釋的菌液與9 mL TSB液體培養(yǎng)基混合，稀釋成1.5×105CFU/mL 菌液向1～10 號(hào)細(xì)菌瓶中分別加入1 mL（1.5×105CFU/mL）菌 液；12 號(hào) 瓶 中 加 入2 mL（1.5×105CFU/mL）菌液；13號(hào)瓶中加入2 mL甘草水煎液（含藥量1 g/mL），37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)（重復(fù)3 次）。結(jié)果判定：以能夠抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng)藥物最高稀釋度為最低抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離培養(yǎng)結(jié)果（見圖1）

由圖1 可知，疑似菌菌落在血平板上呈白色、圓形菌落，周圍有溶血環(huán)。

圖1 菌株在血平板上的特征Fig.1 The characteristics of the strain on the blood plate

2.2 菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（見圖2）

由圖2 可知，革蘭氏染色鏡檢呈陽(yáng)性球菌，成葡萄串狀樣。

圖2 菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.2 Strain Gram staining microscopic examination results

2.3 菌株生化試驗(yàn)結(jié)果（見圖3、圖4）

圖3 過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of catalase test

由圖3、圖4 可知，過氧化氫酶試驗(yàn)有氣泡產(chǎn)生，呈陽(yáng)性；血漿凝固酶試驗(yàn)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，呈陽(yáng)性。

2.4 16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果（見圖5）

由圖5可知，經(jīng)初步分離鑒定，將純化菌株的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST對(duì)照，共鑒定出10株葡萄球菌，分別編號(hào)為nj1、nj2、nj3、nj4、nj5、nj6、nj7、nj8、nj9、nj10。

圖4 血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Result of plasma coagulase test

圖5 16S rRNA電泳圖譜Fig.516S rRNA electrophoretogram

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見表1）

由表1可知，葡萄球菌對(duì)卡那霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮、頭孢曲松高度敏感；對(duì)新霉素中度敏感；對(duì)羅紅霉素耐藥。

表1 各菌株藥敏試驗(yàn)的抑菌圈大小Tab.1 The size of the inhibition zone of each strain drug sensitivity test 單位：mm

2.6 甘草對(duì)葡萄球菌的抑菌作用

經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得甘草液對(duì)葡萄球菌的平均最小抑菌濃度（MIC）為0.5 g/mL，表明甘草對(duì)葡萄球菌具有抗菌活性。

3 討論

本次試驗(yàn)從病料中分離出葡萄球菌，與段龍川等[10]及裴志花等[11]從羊病料中分離的病原菌相同。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄球菌對(duì)頭孢曲松敏感。獸醫(yī)臨床治療中發(fā)現(xiàn)，由葡萄球引起的動(dòng)物疾病在抗生素治療過程中耐藥水平高、耐藥譜廣，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的損失。建議在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中明確病原情況，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出敏感抗生素，再進(jìn)行預(yù)防治療，從而減少抗生素濫用，減少獸藥殘留。

本試驗(yàn)測(cè)得甘草水煎液對(duì)葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.5 g/mL，對(duì)葡萄球菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。甘草酸是甘草中的主要活性物質(zhì)之一，對(duì)球菌和桿菌均有明顯的抑制作用[12]。因此推測(cè)本試驗(yàn)葡萄球菌的抑制作用可能是甘草酸所表現(xiàn)出的抑菌活性。因此，獸醫(yī)臨床上可用甘草對(duì)由葡萄球菌引起的動(dòng)物相關(guān)疾病進(jìn)行預(yù)防治療。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從病料中分離出10葡萄球菌。藥敏試驗(yàn)表明，葡萄球菌對(duì)卡那霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮、頭孢曲松敏感；對(duì)新霉素中度敏感；對(duì)羅紅霉素耐藥。試驗(yàn)測(cè)得甘草水煎液對(duì)葡萄球菌的平均最小抑菌濃度為0.5 g/mL，對(duì)葡萄球菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。